CRISPR 중재 손실 함수 분석 소 뇌과 립 세포를 사용 하 여 Utero에서 Electroporation 기반 유전자 이동

이 전기천공법 기반 in vivo 유전자 전달 접근법의 전반적인 목표는 CRISPR 매개 기능 손실 분석을 사용하여 소뇌 과립 세포의 분화에서 관심 유전자의 역할을 평가하는 것입니다. 이 방법은 정상적인 소뇌 발달 및 뇌종양 형성에 중요한 분자의 식별과 같은 발달 신경 과학 및 신경 종양학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 자궁 내 전기천공법의 절차는 Peter Lichter 교수 연구실의 박사후 연구원인 Lena Herbst 박사가 시연한 후, Haikun Di 박사 연구실의 박사후 연구원인 Weijun Feng 박사가 다음과 같은 면역조직화학을 수행합니다.

이 방법의 주요 장점은 knock-out 동물의 조합을 생성하는 대신 CRISPR-cas9 기술을 사용하여 소뇌 세포에서 관심 유전자를 실현 가능하게 knock-out하기 위해 노력하는 것입니다. 이 방법은 정상적인 소뇌 발달 중 유전자 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 물리적 뇌 영역의 발달 및 뇌종양 모델링과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 먼저 붕규산 유리 모세관을 마이크로피펫 풀러에 넣고 당겨 미세한 팁을 만듭니다.

주입 중 더 나은 시각화를 위해 모세관 끝에 검은색 잉크로 라벨을 붙이고 유리에 스케일을 그립니다. 실체 현미경으로 작업하면서 자와 날카로운 바늘 핀셋을 사용하여 팁을 약 6mm 길이로 자르고 날카롭고 한쪽 경사진 가장자리를 만듭니다. 영점 22미크론 필터를 통해 1%고속 녹색 원료 용액을 여과하여 용액에서 염료 입자를 제거합니다.

single-guide RNA plasmid를 luciferase reporter plasmid와 동일한 비율로 혼합하여 각 플라스미드에 대해 밀리리터당 최소 1마이크로그램의 최종 농도를 유지합니다. 플라스미드 용액을 최종 농도 0.5%에서 빠른 녹색으로 착색합니다.임신한 CD-1 마우스를 이소플루란으로 마취한 후 마우스를 등에 눕혀 가열 패드에 놓고 진통제를 투여합니다. 수술 중 안구 건조증을 예방하기 위해 안연고를 바르십시오.

렌즈를 테이프로 고정하고 소독액으로 복부를 소독합니다. 거즈로 마우스를 덮고 수술 부위만 노출시킵니다. 약 2cm 길이의 피부를 절개한 후 리네아 알바를 찾아 뭉툭한 티슈 가위를 사용하여 복막을 통해 약간 작은 두 번째 절개를 만듭니다.

예열된 멸균 PBS로 열린 복강을 적십니다. 다음으로, 고리 겸자를 사용하여 복강에서 자궁 뿔을 조심스럽게 추출합니다. 인접한 두 배아의 난황낭 사이의 틈새에서 자궁벽을 잡고 부드럽게 당깁니다.

절개 부위를 통해 배아를 당기는 동안 배아에 가해지는 압력을 피하십시오. 자궁 뿔이 추출되면 준비된 유리 모세관으로 약 10-15마이크로리터의 유색 플라스미드 용액을 흡인합니다. 이 과정에서 기포를 피하십시오.

링 집게로 배아를 부드럽게 잡고 목 부위를 찾습니다. 유리 모세혈관 끝으로 등쪽 뒷뇌를 천천히 관통하고 제4심실로 이동합니다. 약 1마이크로리터의 플라스미드 혼합물을 주입합니다.

염색된 DNA가 뇌에서 누출되지 않았으며, 다이아몬드 모양의 구조로 보이는 것을 확인합니다. 여기서 가장 중요한 것은 제4심실의 전체 영역을 플라스미드 용액으로 채우고, 소뇌 원위부에도 DNA를 전달하는 것입니다. 동시에 그 과정에서 출혈이 발생하지 않도록 해야 한다.

