Name: 분석 결과 돋 아 내 피 세포 구슬 Pericytes 통합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: 배우세요 혈관신생에서 내피세포와 주변세포 상호작용을 연구하는 새로운 비드 분석법을 사용하는 방법을. 이 기법은 혈관생물학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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우리 유용한 토론에 대 한 박사 빅토리아 Bautch와 조슈아 바우처를 감사 하 고 표준 비드 최적화에 대 한 조언을 시험 조건 및 얼룩 프로토콜 분석 결과 돋 아 돋 아. S.H.A. 국립 과학 연구소에서의 일반 의료에서 교부 금에 의해 부분적으로 지원 되었다 5T32 GM007092 수상.

제 1 일:
1. 과도 Transfection 내 피 세포의
<ol><li>원하는 경우, 일시적인 transfection의 인간 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVEC) 유전자 규제 oligonucleotides (예: 마이크로 RNAs 또는 작은 간섭 RNA (siRNA))에 따라 적절 한 lipofectamine 시 약을 사용 하 여 수행 제조 업체의 지침입니다. 참고:이 프로토콜 역 transfections 사용자 지정 siRNA 시퀀스와 상업 transfection 시 약 (자료 표 참조)를 수행 하는 큰 성공을 했다. 저자는 다른 transfection 프로토콜 및 시 약이 분석이 결과 함께 테스트 하지. 나열 된 시 약을 사용 하 여 역방향 transfection에 대 한 단계는 다음과 같습니다.</li>
	<li>동결 건조 된 reconstitute siRNAs 또는 microRNAs nuclease 무료 물에서 20 µ M의 농도에서.</li>
	<li>다음 비율로 transfection 솔루션 확인: siRNA의 예측에 관한 9 µ L와 어떤 혈 청 자유로운 미디어의 1 mL.</li>
	<li>솔루션을 선동 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어에 있습니다.</li>
	<li>Transfection 시 약의 18 µ L을 솔루션에 추가 하 고 선동.</li>
	<li>하는 외피의 기간에 대 한 모든 10 ~ 15 분 해결책을 교 반 20-40 분 동안 실내 온도에 품 어 솔루션을 수 있습니다.</li>
	<li>Transfection 솔루션 잠복기 동안 HUVEC 세포 분리 솔루션 (예:Accutase)를 사용 하 여 분리 합니다. T175 플라스 크에 10 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 함께 플라스 크를 씻고 세포 분리 솔루션의 5 mL을 추가 하 고 10 분 동안 37 ° C에 플라스 크를 품 어.</li>
	<li>T175 플라스 크를 완전 한 미디어의 5 mL을 추가, 플라스 크와 3 분 1200 rpm에서 원심 분리기에서 세포 현 탁 액을 제거.</li>
	<li>진공 흡 인기를 사용 하 여 상쾌한을 제거 하 고 EGM2에 mL 당 1 X 106 세포의 밀도에 셀 펠 릿 resuspend. 참고:이 프로토콜 표준 성장 인자 총알 키트 추가 10% 포함 된 내 피 세포 성장 매체 (EGM2)를 사용 하 여 큰 성공을 왔다 FBS.</li>
	<li>Transfection 솔루션 잠복기 완료 되 면, 접시는 10 cm 접시 솔루션의 1 mL 고 위에 HUVEC 서 스 펜 션의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>9 mL에 10 cm 접시에 최종 볼륨을가지고 완전 한 미디어의 추가 7 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>분석 결과에서 나중 단계에 사용할 수 있는 충분 한 세포는 되도록 각 transfection 조건에 대 한 셀의 가치가 두 개 이상의 10 cm 번호판을 확인 합니다. 참고: 이러한 조건 20의 유전자 규정 oligonucleotide의 최종 작업 농도 귀 착될 nM. 저자는 60-80% 최저 관심의 그들의 목표에 대 한 유전자 발현의 결과를이 조건을 발견 했다. 다른 연구원은 그들의 실험적인 요구 transfection 조건 최적화 할 수 있습니다.</li>
	<li>SiRNA 단지 신선한 완전 한 미디어의 미디어 4-6 h 게시물 추가 교환 합니다. 참고:이 프로토콜 통로 사용 하 여 개발 되었다 1 2 HUVEC.</li>
</ol>주 2
2. 내 피 세포와 Microcarrier 구슬의 코팅
<ol><li>PBS와 압력솥에 60000 구슬/mL의 농도에서 microcarrier 구슬 (예를 들어, Cytodex 3)을 다시 구성. 참고: microcarrier 구슬 그램 당 약 3 x 106 구슬의 농도에 올. 약 60000 구슬/mL의 비드 밀도를 PBS의 mL 당 구슬의 20 밀리 그램의 비율로 구슬 reconstitute</li>
	<li>약 수 원하는 번호의 라운드 바닥 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)에 완전 한 미디어의 1 mL 튜브합니다.</li>
