Name: 암에 성적표를 매핑할 CDNA의 급속 한 확대 끝 적응 3 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 배우세요 암 세포주에서 mRNA 서열을 매핑하는 3' RACE 기법을 활용한 방법입니다. 중첩 프라이머와 PCR을 통해 종양 특이 융합 유전자 및 스플라이스 변이체를 식별하여 암 진단 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 그녀의 기술 도움 Bettine 깁스를 인정 하 고 싶습니다.

이 프로토콜에서 모든 절차를 수행 하는 동안 항상 실험실 외 투, 장갑, 그리고 안전 유리를 착용. 용기/튜브 포함 된 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 시 약만 인증된 후드, 그리고 지정 된 컨테이너에 페 놀 폐기물의 처분에 열려 있는지 확인 합니다. 무 균 튜브 DNAse/RNAse 무료, 팁, 그리고 시 약을 사용 합니다.
1. 세포 배양
<ol><li>헬러 세포 선 및 두 정지 맨 틀 세포 림프 종 셀 라인, Granta-519 및 Jeko-1, 10% 포함 된 DMEM 성장 FBS와 37 ° c.에 5% CO2 습도 인큐베이터에서 100 U/mL 페니실린/스 셀 1시 10분 희석 및 입자 카운터14를 사용 하 여.</li>
	<li>RNA 추출, 셀/잘 6 잘 플레이트 (잘 당 2 mL 미디어)에 50만 플레이트. 24 h에 대 한 보육, 후 세포에서 RNA를 수집 합니다.</li>
</ol>2. RNA 추출
<ol><li>세포를 수확 참고: 원심 분리 단계를 제외 하 고 불 임을 유지 하기 위해 조직 문화 후드에 나열 된 모든 단계를 수행 합니다.<ol>
<li>현 탁 액 셀 (Jeko-1 및 Granta-519):<ol>
<li>15 mL 튜브를 (함께 미디어의 2 개 mL) 셀을 전송 하 고 5 분 Aspirate는 미디어에 대 한 1,725 x g에서 원심 튜브의 아래쪽에 셀 펠 릿을 두고.</li>
			<li>1 인산 염 Buffered 식 염 수 (PBS) x 50 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend. 각 샘플 1.5 mL microcentrifuge 관에서 monophasic 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 시 약의 500 µ L를 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 두고 5 분 동안 실내 온도 (RT) microcentrifuge 튜브를 반전 하는 동안 모든 1 분.</li>
		</ol>
</li>
		<li>부착 세포 (HeLa)에 대 한:<ol>
<li>각 우물에서 세포 배양 발음 각 잘 씻어 파편을 PBS의 1 mL를 추가 합니다.</li>
			<li>PBS를 제거 하 고 각 잘 500 µ L monophasic 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 시 약의 추가.</li>
			<li>부드러운 락으로 5 분 동안 RT에서 품 어. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 전송.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 세포의 용 해<ol>
<li>1 시간 동안-20 ° C에서 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 셀 혼합물을 고정 합니다. 참고: 필요한 때까지 또는-20 ° C 하룻밤에 믹스를 남아 있을 수 있습니다.</li>
		<li>페 놀 및 guanidine isothiocyanate 셀 혼합 얼음에 녹여 PCR 후드에서 microcentrifuge 튜브에 클로 프롬의 100 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 혼합물까지 10-15 s에 대 한 샘플은 핑크와 불투명. (4 ° C)에서 15 분 동안 얼음에 샘플을 품 어.</li>
		<li>원심 20,800 x g와 4 ° C에서 15 분에 대 한 샘플 위 무색 수성 단계를 조심 스럽게 제거 (~ 200 µ L) 및 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNA 강 수<ol>
<li>각 샘플에 소 프로 파 놀의 동일한 볼륨을 추가 합니다. Coprecipitant의 1 µ L 추가 ( 재료의 표참조) 각각 샘플링 하는 RNA에 대 한 캐리어로 고 이후 단계에서 RNA를 시각화 하는 데 도움이. 적어도 4 h-80 ° C에서 샘플을 품 어. 최상의 결과 얻으려면 밤새-80 ° c.에 품 어</li>
		<li>냉각된 원심 분리기 샘플 전송. 35 분 20,800 x g에서 원심 분리기 / 4 ° C; RNA는 튜브의 하단에 푸른 반점으로 나타납니다. 조심 스럽게 샘플에서는 소 프로 파 놀을 제거. 80% 에탄올 500 µ L을 추가 하 고 간단히 3 vortexing에 의해 펠 릿 resuspend s.</li>
