Name: 젤-seq: DNA와 RNA 히드로 매트릭스를 사용 하 여 동시 시퀀싱 라이브러리 준비를 위한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 배우세요 소량 세포에서 DNA와 RNA 시퀀싱 라이브러리를 동시에 준비하는 젤-seq 방법을 통해 유전체 및 전사체 정보를 효율적으로 얻는 기술을 익히세요.

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이 작품에 대 한 자금 제공에 의해 대학의 샌디에고, 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 프로그램, NIH R01-HG007836, 부여 하 고 한국 정부 과학, 정보 통신 및 미래 계획에 의해 했다.
여러 인물의 이전 버전 "Hoople, G. D. 외 에 처음 출판 되었다 젤-seq: 전체 게놈 그리고 transcriptome 시퀀싱 동시 낮은 입력 DNA와 RNA 라이브러리 준비 반 투과성 히드로 장벽을 사용 하 여. 실험실에 칩 17, 2619-2630, doi:10.1039 / c7lc00430c (2017). " 칩에 실험실이이 발행물에서 그림의 재사용을 허가 했다.

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<li>Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+single-cell+cDNA+amplification+to+provide+a+template+for+representative+high-density+oligonucleotide+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.</a> Nat Protoc. 2 (3), 739-752 (2007).</li>
</ol>

KZ는 공동 설립자 및 Singlera 유전체학 inc의 과학 고문

젤-seq 장치 제조 뿐만 아니라 프로토콜 자체와 관련 된 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 제조, 중 젤의 다양 한 지역에 대 한 소정의 레이어 두께 함께 시작 하는 것이 좋습니다. 우리는 다른 제조 옵션을 테스트 하는 중요 한 시간을 보냈다 고 여기에 설명 된 프로토콜 카세트에 테이블의 재료 및 시 약에대 한 가장 좋은 장치를 생성 합니다. 연구자는 다른 카세트 시스템을 사용 하는 경우 그들은 장치를 만들 때 사용 하는 볼륨을 조정 하는 데 필요한 찾을 수 있습니다. 제조의 주요 과제는 고밀도 젤 영역이 카세트의 가장자리에서 delaminate 하 고 전기 중단 됩니다 카세트의 내부에 공기 주머니를 만들 수 너무 큰 경우. 여러 다른 레이어 볼륨 여러 카세트를 캐스팅 하 여 연구원 신속 하 게 그들의 특정 하드웨어에 대 한 최적의 구성을 확인할 수 있어야 합니다.
젤-seq 프로토콜 또한 프로토콜 완료 되기 전에 유효성을 검사할 수 있는 몇 가...