	<li>각 관 (구슬 솔루션 pipetting 이전 resuspended 잘 되도록 돌)으로 20 µ L microcarrier 구슬 서 스 펜 션의 플라스틱. 참고: 있을 것입니다 가능성이 극적인 변화 주어진된 microcarrier 구슬 정지에 구슬의 최종 작업 농도에. 구슬 쉽게 크게 솔루션에 구슬 농도 변경할 수 있는 플라스틱 및 유리 컨테이너의 측면을 준수 수 있습니다. 비드 솔루션 microcarrier 비드 현 탁 액의 각 일괄 처리에 대 한 FACS 튜브에 추가의 가장 적합 한 볼륨 탐정에 의해 실험적으로 결정 해야 합니다. 여기에 제시 된 숫자 봉사 시작 지점으로 더 의미가 있다. 이상적으로, 조건 10-20 구슬 분석 결과의 끝에 24 잘 접시에 잘 당 섬유 소 젤에 포함 되므로 최적화 되어야 합니다. 분석 결과 대 한 구슬 숫자의 최적화에 관한 아래 토론 섹션에서 추가 논의 참조 하십시오.</li>
	<li>분리 transfected HUVEC 24 h 게시물 transfection 세포 분리 솔루션을 사용 하 여 다음과 같습니다.<ol>
<li>셀의 5 mL PBS의 각 10 cm 접시를 씻고 셀 분리 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 고 10 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어.</li>
		<li>완전 한 미디어에 1 X 106 셀/mL의 농도에서 세포 resuspend</li>
	</ol>
</li>
	<li>구슬 포함 된 각 FACS 튜브에 세포 현 탁 액 (즉 1 X 106 HUVEC)의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 교 반 하십시오 FACS 튜브 마다 20 분 동안 37 ° C (해당 되는 경우 3.4 단계로 진행) 또는 2.5 ~ 3 h h 4의 (해당 되는 경우 3.2 단계로 진행). 참고:이 기간 및 동요의 주파수는 경험적으로 의해 결정 되었습니다 이전 연구자의 분석 결과 돋 아 기본 비드 최적화. 4 동요의 다른 주파수와 구슬 코팅 단계 기간 하지 저자에 의해 테스트 되었습니다.</li>
</ol>3. 순차적 코팅 HUVEC 코팅 Microcarrier 구슬에 Pericytes의
<ol><li>10T1/2 셀 (pericytes) 셀 분리 솔루션 (trypsin)를 사용 하 여 다음과 같이 분리 시작:<ol>
<li>PBS의 10 mL와 함께 T175 플라스 크를 씻고 trypsin의 5 mL을 추가 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>완전 한 미디어에서 2 X 105 셀/0.5 mL의 농도에서 10T1/2 resuspend. 참고: 셀 미국 유형 문화 수집 (ATCC)에서 구매 되었다. 참고: 문화 10T1/2 셀 최소 필수 매체 (MEM)에 보충 10 %FBS 1% 페니실린 스.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Agitating 구슬 + HUVEC 솔루션의 2.5 ~ 3 h, 후 구슬과 부동성 HUVEC 튜브의 하단에 정착 수 있도록 5 분 기다립니다.</li>
	<li>P1000 피 펫을 사용 하 여 각 튜브에서 완전 한 미디어의 0.5 mL을 제거 하 고 각 FACs 튜브를 0.5 mL의 볼륨에서 완전 한 미디어에서 2 x 105 10T1/2 추가. 셀 및 구슬은 솔루션을 선동 하 고 37 ° c.에 품 어 계속 구슬 4 h의 총 동요 되는 때까지 매 20 분을 선동을 계속 합니다. 참고: 5 HUVEC의 비율: 구슬에 1 pericyte 혈관의 적절 한 pericyte 범위를 유지 하기 위해 필수적 이다. 참고: 다음 대체 단계 프로토콜에서이 시점에서 대신 다음 수 있습니다.</li>
	<li>4 h에만 구슬 및 HUVEC을 교 반 하십시오.</li>
	<li>Microcarrier 구슬의 HUVEC 코팅의 4 h 완료 되 면 선동 튜브 마지막으로 한 번, 30-60 s를 기다려 다음 FACS 튜브에서 솔루션의 1.5-1.75 mL를 즉시 제거. 참고:이 미디어에서 많은 부동성 HUVEC 제거 될 것 이다 동안 정착 구슬의 대부분에 대 한 충분 한 시간을 허용 해야 합니다.<ol>
<li>완전 한 미디어에서 2 X 105 10T1/2를 추가 하 고는 FACS의 볼륨을가지고 최대 2 mL 튜브.</li>
		<li>부드럽게 FACS 튜브 마다 20 분 추가 시간에 대 한 교 반 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>교 반 완료 되 면, 부드럽게 선동 튜브 마지막으로 한 번 즉시 제거 전체 솔루션 (2 mL), 그리고 6 cm 접시에 그것을 추가. 각 접시에 완전 한 미디어의 추가 3 mL를 추가 하 고 판 37 ° C 배양 기에서 밤새 껏 두기 위하여.</li>
</ol>3 일
4입니다. 섬유 소 젤 솔루션의 준비
<ol><li>PBS에서 1 mg/mL의 농도에 aprotinin 및 50 단위/mL에서 트 롬 빈의 작업 솔루션을 준비 합니다. 참고: 이러한 솔루션의 큰 주식 만든 고 적어도 1 년에 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다.</li>
	<li>2 mg/mL의 농도에서 fibrinogen의 신선한 솔루션을 확인 합니다. 동요 FACS 튜브 당 솔루션의 2.5 mL를가지고 충분 한 솔루션을 확인 합니다.<ol>
<li>솔루션에 들어가려고 fibrinogen의 모든 있도록 10 분 동안 37 ° C 물 욕조에 솔루션을 따뜻한.</li>
