급성 및 만성 Ecotoxicity 청록색 송사리 Nothobranchius furzeri 의 테스트에 대 한 프로토콜

이 실험의 전반적인 목표는 청록색 송사리 Nothobranchius furzeri에 대한 독성 물질의 영향을 연구하는 것입니다. 이 방법은 성숙 시간, 성장 또는 번식력과 같은 중요한 생활사 특성에 대한 스트레스 요인의 장기적인 영향과 같은 생태 독성학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 실험의 가장 큰 장점은 매우 빠른 수명주기를 가진 척추 동물을 사용하여 시간과 비용 효율적인 실험을 할 수 있다는 것입니다.

이 송사리는 스트레스 요인의 장기적 및 다세대 효과의 영향을 연구하는 데 이상적인 모델입니다. 궁극적으로 독성 물질이 환경에 미치는 영향을 더 잘 이해하는 데 기여할 것입니다. 이 방법은 독성 물질과 온도의 결합된 영향에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있지만 자외선, 음식 부족 및 PH 변화와 같은 다른 스트레스 요인에도 적용할 수 있습니다.

송사리는 생태독성학의 새로운 모델 시스템이기 때문에 작업하기가 까다롭고, 많은 오염 물질에 대한 민감성은 아직 알려지지 않았습니다. 우리는 송사리의 수명이 매우 짧다는 것과 선반에 몇 년 동안 보관할 수 있는 휴면 알을 생산할 수 있는 능력에 대해 처음 알게 되었을 때 이 실험 방법에 대한 아이디어를 개발했습니다. 이 방법의 시각적 시연은 실험의 유형과 개인의 취급으로 인해 결과가 변경될 수 있으므로 매우 중요합니다.

시작하려면 황금빛 눈의 존재로 알아볼 수 있는 D3 단계에서 고나 레이 동물원 또는 GRZ 알을 선택하십시오. 그리고 부드러운 핀셋을 사용하여 플라스틱 2리터 탱크에 부드럽게 옮깁니다. 섭씨 12도에서 부화 매체 1cm를 추가하고 수온이 점차 실온으로 조정되도록합니다.

24시간 후, 갓 부화한 아르테미아 나우플리(artemia nauplii)를 농축량으로 먹이고 물고기 배지를 추가하여 수심을 5cm로 늘립니다.부화 후 48시간이 지나면 건강하고 부력이 있는 유충을 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 노출 매체 및 독성 물질 농도가 있는 개별 용기로 옮깁니다. 매일 아침과 저녁에 물고기의 폐사율, 스트레스 및 질병을 확인하고 텍스트 프로토콜에 따라 LC50 값을 계산합니다.

개별 용기에 올바른 노출 매체를 채워 만성 노출 시험을 수행하고 공기 튜브를 추가하여 용기를 폭기합니다. 실험의 나머지 부분 동안 물고기를 항아리에 옮깁니다. 부화 후 2일에서 23일 또는 DPH 후 23일까지 물고기 artemia nauplii에게 하루에 두 번 먹이를 줍니다.

그런 다음 37 DPH까지 다진 키로노무스 유충을 보충한 후 냉동 키로노무스 유충을 사용하여 하루에 두 번, 매일 물고기에게 자유롭게 먹이를 줍니다. 성장을 확인하려면 저수지의 배지로 채워진 페트리 접시에 물고기를 옮겨 매주 몸 크기를 측정하십시오. 고정된 높이에서 물고기의 크기를 보정한 등쪽 보기 사진을 4-5개 찍습니다.

그리고 공간 측정 프로그램을 사용하여 디지털 방식으로 분석하십시오. 15 DPH 부터는 수컷 물고기의 착색을 육안으로 검사하여 성숙도를 확인합니다. 지느러미에서 결혼 착색의 첫 징후가 있는지 확인하고, 주먹 착색이 보이는 날을 수컷 성숙 시간의 대용물로 사용하십시오.

30 DPH 이후부터는 수컷 수족관의 노출 매체를 사용하여 각 트리트먼트 내에서 성숙한 수컷과 암컷 커플을 위한 1리터의 산란 탱크를 설정하여 번식력을 확인하고 산란 기질로 보충합니다. 수컷과 암컷을 모두 산란 탱크로 옮깁니다. 그리고 산란 컨테이너 주변에서 인간의 활동이나 방해를 최소화하면서 2시간 동안 산란할 수 있도록 합니다.