차세대 시퀀싱 (NGS) 유전학 연구는 실시 방법에 깊은 영향을 했다. 연구원은 한 번 전체 종의 게놈 시퀀싱에 초점을 맞춘, 단일 종양 또는 심지어 한 실험에 있는 단일 셀의 게놈을 시퀀싱 수 지금이. 1 NGS는 또한 했다 비용 효율적인 셀 데이터는 transcriptome로 알려진 컬렉션 내 RNA 사본 시퀀싱 하. 능력을 증폭 하 고 작은 시작 샘플에서 DNA 또는 RNA 시퀀싱만 지난 5 년간에서 달성 되었습니다. 2 , 3 , 4 는 불행 하 게도, 표준 프로토콜 호환 되지 않습니다 하 고 연구원은 주어진된 샘플에 대 한 DNA 또는 RNA 순서를 선택 해야 합니다. 시작 샘플 충분히 큰 경우 반으로 나눌 수 있습니다. 그러나 작은 스케일에서, 샘플 분할로 인해 재료의 손실 라이브러리 품질에 영향을 하 고 셀 사이의 재미 있는 변화 밖으로 평균 수 샘플 풀링. 5 또한, 연구팀은 단일 세포 또는 작은 다른 유형의 종양 생 검 등 분할 수 없는 샘플 검사에 점점 관심이 있습니다. 6
이 문제를 해결 하려면 세 가지 프로토콜 최근 개발 된 동일한 시작 샘플에서 DNA와 RNA 시퀀싱 하: 젤-seq7,8G &amp; T-seq 및 박사-seq9. 이 문서는 젤-seq, 동시에 몇 가지 사소한 추가 비용 100 셀으로에서 DNA와 RNA 라이브러리를 생성 하는 데 사용할 수 있습니다에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 젤-seq의 소설 측면 DNA와 RNA 독점적으로 저가 히드로 매트릭스를 사용 하 여 크기에 따라 분리 하는 기능입니다. 젤-Seq 프로토콜의 핵심 혁신은 RNA에서 DNA의 물리적 분리 이다. 이 분리 electrophoretically polyacrylamide 막이이 분자의 크기 차이 활용 하는의 조합을 사용 하 여 이루어집니다. 맥락에서 이러한 크기 차이 넣어, DNA와 RNA의 이미지로 어떻게 하는 것을 고려: DNA 미크론 단위에 존재 하는 동안 전통적인 현미경을 사용 하 여 볼 수 있습니다, RNA 나노미터 규모로 존재 하 고 cryo 전자 등 복잡 한 기술을 사용 하 여 촬영 해야 합니다 현미경 검사 법입니다. 10
이 프로토콜에서 DNA와 RNA를 분리 하는 접근 방식은 그림 1에 표시 됩니다. 왼쪽된 패널 DNA와 RNA 무료 솔루션 막 근처에 떠 있는 것을 보여줍니다. 전기 분야 적용, 오른쪽 패널에 표시 된 것 처럼, DNA와 RNA는 세포 막을 통해 마이그레이션 유도 전기 이동 힘 경험. 막 속성을 조정 하 여 우리는 RNA에서 DNA를 분리 하는 반 투과성 막을 만들었습니다. DNA 분자는 멤브레인에 대 한 적용 됩니다 하지만 그들의 큰 크기 때문에 가장자리에 얽히게 된다. 작은 RNA 분자, 다른 한편으로, 재구성 고 막 통해 그들의 방법을 짜 다 수 있습니다. Reptation로 알려진이 프로세스는 잔디를 통해 뱀 이동 방법와 비슷합니다. 결국 이러한 RNA 분자는 너무 어려운 작은 고분자에 대 한 두 번째, 고밀도 막 중단 되었습니다 (&gt; 200 기본적인 쌍)을 통해 몸부림. 일단 물리적으로 분리, DNA와 RNA 복구 고 게놈 및 transcriptome에 대 한 정보를 생성 하는 처리. 우리는 DNA와 RNA를 분리할 수 있습니다, 하는 동안 우리는 RNA는 역방향 분리 전에 cDNA를 복사할 경우 더 나은 결과 얻을 수 있습니다 나타났습니다. CDNA/RNA 하이브리드 RNA 혼자 보다 더 안정 되며 저밀도 멤브레인 통해 전달할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig1.jpg"> 그림 1 . 젤-seq 운영 원칙. 육체적으로 DNA와 RNA를 분리 하는 데 사용 하는 기본 원리. 적용 된 전기 분야에서 작은 RNA 분자는 저밀도 막 통해 마이그레이션할 하지만 큰 DNA 분자 표면에 갇혀 있다. 이 그림은 화학의 왕 사회 허가 참고 7에서 재현 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57315/57315fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
이 종이 젤-seq 장치 제조 자세히 설명 하 고 생성 하는 생물 학적 프로토콜 결합 DNA와 RNA 라이브러리. 둘 다에 대 한 개요는 그림 2에 표시 됩니다. 장치는 레이어 링 3 개의 서로 다른 밀도 polyacrylamide 젤 서로 표준 스태킹 젤을 만드는 유사한 과정에 의해 조작 됩니다. 11 생물 학적 프로토콜 100-1000 셀 PBS에 정지로 시작 합니다. 셀 lysed 고 RNA cDNA/RNA 하이브리드에서 게놈 DNA를 분리 하는 장치를 사용 하기 전에 cDNA로 변환 됩니다. 분리 및 복구, 게놈 및 transcriptomic 후 라이브러리 표준 전체 게놈 라이브러리 준비 키트 프로토콜을 다음과 밀접 하 게 하는 프로세스를 사용 하 여 준비가 되어 있습니다. 칩 게시 에 실험실에서 개발 및 젤-seq의 유효성 검사에 대 한 추가 세부 정보를 읽을 수 있습니다 "젤-seq: 전체 게놈 및 동시 낮은 입력 DNA와 RNA 라이브러리 준비 사용 하 여 반 투과성 히드로 장벽을 transcriptome 시퀀싱 ." 7 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig2.jpg"> 그림 2 . 젤-seq 프로토콜. 젤-seq 장치 및 생성 된 쌍을 이루는 DNA와 RNA 라이브러리에 프로토콜을 조작 하는 단계의 개요입니다. 이 그림의 일부는 화학의 왕 사회 허가 참고 7에서 재현 했다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57315/57315fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