		<li>Fibrinogen 솔루션의 1 mL 당 aprotinin 솔루션의 37.5 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>멸 균 필터 솔루션 고 실 온에서 설정 옆으로.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 구슬 젤 이식 준비
<ol><li>모든 구슬 충분히 내 피 세포에 의해 코팅 되는 되도록 20 X 목표를 사용 하 여 현미경 microcarrier 코팅 구슬 포함 된 요리를 검사 합니다.</li>
	<li>적극적으로 플라스틱 셀 6 cm 접시에서 그들을 분리 하 고 솔루션 튜브 도금된 솔루션. 세척 접시 2 X 추가 시간 완전 한 미디어와 모든 잔여 구슬 플레이트에 부착 될 수 있습니다 수집 하는 튜브를 전송.<ol>
<li>소개 하는 기포 방지 하 고 p1000 피 펫을 사용 하 여 내 피 세포 코팅 구슬에 전단 응력을 최소화.</li>
		<li>내 피 세포에 siRNA 때 려 눕 힘 효율성 평가 필요 하다 면, 2 단계에서 HUVEC 전용 코팅된 구슬의 접시를가지고 해야 합니다. 다음이 단계 (5.2), 구슬 분리 하 고 HUVEC RNA 분리 및 정량 분석에 대 한 플레이트에 연결 된 잔여 수집 키를 누릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>튜브의 하단에 정착 솔루션에 구슬 수 있도록 3 분을 기다립니다.</li>
	<li>P1000 피 펫 팁을 사용 하 여 비드 펠 렛을 방해 하지 않고 최대한 많은 상쾌한 제거 (진공 흡 인기 사용 안 함).</li>
	<li>각 튜브를 완전 한 미디어의 1 mL을 추가 하 고 resuspend 구슬.</li>
	<li>30-60 s는 바닥에 정착을 구슬 수 있도록 기다립니다. 비드 펠 렛을 방해 하지 않고 P1000 피 펫을 사용 하 여 가능한으로 상쾌한의 제거. 비드 펠 렛을 실수로 제거의 가능성은 크게 증가 진공 흡 인기를 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>5.5 및 5.6 두 추가 번 단계를 반복 합니다. 목표 하지 부동성 세포 보다 더 빨리 FACS 튜브에 정착 한다 너무 많은 HUVEC 코팅 구슬, 제거 하는 동안, 6 cm 접시에서 분리 되어 수 부동성 HUVEC의 제거 하는 것입니다.</li>
	<li>구슬에 완전 한 미디어의 1 mL를 추가 합니다.</li>
</ol>6. 포함 코팅 섬유 소 젤에 구슬
<ol><li>P1000 피 펫을 사용 하 여 각 FACS 튜브에 비드 펠 렛을 방해 하지 않고 최대한 많은 미디어를 제거 합니다.</li>
	<li>2.5 ml fibrinogen 솔루션의 구슬 resuspend.</li>
	<li>트 롬 빈 솔루션의 13 µ L 24-잘 유리 바닥 접시의 원하는 각 플라스틱. 도금 유리 바닥 접시에 콩나물의 최적의 이미지 사용에 대 한 필수적입니다. 참고: 다음 단계 전에 5-10 분 이상 잘에 앉아 하는 트 롬 빈을 두지 마십시오.</li>
	<li>각 우물에 구슬/fibrinogen 솔루션의 0.5 mL를 추가 합니다.<ol>
<li>잘 때마다 솔루션 pipetting 이전 구슬 솔루션 resuspend를 해야 합니다.</li>
		<li>신중 하 게 우물에 이미 있는 트 롬 빈에 직접 플라스틱을 주의. 천천히 플라스틱 아래로 2-3 시간을 철저 하 게 혼합 솔루션, 복용 주의 어떤 공기 방울을 소개 하지.</li>
		<li>웰 스 사이 피 펫 팁을 변경 해야 합니다.</li>
		<li>주의 키를 눌러 이동 또는 어떤 운동 든 지 젤 형성 중단 될 수 있습니다 대로 응고, 초기 섬유 소 중 어느 시점에서 접시를 방해.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실 온에서 30 분 동안 후드에 앉아 접시를 남겨 주세요.</li>
	<li>조심 스럽게 완전히 응고를 젤 수 있도록 추가 1.5-2 h 37 ° C 배양 기에 접시를 전송</li>
</ol>7. 도금 섬유 소 젤 위에 섬유 아 세포
<ol><li>젤 응고의 마지막 30 분 동안 보통 인간의 폐 섬유 아 세포 (NHLF)를 다음과 같이 분리:<ol>
<li>PBS, 10 mL로 세포의 T175 플라스 크를 씻고 세포 분리 솔루션의 5 mL을 추가 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>완전 한 미디어에 20000 셀/mL의 농도에서 NHLF를 resuspend. 참고: NHLF 세포와 Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM) 10 %FBS 1% 보충 양식 수 페니실린 스.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 잘 젤에 NHLF 세포 현 탁 액의 1 mL 접시 하 고 인큐베이터에 다시.</li>
	<li>완전 한 미디어 분석 결과의 동안 매일 변경 합니다.</li>
</ol>8. 섬유 소 젤에 구슬 이식 다음 2-7 일에 걸쳐 돋 아 관찰. 돋 아에 필요한 시간의 길이 HUVEC의 통로 많은 수에 따라 달라 집니다.
9입니다. 분석 결과 돋 아의 고정
<ol><li>일단 충분 한 돋 아 치료 그룹의 phenotypic 차이 결정, 모든 우물 2 mL PBS의와 함께 한 번 씻어 수 발생 했습니다.</li>