그 후, 산란 기질에서 알을 소용돌이치게 할 물을 불필요하게 섞지 않고 물고기를 원래 수용 용기로 부드럽게 다시 옮깁니다. 500마이크로미터 메쉬 위에 산란 기질을 부어 알을 걸러냅니다. 알을 세고 피펫을 사용하여 페트리 접시의 축축한 이탄 이끼로 옮깁니다.

매일 죽은 난자를 제거하십시오. 일주일 후 밀봉 필름을 사용하여 페트리 접시를 밀봉합니다. 그리고 섭씨 28도의 온도 조절 인큐베이터에 14-10도의 밝은 온도에서 어두운 주기로 보관하면 D3 단계로 즉시 진행할 수 있습니다.

장기적인 보존을 위해 알을 섭씨 17도의 지속적인 어둠 속에 보관하면 알이 휴면 단계에 들어가고 수년 동안 생존할 수 있습니다. 휴면 중인 알에서 물고기를 모집하려면 알을 섭씨 28도로 옮기고 약 3주 동안 14-10도의 밝은 주기에서 어두운 주기로 옮겨 D3 단계로 발달할 수 있도록 합니다. 성어의 임계 최대 온도 또는 CT 최대치를 측정하려면 분당 섭씨 0.33도의 일정한 속도로 가열된 지속적으로 순환하는 수조로 시작합니다.

각 개별 물고기에 대해 여러 개의 1리터 수족관을 추가합니다. 물이 물고기의 실험적 사육 온도에 도달했을 때 수족관에 물고기를 추가하여 트레일을 시작하십시오. 디지털 온도계를 사용하여 CT max 수조의 1리터 수족관에서 5분마다 온도를 모니터링합니다.

물고기가 등쪽 배를 똑바로 세운 자세를 유지하지 못하거나 심하게 경련하기 시작하면 임계 최대 온도인 1리터 수족관의 온도를 측정합니다. 그런 다음 물고기를 회복을 위해 실험용 집으로 다시 옮깁니다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이, 다양한 농도의 구리에 대한 enfurzeri의 급성 노출은 독성 물질 농도가 증가함에 따라 사망률을 증가시켰습니다.

LC50 값은 시간이 지남에 따라 감소하며, 이는 농도가 감소함에 따라 반복물의 50%가 죽기까지 더 많은 시간이 경과한다는 것을 의미합니다. 수성 구리를 사용하는 만성 노출 분석에서 물고기는 테스트된 최고 농도에서 사육되었을 때 3주 후에 측정된 바와 같이 길이가 더 짧습니다. 수인성 클로르피리포스(CPH)를 사용한 이 실험에서, 섭씨 28도에서 사육했을 때 물고기는 가장 높은 CPF 농도에 노출되었을 때 더 적은 알을 낳았지만, 섭씨 30도에서 대조군 물고기는 CPF 농도에 노출된 물고기보다 더 많은 알을 낳았으며, 이는 CPF와 온도 상승의 조합이 각 스트레스 요인을 개별적으로 갖는 것보다 생식력에 더 많은 영향을 미쳤음을 나타냅니다.

여기에 보고된 것은 섭씨 28도와 30도에서 CPF에 노출된 enfurzeri 수컷에서 착색의 첫 징후가 나타난 평균 연령입니다. CPF 1리터당 4마이크로그램에 노출된 후, 수컷 물고기는 대조군 물고기보다 성숙하는 데 18% 더 오래 걸렸습니다. 섭씨 24도 또는 28도에서 사육된 물고기의 CT max를 측정하고 오염 물질 3, 4-DCA에 노출된 결과, 물고기가 섭씨 24도에서 사육될 때 더 낮은 온도에서 불규칙한 수영, 수술 움직임 증가, 배측에 직립 자세를 유지하는 능력 상실이 발생함을 밝혔습니다.

일단 숙달되면, 생식력에 미치는 영향을 포함한 이 프로토콜은 2개월 안에 측정할 수 있습니다. 전체 생식 기간 또는 다음 세대에 미치는 영향을 측정하기 위해 프로토콜을 확장할 수 있지만 여전히 6개월 후에 수행할 수 있습니다.