단일 세포에서 DNA와 RNA 라이브러리를 생성 하기 위해 연구원은 G &amp; T-seq 또는 박사가 G &amp; T-Seq, 젤-seq 같은 사용 하 여 고려해 야, genomic DNA에서 RNA의 물리적 분리에 의존. 메신저 RNA (mRNA)에 의존 하는이 방법은 3 ' polyadenylated 꼬리 풀 다운 대상으로. mRNA에 자석 구슬을 biotinylated 올리고 dT 프라이 머를 사용 하 여 캡처됩니다. 일단는 mRNA를 캡처한 구슬 자석와 장소에서 개최 되 고 게놈 DNA를 포함 하는 상쾌한 수 있습니다 제거 하 고 다른 튜브로 전송. 이 물리적 분리 완료 되 면 DNA와 mRNA에서 별도 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 그러나 8 이 이렇게 잘 관심의 RNA는 polyadenylated, 그것은 사용할 수 없습니다 ribosomal RNA, tRNA, 또는 RNA 원핵생물에서 같은 비-polyadenylated 증명서를 공부 하 작동 합니다.
박사-seq 같은 튜브에 DNA와 RNA에서 파생 하는 cDNA 증폭 됩니다 사전 증폭 단계에 의존 합니다. 샘플은 다음 둘 하 고 DNA와 RNA seq 라이브러리를 준비 하는 동시에 처리. 게놈 DNA와 RNA에서 파생 된 cDNA 사이 구별, 박사-seq 전산 접근을 걸립니다. 그 중 DNA 또는 RNA에서 유래 수로 exons는 현재 시퀀스 계산 genomic DNA 데이터에 억제 됩니다. 9 는이 방법의 장점은 그 DNA 및 cDNA/RNA 필요 하지 물리적으로 분리 될 젤-seq와 G &amp; T이 이루어집니다. 그러나, 단점은 박사-seq 게놈 및 (즉, introns 대 exons), transcriptome 선험적 지식이 필요 하 고 이상적인 시퀀싱의 핵, 없는 많은 증명서는 아직 완벽 하 게 되지 않을 수도 있습니다. 접합 하 고 여전히 introns를 포함. 12
젤-seq의 소설 측면 DNA와 RNA 크기에 독점적으로 기반으로 셀의 수백에서 분리 하는 기능입니다. 이 메서드는 선험적 지식이 게놈 또는 transcriptome, 불완전 한 접합에 대 한 강력한 이며 폴 리 adenylated 증명서에 국한 되지 않습니다 필요 합니다. 애플리케이션에 연구원 적어도 100 셀 시작할 수 젤-seq 저렴 하 고 널리 사용 가능한 재료를 사용 하 여 간단한 접근을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드 단량체</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A8887-100G</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP 비즈</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>텍스트에서 고체상 가역성 고정화(SPRI) 비드로 언급됨</td></tr><tr><td>DNA 겔 로딩 염료(6x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0611</td><td>본문에서 6X 로딩 염료</td></tr><tr><td>에틸 알코올</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST 원스텝 qRT-PCR 키트</td><td>Kapa BioSystems</td><td>7959613001</td><td>본문에서 2X qPCR mix</td></tr><tr><td>N,N&prime;-Methylenebis(아크릴아미드)로 언급됨&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>146072-100G</td><td>비스-아크릴아미드</td></tr><tr><td>NexteraXT DNA Library Preparation Kit (본문에서는 library preparation kit라고 함)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>포함: TD (본문에서는 transposase buffer라고 함), ATM (본문에서는 transposase로 언급), NT (본문에서는 transposase stop buffer라고 함) 및 NPM (본문에서는 library prep PCR mix라고 함)</td></tr><tr><td>Nuclease Free Water</td><td>Millipore</td><td>3098</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Qiagen</td><td>19155</td><td></td></tr><tr><td>SMART-Seq v4 Kit (본문에서는 전체 전사체 증폭(WTA) 키트라고 함)</td><td>Takara/Clontech</td><td>634888</td><td>포함: 용해 완충액, RNase 억제제, 3' SMART-Seq