	<li>각 잘 하 세포 분리 솔루션의 0.5 mL을 추가 하 고 5 분 동안 37 ° C 배양 기에서 접시를 놓습니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 접시를 제거 하 고 접시의 측면을 누릅니다. 참고:이 단계의 목적에서 젤으로 젤의 이미징에 항 체 침투를 촉진 하기 위하여 가능한 섬유 소 젤 위에 성장 하는 NHLF 세포의 만큼 제거 하는. 셀 분리 솔루션 총 보육 시간 NHLF 제거를 최적화 하도록 조정 해야 합니다. 연구는 하지와 세포 분리 솔루션 수 있습니다 젤에 침투 내 내 피 구조를 방해 시작 시간의 과도 한 동안 젤을 품 어를 경고 했다.</li>
	<li>NHLF 세포의 충분 한 양의 제거 되 면 완전 한 미디어의 1 mL로 세포 분리 솔루션을 끄다.</li>
	<li>분리 된 NHLF 및 진공 흡 인기를 사용 하 여 미디어를 aspirate 하 고 우물 1 mL의 PBS로 한 번 씻어.</li>
	<li>각 우물에 PBS에서 2 %paraformaldehyde 솔루션의 300 µ L을 추가 하 고 10 분 동안 실내 온도에 품 어.</li>
	<li>2 %paraformaldehyde 솔루션을 제거 하 고 실 온에서 각각 잘 3 시간 3 분 1 mL의 PBS로 세척. 참고: 2 %paraformaldehyde 솔루션 환경 보건 및 안전 (EHS) 지침에 따라 적절 하 게 폐기 하시기 바랍니다.<ol>
<li>각 잘 얼룩 또는 콩나물 이미지 준비가 될 때까지 4 ° C에서 저장 하는 PBS의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. 분석 결과 돋 아의 얼룩
<ol><li>0.5% 각 PBS에 트리톤 X 100 잘 하 고 실 온에서 30 ~ 45 분 동안 품 어의 300 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>진공 흡 인기 사용 하 여, 트리톤 X100을 제거 하 고 5 분 동안 PBS에서 3 회 세척.</li>
	<li>차단 솔루션 각 젤을 500 µ L을 추가 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어 참고: 차단 솔루션은는 다음과 같은 구성 요소로 이루어져: 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 5 %FBS, 0.1% 트윈-20, 그리고 1% 원으로 (를 사용 하 여 당신의 이차 항 체는 파생 된 동일한 종) PBS에.</li>
	<li>각 우물에서 차단 솔루션을 제거 하 고 각 음에 1 차적인 항 체를 포함 하는 얼룩 솔루션의 300 µ L를 추가 합니다. 참고: 얼룩 솔루션은 같은 원으로 존재 하지 않고 차단 솔루션으로. 저자는 1:400에 1: 200의 희석에서 1 차 항 체와 함께 배양 성공을 했다.</li>
	<li>4 ° c.에 24 h에 대 한 솔루션 얼룩에 1 차 항 체를 품 어</li>
	<li>1 차적인 항 체 솔루션을 발음 하 고 부드러운 락으로 실 온에서 20 분 각 0.5% 트윈와 TBS에서 3 회 세척. 3 세척 후 신선한 워시 버퍼 다시, 대체 하 고 하룻밤 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>실 온에서 2 h에 대 한 솔루션 얼룩에 형광 이차 항 체 희석 1:1000와 함께 품 어.</li>
	<li>이차 항 체 얼룩 솔루션을 제거 하 고 부드러운 락으로 실 온에서 0.5% 트윈이 포함 된 TBS와 20 분에 대 한 5 번 세척.</li>
	<li>PBS에서 핵 얼룩을 희석 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어 참고:이 프로토콜 PBS에 희석 Hoechst 1:10000와 함께 큰 성공을 했다. 참고: 영상 전에 핵 얼룩 솔루션을 제거할 필요가 있다.</li>
	<li>이미지 완료 최적의 형광 신호를 잡으려고 얼룩의 몇 일 이내.</li>
</ol>11. 분석 결과 정량화를 돋 아
<ol><li>콩나물 몇 군데 되어 있다, 후 ImageJ로 이미지 파일을 가져올 하 고 콩나물, 개수를 카운트 도구 또는 새싹 길이 측정 하는 선 도구를 사용 하 여. 참고: 콩나물 내 피 돌출 그들은 돋 아 있는 구슬의 직경 보다 크거나 길이가 정의 됩니다. 11 새싹 길이는 새싹 새싹의 끝에 구슬에서 돌기 시작 하는 지점에서 거리로 측정할 수 있습니다. 평균 새싹 비드 당 고 비드 당 콩나물의 평균 수는 신생 돋 아에서 유전자 침묵의 phenotypic 효과 평가 하기 위해 유용한 통계. 치료 그룹 당 적어도 1 개의 새싹을 포함 하는 구슬의 평균 수 돋 아의 견고성을 평가 하기 위해 통계로 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 특성화 복잡 한 단계와 철저 한 기계적 조사에 유전과 이미징 접근을 연구 함으로써 신생을 돋 아의 heterotypic 세포 상호 작용을 위한 메서드를 제공 합니다. 분석 결과 수행할 때 그 구슬의 효율적인 내 피 코팅 동안에 일어난 구슬 동요 단계 필수적 이다. 불 쌍 한 내 피 코팅은 구슬 골프 공 처럼 거친 표면 젤 이식 전에 다음날 아침 고 대신 완전히 부드러운 표시 나타나지 않는 경우에, 분명 하 게 만들어질 것 이다. 구슬 구슬 표면 내 피 세포의 최대 노출 수 있도록 튜브를 적극적으로 교 반에 의해 각 동요 단계 충분히 resuspended는 되도록 처리 하지만 하지 너무 적극적으로 그것이 이미 내 피 세포를 발생 구슬에서 분리 되 연결할.
분석 결과에 pericytes을 추가 하는 때 1 pericyte 5 내 피 세포의 비율이 유지 됩니다 필수적 이다. Pericytes의 과잉 발생 자라 다, 분석 결과 중 내 피 세포 인구를 추월 하 고 pericy...