		<li>원심 분리기 샘플 RT에서 20,800 x g에서 5 분에 대 한 샘플에서 모든 에탄올을 제거 합니다. 하자 샘플 약 10 분 Resuspend 샘플 RNAse 무료 물 35 µ L에 대 한 건조. RNA가 완전히 솔루션을 보장 하기 위해 5 분 동안 열 블록 (65 ° C)에 배치 하 고 즉시 얼음에 튜브를 놓습니다.</li>
		<li>앞에서 설명한, 1 µ L15대신 RNA 샘플의 1.5 µ L를 사용 하 여 제외 하 고는 분 광 광도 계를 사용 하 여 전체 RNA의 농도 결정 합니다. 필요에 따라 RNA 무결성을 확인 하는 1 %agarose 젤에 총 RNA의 1 µ g를 실행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. DNase 치료
<ol><li>RNA의 정량화, 후 어떤 genomic DNA 저하 총 RNA에 DNAse 치료를 수행 합니다. 각 샘플에 대 한 별도 microcentrifuge 튜브에서 믹스 20 µ L 총 반응 수 있도록 RNAse 무료 DNAse 키트에서 다음과 같은 시 약을 추가:<ol>
<li>믹스 2 µ L DNase 10의 반응 버퍼 X 총 RNA의 4.4 µ g. 물으로 14 µ L의 총을가지고.</li>
		<li>2 µ L의 RNase 무료 DNAse 추가 합니다. (반전 전사 Kit)에서 RNase 억제제의 2 µ L의 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>열 블록 DNAse 효소 비활성화를 70 ° C에서 10 분 동안에 중지 솔루션 및 열 2 µ L를 추가 합니다. 참고: DNAse 치료 선택 사항입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. cDNA 합성
50 µ L의 최종 반응 볼륨:
<ol><li>50 µ L의 최종 반응 볼륨: 전송 22 µ L는 DNase의 새로운 튜브, 또는 전송 4 µ g 새 튜브를 22 µ L의 총 볼륨에 추가 된 물 총 RNA의 RNA 취급. 10 µ M 뇌관 솔루션에서 T7 올리고 dT25 뇌관의 2 µ L를 추가 합니다. T7 올리고 dT25 뇌관을 위한 순서는 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.</li>
	<li>반전 녹음 방송에서 키트 RNase 억제제 (20 U / µ L)의 2 µ L, 5 배 반응 버퍼의 8 µ L, 10 mM dNTPs의 4 µ L 및 역전사 (200 U / µ L)의 2 µ L를 추가 합니다. 주: 부정적인 컨트롤 역할 없이 역전사 반응을 설정.</li>
	<li>1 헤 얼음에 직접 전송에 대 한 42 ° C에서 품 어. 5 분 동안 75 ° C에 튜브가 열 하 고 얼음에 튜브를 놓습니다.</li>
</ol>5. 뇌관 융합 유전자 사본에 대 한 검색
<ol><li>
뇌관 디자인
	<ol>
<li>앙상블 게놈 브라우저 (ENST00000360839.6/NM_017747)에서 cDNA 순서를 다운로드 하 고 대상 (ANKHD1) 상류의 사본 정지 codon의 ORF 내의 영역을 식별. 복사 및 붙여넣기 뇌관 디자인 소프트웨어의 시퀀스 항목 영역으로 정지 codon의 상류 시퀀스를 포함 하는 전체 지역 (최대 700 뉴클레오티드) (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).</li>
		<li>표시 사용자 지정 디자인 옵션을 선택 하 고 선택 뇌관의 수에 대 한 10 시스템 (반환 결과)를 생성 한다 고 모든 다른 매개 변수를 기본값으로 설정.</li>
		<li>5 앞으로 프라이 머와 오버랩 되지 않는 2 개의 반전 뇌관을 선택 합니다. 뇌관을 주문 하 고 10 µ M의 최종 농도에 RNAse/DNAse 무료 물으로 다시 구성 하기. PCR 위한 뇌관 일반적인 디자인에 대 한 자세한 내용은 다른 덮여 있다16.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
후속 3' 경주에 사용에 대 한 잠재적인 뇌관을 식별 하는 PCR 참고: 반응에 사용 하 여 마지막 앞으로 뇌관을 확인 하려면 일반 PCR PCR 후드에 대 한 정방향 및 역방향 뇌관의 다른 조합을 설정 하 여 설계 된 뇌관을 테스트 합니다.<ol>
<li>신선한 0.5 mL PCR 튜브에 cDNA (2 µ L)를 전송 합니다. 앞으로 뇌관의 1 µ L (10 mM 뇌관 솔루션)에서 역방향 뇌관의 1 µ L를 추가 합니다. Nuclease 무료 물 8.5 µ L을 추가 하 여 최대 12.5 µ L를 확인 합니다. 젤에 PCR 주인 혼합 x 2의 12.5 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>다음 PCR 열 사이클링 조건을 사용: 95 ° C 30에 대 한 29 주기 뒤에 2 분 동안 95 ° C s, 60 ° C 30에 대 한 s, 그리고 7 분 동안 68 ° C에서 최종 주기를 설정 1 분에 72 ° C.</li>
		<li>PCR, 후 ethidium 평범한 사람으로 물 1 %agarose 젤에는 제품을 실행 합니다. 전기 이동 법의 세부 사항은 이전 몇 가지 수정17설명 합니다.<ol>