CDS Primer II A (본문에서는 RT 프라이머), 5X Ultra Low First Strand Buffer (본문에서는 1차 가닥 완충액이라고 함), SMART-Seq v4 Oligonucleotide(본문에서는 템플릿 스위치 올리고뉴클레오티드(TSO)라고 함), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (본문에서는 역전사 효소라고 함) 및 PCR Primer II A (본문에서는 cDNA PCR 프라이머라고 함)</td></tr><tr><td>WTA 어댑터가 있는 무작위 헥사머&nbsp;</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td>5&prime;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3&prime;</td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마 알드리치</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>시그마 알드리치</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>DNA 어웨이 표면 오염 제거</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>7010PK&nbsp; &nbsp;</td><td>본문에서는 DNA 제거 제품이라고 합니다</td></tr><tr><td>Tris-Borate-EDTA 완충액 (10X 농도)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4415-1L</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (DMSO에 10,000X 농축액)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11494</td><td>텍스트에서는 gel stain</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide로 언급됨; 주사기 바늘, 게이지 18</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z192554</td><td>모든 동등한 하드웨어가 허용됩니다</td></tr>. <tr><td>Branson CPX 시리즈 초음파 욕조</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z769363</td><td>모든 동등한 하드웨어가 허용됩니다</td></tr><tr><td>빈 젤 카세트, 미니, 1.0mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC2010</td><td>모든 동등한 하드웨어가 허용됩니다</td></tr><tr><td>.메쉬 필터 플레이트 - Corning&nbsp; HTS Transwell 96 유정 투과성 지지체 - 8.0 &마이크로; m pore size</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3374</td><td>본문에서 8 um mesh filter plate</td></tr><tr><td>PowerPac HC Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td>모든 동급 하드웨어 허용</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td>모든 동급 하드웨어 허용</td></tr><tr><td>Vacufuge Concentrator</td><td>Eppendorf</td><td>22822993</td><td>모든 동급 하드웨어 허용</td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell 시스템</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td>모든 동등한 하드웨어가 허용됩니다</td></tr>. <tr><td>Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195&nbsp;</td><td>동등한 하드웨어가 허용됩니다.</td></tr><tr><td>Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>UVC500-115V</td><td>중단, 모든 동등한 하드웨어가 허용됩니다</td></tr><tr><td>. Gel Doc XR+ Gel Documentation System</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td>텍스트에서 gel imager로 언급</td></tr>됨 <tr><td>Dark Reader Transilluminator</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR89</td><td>텍스트에서 UV transilluminator로 언급됨</td></tr><tr><td>&nbsp; 초음파&nbsp; 배스</td><td>브랜소닉</td><td>1207K35</td><td>이에 상응하는 모든 초음파 수조를 사용할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