신생 적절 한 embryogenesis 및 상처 치유에 필수적 이며, 그것은 또한 암 진행1 및 관상 동맥 질환을 포함 하 여 수많은 질병에 주요 역할을 재생 합니다. 2 , 3 신생 정상적인 개발 중 발생 하는 방법을 그리고 pathologic 컨텍스트에서 활성화 하는 방법의 더 나은 이해 하는 데이 소설, 효과적인 치료제의 개발에 대 한 중요 합니다. 중요 한 단계와 비보에 신생에 관련 된 셀 형식을 정리 충실 한 생체 외에서 모델 더 나은 신생을 운전 하는 분자 메커니즘을 특성화 하 고 소설 발견을 연구원 허용 하는 데 필요한 내 피 규칙.
휴즈와 나카쓰 돋 아 비드 분석 결과 그들은 신생을 돋 아의 많은 알려진된 단계를 겪 습 증명을 최적화 했습니다. 4 , 5 여기에 제시 된 방법의 목적은 돋 아 내 피 세포 벽 세포의 paracrine 및 juxtracrine 역할에 통합 될 수 있도록 분석 결과에 perictyes를 통합 하 여 나카쓰와 휴즈에 의해 최적화 된 분석 결과 따라 구축 소설 신생 학문입니다. Pericytes는 벽 세포 세포를 유지 하는 가까운 신체 접촉 때문에 혈관 지하실 멤브레인에 포함 되는 그들의 내 피 세포와 그들의 역할에 의해 정의 되는. 6 Pericytes 및 내 피 세포에에서 관여 신호 노치를 포함 한 경로 통해 복잡 한 잡담 신호, 중앙 Tie2, PDGFRβ, TGFRβ, 및 많은 다른 사람. 7 , 8 마우스 모델 결핍이 신호 경로에 embryogenesis, 가난한 혈관 개장에 선도에서 맥 관 구조 및 기능 장애 맥 관 구조 개발의 가난한 pericyte 범위를 보여 줍니다. 7 또한, pathologic 신생에 pericytes의 역할은 중요 하지만 때로는 아래의 감사. 예를 들어 종양 맥 관 구조의 고유 기능은 혈관은 더 많은 새, 미 숙 하 고 가난한 pericyte 적용으로 인해 기능 장애입니다. 9 그것은 제안 되었습니다 pericytes의 유무 극적으로 종양 혈관의 표현 형에 영향 하는 항 혈관 신생을 antitumor 치료 응답의 중요 한 중재자. 9 따라서, 더 완전 하 게 내 피 규제의 중요 한 메커니즘을 캡처의 열쇠는 생체 외에서 분석 실험에서 pericytes의 역할을 포함 하 여.
비록 많은 시험관 및 전 비보 분석 현재 신생 공부를 고용, 각각에 고려해 야 할 결점 있다. 일부 내 피 확산 등 내 피 마이그레이션 분석 실험, 지나치게 단순화 하 고 초점 조직 문화 플라스틱에 격리 된 환경에서 한 내 피 기능에. 10 다른 분석와 같은 Matrigel 관 형성 분석 결과,10 만이 분석 실험은 여전히 간소화 마이그레이션할 드 노 보 혈관 형성 내 피 세포의 기능에 더 많은 초점 더 많은 3 차원 (3D) 설정, 발생 기존의 맥 관 구조에서 돋 아와 반대로 구조. 또한,이 분석 실험의 벽 세포 유형 통합. Ex vivo 모델 링 대동맥 분석 결과 pericytes 호스트 기관에 통합 수행 하는 있지만 이러한 모델의 유전자 조작의 녹아웃 또는 유전자 변형 마우스 모델 생성의 필요성 때문에 훨씬 더 도전적인는 관심 경로 분석 결과 돋 아 비드 모델 내 피 돋 아, 확산, 마이그레이션, 그리고 3 차원 매트릭스에도 문 합 및 루멘 형성 하기 때문에 이상적 이다. 4 분석 결과 충실 하 게 돋 아, 내 피 세포 또는 더 많은 제어 설정에서 pericytes의 직접적인 유전 수정에 대 한 허용 하면서의 많은 다른 단계 기계적 평가 대 한 수 있습니다. 돋 아 구슬 포함 된 섬유 소 혈전 쉽게 고정, 스테인드, 고 수 돋 아;의 여러 단계에서 몇 군데 이 새싹이 돋 아의 실시간 이미지를 수행 하는 라이브 영상 실에 배치할 수 있습니다. 여기에 제시 된 방법론 공부 깊이 형질에 통해 신생의 기본 메커니즘 및 신생 중 활성화 통로의 철저 한 분석에 이상적입니다.