직경 5mm의 전극판이 장착된 백금 핀셋을 배아의 머리 위에 측면으로 놓고 음극은 귀를 덮고 양극은 자궁벽 위의 소뇌 원시에 배치하고 전기 사각 펄스를 적용합니다. 모든 배아가 전기천공이 완료되면 자궁 뿔을 조심스럽게 복강에 다시 넣고 멸균 PBS로 채웁니다. 자궁 뿔이 자연스러운 위치로 미끄러지도록 합니다.

마취를 끄고 동물의 배를 아래로 향하게 하여 회복을 위해 새 케이지에 넣습니다. 냉동 절제 전에 섭씨 4도에서 뇌당 PBS에 4%PFA 5ml로 밤새 소뇌를 고정합니다. 다음날, 고정된 소뇌를 뇌당 PBS에 30%수크로오스 10ml로 옮기고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

다음 날, 조직이 튜브 바닥으로 가라앉은 후 자당에서 뇌를 제거하고 남은 자당 용액을 셀룰로오스 여과지 조각으로 흡수합니다. 다음으로, 일회용 플라스틱 틀에 넣은 최적의 절단 온도 화합물에 각 소뇌를 담그고 드라이 아이스에 얼립니다. 저온 유지 장치를 사용하여 극저온 블록을 10미크론 두께의 섹션으로 자르고 사용할 때까지 섹션을 섭씨 영하 80도로 유지합니다.

면역염색을 진행할 준비가 되면 먼저 슬라이드를 실온에서 30분 동안 건조시킨 다음 PBS에서 매번 10분씩 두 번 세척합니다. 액체 차단제 펜으로 섹션을 동그랗게 만들고 실온에서 1시간 동안 차단 용액에 섹션을 배양합니다. 차단 용액의 관심 분자에 대한 1차 항체를 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

PBS가 함유된 0.1% 트리톤을 10분씩 3회 세척합니다. 그런 다음 DAPI를 함유한 차단 용액에 희석된 형광단 접합 2차 항체를 첨가하고 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 절편을 배양합니다. PBS-T에서 슬라이드를 매번 10분 동안 세 번 세척한 다음 슬라이드를 장착하고 이미징할 때까지 섭씨 4도를 유지합니다.

streptococcus pyogenes cas9를 안정적으로 발현하는 hek293T 세포를 sgRNA로 발현 및 표적화 플라스미드로 transfection하였다. 살아있는 세포에서의 GFP 발현은 형광 세포 영상기를 사용하여 transfection 48시간 후에 모니터링하였다. 이 이미지는 GFP 발현을 기반으로 영향을 받은 sgRNA 염기서열을 보여줍니다.

이 이미지는 비효과적인 sgRNA 염기서열로 인한 GFP 발현의 부족을 보여줍니다. 이 이미지는 대조군 sgRNA를 발현하는 Cre 플라스미드로 E13.5에서 전기천공을 실시한 플록스드 스톱 카세트 및 다운스트림 bicistronic cas9 및 EGFP 서열을 갖춘 p7-rosa26-LSL-cas9 knock-in 마우스에서 소뇌의 GFP, Ki67 및 p27의 면역염색을 보여줍니다. 이 섹션은 DAPI로 카운터 염색됩니다.

Ki67로 표시된 외부 과립 세포층에서 GFP 발현 세포를 주목하십시오. 이 수술은 일단 숙달되면 마우스당 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 배아를 매우 조심스럽게 다루고, 항상 끝이 뾰족한 모세혈관을 사용하고, 전기 펄스가 제4뇌실의 지붕으로 전달될 수 있도록 전극을 정확한 각도로 배치하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

개발 후 이 기술은 의학 분야의 연구자들이 쥐 소뇌의 뇌종양을 포함한 신경 장애의 원인 요인을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.