젤-seq: dna와 rna 히드로 매트릭스를 사용 하 여 동시 시퀀싱 라이브러리 준비를 위한 방법

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

능력을 증폭 하 고 작은 시작 샘플에서 DNA 또는 RNA 시퀀싱만 지난 5 년간에서 달성 되었습니다. 불행히도, 게놈 생성 또는 transcriptomic 라이브러리에 대 한 표준 프로토콜 호환 되지 않습니다 그리고 연구원은 특정 샘플에 대 한 DNA 또는 RNA 순서를 선택 해야 합니다. 젤-seq 연구원은 DNA와 RNA 100-1000 셀 하이드로 겔 간단한 장치를 사용 하 여 시작에 대 한 라이브러리를 동시에 준비 하 여이 문제를 해결 합니다. 이 종이 짝된 라이브러리를 생성 하는 생물 학적 프로토콜 소자의 제조에 대 한 상세한 접근을 제공 합니다. 우리 설계 젤-seq; 다른 연구자에 의해 쉽게 구현 될 수 있도록 많은 유전학 실험실 이미 젤-seq 장치 제작을 재현 하는 필요한 장비. 우리의 프로토콜 사용 하 여 두 전체 사본 증폭 (WTA)에 대 한 키트 일반적으로 사용 되 고 라이브러리 준비는 연구원에 게 이미 익숙할 것 또한 라이브러리 생성 하 게놈 그리고 transcriptomic에 정통한. 우리의 접근 연구원을 무시할 수 추가 비용와 분할 하지 않고 단일 샘플에 DNA와 RNA 시퀀싱의 힘을가지고 있습니다.

젤-seq 장치에서 gDNA 및 cDNA/RNA 하이브리드의 물리적 분리 형광 젤 영상; 통해 구상 될 수 있다 대표 결과 그림 3에 표시 됩니다. 패널 A 표시 조작된 젤-seq 장치; 거짓 색상 구별 다른 젤 지역에 추가 되었습니다. B 패널의 유효성 검사에 사용 하는 4 개의 다른 분판을 가까이 나타난다. 3 레인, 부정적인 컨트롤 배경 나타내고 인터페이스에서 젤의 아무 autoflourescence는 보여줍니다. 우리는 DNA 사다리와 함께 첫 번째 및 두 번째 차선을 로드. 이 차선 표시 낮은 및 고밀도 세포 막, 작은 조각 저밀도 젤을 통해 전달할 수 있습니다 공개 간의 인터페이스에만 어두운 밴드. 4 레인의 생물 학적 샘플의 동작을 보여 줍니다: 500 PC3 셀. 우리는 프로토콜의 3 단계에서 설명한 대로 레인 4 로드. 이미지는 genomic DNA 및 cDNA/RNA 하이브리드의 분리를 보여줍니다. ...

젤-seq 연구자를 준비가 동시에 라이브러리에 대 한 두 DNA-및 RNA-seq 간단한 히드로 장치를 사용 하 여 100-1000 셀에서 시작 하는 무시할 수 추가 비용 있습니다. 이 종이 짝된 라이브러리를 생성 하는 생물 학적 프로토콜 소자의 제조에 대 한 상세한 접근을 제공 합니다.