<table><tbody><tr><td>멸균 피펫 팁</td><td>, VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫터,</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Complete EGM2 매체, 불릿 키트</td>, <td>Lonza</td><td>CC-3162</td>, <td>HUVEC 매체</td></tr>, <tr><td>MEM</td><td>Gibco</td><td>11095114</td>, <td>10T1/2 매체</td></tr>, <tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965118</td>, <td>NHLF 매체</td></tr>, <tr><td>조직 배양 등급 PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>마그네슘 및 칼슘이 없는</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>들어 올리기 위해 HUVEC</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>15050065</td><td>10T 1/2 및 NHLF</td></tr><tr><td>Customs siRNAs</td><td>시그마</td><td></td><td></td></tr><tr><td>리포펙타민 RNAiMax</td><td>Life Technologies</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td></td></tr><tr><td>10T 리프팅 1/2</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHLF</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytodex 3 마이크로캐리어 비드</td><td>Sigma</td><td>C3275</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 코팅 6cm 및 10cm 플레이트</td><td>소</td> 플라즈마의 코닝 <td></td><td></td></tr><tr><td>피브리노겐</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>트롬빈</td><td>Sigma</td><td>t9549</td><td></td></tr><tr><td>아프로티닌</td><td>Sigma</td><td>a3428</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Round-Bottom Tubes</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 인큐베이터 및 후드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24웰 유리 바닥 플레이트</td><td>MatTek</td><td>P24G1.513F</td><td>유리 바닥 플레이트는 새싹을 이미지화하려는 경우에만 필요합니다. 그렇지 않은 경우 조직 배양 플라스틱도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>멸균 여과 장치</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