젤-seq: DNA와 RNA 히드로 매트릭스를 사용 하 여 동시 시퀀싱 라이브러리 준비를 위한 방법

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

이 실험의 전반적인 목표는 어떤 지점에서도 샘플을 분할하지 않고 작은 세포 집단의 DNA와 RNA 모두에서 차세대 염기서열분석 라이브러리를 생성하는 것입니다. 이 방법은 연구자들에게 유전자 발현에 대한 DNA의 구조적 변이를 연구할 수 있는 새로운 접근 방식을 제공합니다. 우리가 처음 Gel-seq를 생각했을 때, 동일한 샘플에서 DNA와 RNA를 동시에 염기서열분석하기 위한 프로토콜이 없었습니다.다행히도 이 문제를 해결하는 세 가지 접근 방식이 발표되었습니다. 이 기술의 주요 장점은 게놈 및 전사체 정보를 모두 동일한 세포 세트에서 얻을 수 있으므로 추가 비용을 무시할 수 있다는 것입니다. Gel-seq는 원래 직립 카세트로 개발되었지만, 이 프로토콜은 모든 표준 겔 전기영동 카세트와 함께 작동하도록 조정할 수 있습니다.filler, high density 및 low density 전구체 혼합물을 3개의 tube에 준비합니다. 설명된 순서대로 시약을 추가하고 혼합물을 와류로 만듭니다. APS 또는 Temed를 조기에 추가하지 마십시오.지시할 때까지 기다리십시오. 다음으로, 먼저 캡을 통해 바늘을 삽입하여 각 겔 단량체 용액의 가스를 제거합니다. 그런 다음 바늘을 가정용 진공 라인에 연결하고 이 어셈블리를 울트라 음속 욕조에 담그십시오.액체에서 더 이상 거품이 나오지 않을 때까지 약 1분 정도 기다립니다. 다음으로, 필러 전구체 혼합물에 Temed와 APS 및 vortex를 간단히 첨가합니다. 3분 이내에 1mm 피펫을 사용하여 흘리지 않고 각 젤 카세트에 6mm를 추가합니다.카세트를 수평 테이블에 똑바로 세워 유체가 수평인지 확인하십시오. 그런 다음 가스가 제거된 이온화된 물로 카세트를 점차적으로 채우고 중합 혼합물과 물의 혼합을 최소화하도록 주의하십시오. 그런 다음 폴리머가 한 시간에서 하룻밤 동안 경화되도록 합니다.폴리머가 경화되면 물 오버레이를 버리고 6인치 떨어진 곳에서 압축 공기를 부드럽게 사용하여 젤 표면을 건조시킵니다. 다음으로, Temed와 APS를 고밀도 겔 전구체에 첨가하고 간단히 와류를 일으킵니다. 3분 이내에 320마이크로리터를 각 카세트에 옮기고 카세트를 앞뒤로 몇 번 흔들어 필러 젤 층에 펴 바릅니다.그런 다음 탈이온되고 탈기된 물로 카세트를 덮고 폴리머가 약 한 시간 동안 경화되도록 합니다. 경화되면 이전과 같이 폴리머를 건조시킵니다. 마지막으로, 저밀도 겔 전구체 혼합물에 Temed 및 APS를 첨가하고 와류에 넣습니다.그런 다음 나머지 카세트를이 혼합물로 빠르게 채우고 경화가 시작되기 전에 젤 빗을 삽입하십시오. 이제 중합 중에 흡착될 빗 위에 여분의 예비 전구체를 추가합니다. 경화 후 카세트를 사용할 수 있습니다.RNA를 cDNA로 전환한 후 젤을 사용하여 관심 부분을 회수합니다. 먼저 몇 밀리리터의 DNA 제거 제품과 보푸라기가 없는 물티슈를 사용하여 전기영동 챔버를 철저히 청소합니다. 그런 다음 챔버를 깨끗한 영점 5 XTBE로 채우고 전체 장치를 254나노미터의 UV 가교 오븐에 넣고 15분 동안 살균합니다.이제 Gel-seq 카세트를 전기영동 챔버에 삽입하고 제자리에 고정합니다. 그런 다음 젤을 찢지 않고 부드럽게 위로 당겨 젤 빗을 천천히 제거합니다. 이제 피펫을 사용하여 샘플을 로드합니다.s를 적재할 때 팁을 well에 완전히 삽입하십시오.amp웰 사이의 오염 가능성을 최소화하기 위해amples. 30분 동안 Gel-seq 카세트에 250볼트의 전기장을 가하여 cDNA/RNA 하이브리드에서 gDNA를 분리합니다. 젤을 로드, 실행 및 수집한 후 메스를 사용하여 고밀도 층 바로 아래에서 젤을 반으로 자르고 필러 젤을 절반으로 버립니다.그런 다음 긁는 도구를 조심스럽게 사용하여 카세트에서 남은 젤을 부드럽게 떼어냅니다. gel doc을 사용하여 분리를 확인한 후 transilluminator를 사용하여 밴드를 절제합니다. gDNA는 저밀도 겔의 시작 부분에 위치해야 하며 cDNA는 저밀도 영역과 고밀도 영역의 경계면에 있어야 합니다.이제 메스를 사용하여 gDNA와 cDNA가 포함된 겔 영역을 잘라냅니다. 또한 네거티브 컨트롤 레인에서 동일한 섹션을 제거하십시오. 무딘 핀셋을 사용하여 젤 부분을 스트립 튜브로 부드럽게 옮깁니다.젤이 깨지면 깨진 모든 조각을 찾아 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 원을 그리며 각 젤을 갈아주고 피펫 팁으로 누릅니다. 팁을 제거하기 전에 gDNA에 40마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 추가하고 cDNA 샘플에 80마이크로리터를 추가합니다.그런 다음 팁을 조심스럽게 제거하고 버리십시오. 이제 스트립 튜브를 섭씨 37도의 와류 믹서에 고정하고 8-12시간 동안 흔듭니다. 따라서 DNA는 겔에서 빠져나갈 것입니다.흔든 후 샘플을 8미크론 메쉬 필터 플레이트에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 2, 600g에서 5분 동안 플레이트를 회전시켜 젤 조각을 걸러냅니다. 그런 다음 하우징 플레이트에서 메쉬 필터 플레이트를 들어 올리고 피펫을 사용하여 플레이트의 젤 프리 샘플을 새 200마이크로리터 스트립 튜브로 옮깁니다.gDNA가 포함된 각 샘플에 1마이크로리터의 프로테아제를 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 잘 섞습니다. 그런 다음 섭씨 50도에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 그 후 섭씨 70도에서 15분 동안 가열합니다.이 뉴클레오솜 고갈 단계는 매우 중요합니다. 그런 다음 18게이지 바늘을 사용하여 모든 샘플 튜브의 캡에 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 진공 분리기를 사용하여 gDNA 샘플을 5마이크로리터로, cDNA 샘플을 10마이크로리터로 줄입니다.부피가 타겟 이하로 떨어지면 필요에 따라 뉴클레아제가 없는 물을 첨가합니다.gDNA 및 cDNA/RNA 하이브리드는 Gel-seq 장치를 사용하여 물리적으로 분리되었습니다. negative control은 계면에서 겔의 자동 형광이 없습니다.DNA ladder는 저밀도 멤브레인과 고밀도 멤브레인 사이의 계면에서 어두운 띠만 보여주며, 이는 작은 조각이 저밀도 겔을 통과할 수 있음을 보여줍니다. 500개의 PC3 세포에서 채취한 생물학적 샘플은 게놈 DNA와 cDNA/RNA 하이브리드의 원하는 분리를 보여줍니다. 저밀도 멤브레인 상단의 어두운 띠는 메가베이스 규모의 게놈 DNA이고 cDNA/RNA 하이브리드는 저밀도 영역과 고밀도 영역의 계면에 쌓여 있습니다.작은 sub-100 염기쌍 단편은 역전사 중 프라이머 올리고뉴클레오티드에서 생성된 오프 타겟 산물이며 예상할 수 있습니다. 라이브러리는 500개의 PC3 세포 또는 750개의 HeLa 세포에서 생성되었습니다. Gel-seq에서 생성된 일치하는 라이브러리의 단편 분포를 표준 프로토콜로 생성된 일치하지 않는 샘플과 비교했습니다.뉴클레오티드 단편의 분포는 두 방법 모두에서 유사했습니다. PC3 세포 라이브러리의 염기서열분석 결과를 기존 방법과 비교했습니다. 게놈 전체 복제 수 변이를 비교했습니다.통계적으로 두 방법은 유사한 결과를 얻었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 동일한 시작 샘플에서 DNA와 RNA 모두에 대해 쌍을 이루는 차세대 염기서열분석 라이브러리를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 모든 저입력 염기서열분석 실험과 마찬가지로 깨끗한 작업 환경을 유지하는 것을 기억해야 합니다.살균 튜브와 청소용 장갑에 세심한 주의를 기울여야 합니다. 이러한 예방 조치에도 불구하고 오염으로 인해 실험이 실패하는 경우가 있습니다. 중요한 점은 폴리아크릴아미드 겔의 편재성과 안전성으로 인해 제조 전구체가 위험한 신경독이라는 사실을 쉽게 잊을 수 있다는 것입니다.항상 흄 후드에서 이러한 시약으로 작업하고 엎질러진 모든 것을 즉시 청소해야 합니다. 우리는 Gel-seq를 연구자들이 자신의 실험실에서 간단하게 구현할 수 있도록 설계했으며, 이를 통해 이 기술의 빠른 채택을 촉진할 수 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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