분석 결과 돋 아 내 피 세포 구슬 pericytes 통합

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

신생 기존의 맥 관 구조에서 새로운 혈관의 성장 이며, embryogenesis 및 개발, 상처 치유, 종양 성장 및 전이를 포함 하 여 많은 생물학 과정 그리고 눈 및 심장 혈관 질병의 중요 한 구성 요소입니다. 신생의 생물학을 정리 하는 효과적인 생체 외에서 모델 필요 적절 하 게이 과정을 공부 하 고 새로운 치료 전략에 대 한 궁극적으로 대상이 될 수 있는 규제의 메커니즘을 식별 합니다. 비드 신생 분석 결과 이전 입증 되었습니다 내 피 돋 아의 여러 단계를 정리 생체 외에서. 그러나,이 분석 결과의 한계는 부족의 내 피-벽화 세포 상호 작용, 내 피 세포의 분자 및 phenotypic 규정 하는 열쇠는 vivo에서작동. 여기에서 주어진 프로토콜 구슬 신생 분석 결과에 벽화 셀의 설립에 대 한 방법론을 제시 하 고 돋 아 시험관중 내 피 세포와 pericytes의 단단한 협회를 보여줍니다. 프로토콜은 또한 효과적인 기계 론 적인 연구에 대 한 내 피 세포에 siRNA를 사용 하 여 대상 유전자의 입을 위한 방법론을 자세히 설명 합니다. 이 프로토콜 시험관에서 분석 결과 신생, 돋 아에 관련 된 다양 한 셀 형식 보다 적절 하 고 치료 평가 및의 소설 발견 더 순수-관련 플랫폼을 제공을 제공 하는 모두, 신생 규제의 메커니즘입니다.

이 프로토콜을 사용 하는 두 셀 형식 생체 외에서 의 단단한 협회를 위한 그리고 존재는 pericytes의 보완 돋 아 (그림 1A, B)의 발생. 프로토콜도 사용 하면 효과적인 입을 (예를 들어 RNA 간섭을 통해) 관심 (VEGFA 특히 내 피 세포에서에서) 또는 pericytes에서 PDGFRβ 등7,12 의 셀 형식에 관심사의 유전자의 분석 결과,이 분석 결과에서 돋 아 형의 저해를 번역할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용 하는 연구원은 혈관 기능에 pericytes의 독특한 기여를 더 철저 하 게 조사 pericyte 코팅 돋 아 분석 결과를 병렬로 표준 내 피 세포만 돋 아 시험을 수행 하는 것이 좋습니다. 그리고 고기 공부 되 고입니다.</...

이 프로토콜 선물 소설 체 외에서 구슬 시험을 더 적절 하 게 vivo에서 pericytes를 통합 하 여 신생을 돋 아의 프로세스 모델. 이 수정 구슬 분석 결과를 내 피 세포와 신생에 대 한 중요 한 벽화 셀 간의 heterotypic 세포 상호 작용을 더 충실 하 게 정리를 수 있습니다.

분석 결과 돋 아 내 피 세포 구슬 Pericytes 통합

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

이 분석의 전반적인 목표는 in vivo 혈관 신생의 복잡성을 캡슐화하는 이형 세포 상호 작용을 in vitro에 통합하는 것입니다. 이 방법은 혈관 신생 중 주위 세포 내피 세포 상호 작용의 중요성에 대한 혈관 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 증식, 이동 및 문합을 포함한 발아 혈관 신생의 여러 단계를 통합하는 동시에 내피 세포 주위 세포 상호 작용에 대한 연구를 허용한다는 것입니다.먼저 PBS에서 밀리리터당 4번째 비드 농도로 마이크로캐리어 비드를 6 곱하기 10으로 재구성한 다음 마이크로캐리어 비드 현탁액의 오토클레이브 멸균을 수행합니다. 다음으로, 1ml의 완전한 배지를 적절한 수의 둥근 바닥 형광 활성화 세포 분류 또는 FACS 튜브에 분취하고 각 튜브에 20마이크로리터의 실온 냉각식 오토클레이브 멸균 마이크로캐리어 비드 현탁액을 추가합니다. 각 튜브에 1ml의 세포를 추가합니다.튜브를 교반하고 섭씨 37도에서 2 1/2에서 3시간 동안 20분마다 부드럽게 교반하면서 튜브를 배양합니다. 배양이 끝나면 세포와 비드가 튜브 바닥에 가라앉을 수 있도록 실온에서 5분 동안 세포를 비드에 놓습니다. 그런 다음 P1000 피펫을 사용하여 각 튜브에서 0.5ml의 배지를 10에서 5번째 주피세포까지 2배의 배지와 0.5ml의 완전 배지로 교체합니다.cell-bead suspension을 교반하고 beads가 총 4시간 동안 교반될 때까지 20분마다 부드럽게 교반하여 세포를 섭씨 37도의 incubator로 되돌립니다. 배양이 끝나면 튜브를 마지막으로 한 번 부드럽게 교반하고 즉시 각 튜브의 2 밀리리터 부피의 용액 전체를 개별 6cm 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 각 플레이트에 3ml의 완전 배지를 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.다음 날 아침, 현미경으로 20배 배율로 마이크로캐리어 코팅된 비드 접시를 검사하여 모든 비드가 내피 세포에 의해 충분히 코팅되었는지 확인합니다. 플레이트를 층류 후드로 옮기고 P1000 피펫을 사용하여 코팅된 비드 용액을 격렬하게 흡인 및 분주하여 플레이트 바닥에서 세포를 분리하고 상등액을 개별 튜브로 옮깁니다. 구슬이 튜브 바닥에 3분 동안 가라앉도록 합니다.그런 다음 P1000 피펫을 사용하여 비드 클러스터를 방해하지 않고 가능한 한 많은 상층액을 제거합니다. 튜브당 1ml의 완전한 매체에 비드를 다시 매달고 비드가 30-60초 동안 가라앉도록 합니다. P1000 피펫을 사용하여 상층액을 다시 흡입하고, 방금 시연한 것처럼 비드 현탁액에서 자유 부유 내피 세포를 새로운 완전 배지로 두 번 더 세척합니다.세 번째 세척 후 2.5ml의 피브리노겐 용액에 비드를 다시 현탁시킵니다. 24웰 유리 바닥 플레이트에 웰당 13마이크로리터의 트롬빈 용액을 추가합니다. 그런 다음 각 웰에 0.5ml의 비드 피브리노겐 용액을 첨가하고 비드를 트롬빈에 직접 조심스럽게 피펫팅하고 용액을 완전히 혼합하기 위해 천천히 위아래로 2-3회 피펫팅합니다.모든 웰에 파종이 완료되면 트롬빈-피브리노겐 용액이 실온에서 30분 동안 층류 후드에 사전 응고되도록 합니다. 배양이 끝나면 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터로 조심스럽게 옮겨 1.5-2시간 더 기다립니다. 겔이 완전히 응고되면 완전한 배지에서 밀리리터당 4번째 세포 농도에서 10배의 2배로 정상적인 인간 폐 섬유아세포를 다시 현탁시키고 각 웰에 1밀리리터의 섬유아세포를 추가합니다.그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다. 코팅 프로토콜을 엄격하게 준수하면 피브린 겔 주입 준비가 된 충분히 코팅된 비드의 대표적인 이미지에서 볼 수 있듯이 거친 골프공과 같은 모양의 세포 코팅 비드가 생성됩니다. 또한, 이 프로토콜은 in vitro에서 두 가지 세포 유형의 긴밀한 연관성을 촉진하여 발아 발생을 보완하는 pericyte의 존재를 촉진합니다.이 절차를 시도하는 동안, 교반 단계에서 비드를 세포로 완전히 코팅하는 것을 기억하고, 겔 주입 중에 기포가 생기지 않도록 비드를 피브린 겔에 조심스럽게 삽입하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 혈관 신생에 대한 마우스 연구와 같은 다른 분석을 수행하여 in vitro에서 발아 분석에서 탐구된 메커니즘 및 표현형의 생체 내 관련성은 무엇입니까? 이 기술은 암 생물학 분야의 연구자들에게 유용할 것이며 생리학적으로 더 관련성이 높은 혈관 신생의 시험관 내 모델에서 내피 세포 주위 세포 상호 작용 및 기능을 탐구하는 데 유용할 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 동영상은 체외의 angiogenesis 분석에의 프로토콜을 보여줍니다 angiogenesis의 recapitulates 여러 단계의 것을. 시간 저속 돋아의 이미지, 루멘 형성, 분기 및 문합 - angiogenesis의 주요 기능은 - 표시됩니다.

Angiogenesis 연구에 최적화된 섬유소 젤 비드 분석

이 동영상은 혈관신생 초기 단계에서 내피 발아를 연구하기 위해 주피세포를 통합한 변형된 마이크로캐리어 비드 기반 분석을 보여줍니다. 이 분석은 혈관 신생의 분자 메커니즘과 항 혈관 유전 치료의 효과를 이해하기 위한 체외 실험 모델을 제공합니다.

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3차원 공동 배양 스페로이드 혈관신생 분석 시스템은 생리적 혈관신생을 모방하도록 설계된다. 공배양 스페로이드는 두 개의 인간 혈관 세포 전구체, ECFC 및 MSC에 의해 형성되고, 콜라겐 겔에 내장된다. 새로운 시스템은 혈관 신생 변조기를 평가하는 데 효과적이며 생체 내 연구에 보다 관련성이 있는 정보를 제공합니다.

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체외 혈관 질환 모델링 및 약물 검사를 위한 마우스 배아 줄기 세포를 이용한 혈관신생의 3차원 발아 분석

이 연구는 2차원(2D) 스크래치 상처 이동 분석 및 3차원(3D) 스페로이드 발아 분석과 함께 RNA 추출 및 면역세포화학을 포함한 각각의 다운스트림 분석 방법과 함께 in vitro 혈관 신생을 연구하는 데 적합한 분석법으로 제시합니다.

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배우세요 혈관신생에서 내피세포와 주변세포 상호작용을 연구하는 새로운 비드 분석법을 사용하는 방법을. 이 기법은 혈관생물학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

분석 결과 돋 아 내 피 세포 구슬 Pericytes 통합

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