<li>Agarose 250 mL 플라스 크에 트리 아세테이트 (태) 버퍼의 100 ml에서의 1 g을 분해. 전자 레인지에 끓인 다.</li>
			<li>1 분 동안 냉각 하 고 증기 두건에서 7.5 µ L ethidium 평범한 사람 해결책 (10mg/mL 주식)의 추가를 떠나. 플라스 크를 소용돌이로 잘 혼합 하 고 수평 젤 기구에 부 어. 응고를 젤 수 있도록 30 분 이상 증기 두건에서 RT에 둡니다.</li>
			<li>1 x TAE 버퍼와 젤을 커버 하 고 DNA 분자량 사다리의 3-5 µ L 함께 agarose 젤에 PCR 제품의 10 µ L를 로드 합니다. 10 분 시각화는 영상 장치를 사용 하 여 제품에 대 한 175 V에서 실행 하 고 추가 제품의 분리가 필요한 경우, 추가 5-10 분에 대 한 젤을 실행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3' 레이스에 대 한 중첩 된 뇌관의 선택
	<ol>
<li>PCR agarose 젤 별개, 강한, 단일 PCR 밴드 프라이 머 선택의 결과 분석 합니다. 5'-대부분 뇌관을 사용 하 여 (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') 실행 하는 첫 번째 PCR에 T7 oligodT25 입문서와 함께.</li>
		<li>첫 번째 뇌관의 하류에 있는 중첩 된 뇌관을 선택 (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3'), T7 뇌관으로 그것을 사용 하 여 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') PCR 반응의 두 번째 세트에서.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 최적화 3' 3' UTR 두 개의 서로 다른 효소를 사용 하 여 지도를 경주
참고: 계속 있다 DNA polymerases PCR;에 대 한 사용의 다양성 증가 따라서, 우리는 3' 경주 PCR 반응에 대 한 다른 효소를 사용 하는 경우에 적용 될 수 있는 표준 조건을 확인 싶 었 어 요. 어떤 사본에 대 한 역방향 뇌관; 일정 하 게 유지 됩니다. 유일한 변화는 중첩된 앞으로 뇌관 대상 성적에 대 한 관련 된에 있습니다.
<ol><li>
1: 3 프로토콜 ' Pyrococcus furiosus (Pfu) 에서 수정 된 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 경주
	<ol>
<li>첫 번째 PCR<ol>
<li>PCR 튜브에 cDNA의 1 µ L를 전송 하 고 10 x Pfu 반응 버퍼의 5 µ L를 추가 합니다. (10 m m 솔루션)에서 첫 번째 중첩된 앞으로 뇌관의 1 µ L, T7 oligodT25 뇌관의 1 µ L 및 dNTPs의 1 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>물 40 µ L을 추가 하 여 최대 49 µ L 총 볼륨을 확인 합니다. Pfu DNA 중 합 효소의 1 µ L을 추가 하 고 잘 혼합. 표 1에 PCR 프로 파일을 사용 하 여 PCR을 실행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>두 번째 PCR<ol>
<li>첫 번째 PCR에서 새로운 PCR 튜브 제품의 2 µ L를 전송 하 고 5 µ L 10 x Pfu울트라 II 반응 버퍼의 혼합. 두 번째 중첩 된 PCR 뇌관의 1 µ L, T7 뇌관의 1 µ L 및 dNTPs (10 m m 솔루션)의 1 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>물 39 µ L을 추가 하 여 최대 49 µ L 총 반응 볼륨을 확인 합니다. Pfu DNA 중 합 효소의 1 µ L를 추가 합니다. 첫 번째 PCR 설치 (표 1)로 같은 PCR 프로 파일을 사용 하 여 PCR을 실행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2: 3 프로토콜 '는 공상 DNA 중 합 효소 Pyrococcus를 융합 하는 DNA 바인딩 도메인의 구성을 사용 하 여 경주-중 합 효소는 PCR 마스터 믹스 교정 처럼
	<ol>
<li>첫 번째 PCR<ol>
<li>PCR 튜브에 cDNA의 1 µ L를 전송. 첫 번째 중첩된 앞으로 뇌관의 1 µ L T7 oligodT25 뇌관의 1 µ L를 추가 합니다. 물 22 µ L을 추가 하 여 최대 25 µ L를 확인 합니다.</li>
			<li>PCR 마스터 믹스 x 2의 25 µ L을 추가 하 고 잘 혼합. 표 2에 설명 된 PCR 순환 상태를 사용 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>두 번째 PCR<ol>
<li>첫 번째 PCR에서 새로운 PCR 튜브 제품의 2 µ L를 전송. T7 역방향 뇌관의 1 µ L 함께 두 번째 중첩 된 PCR 뇌관의 1 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>물 22 µ L을 추가 하 여 최대 25 µ L를 확인 합니다. PCR 주인 혼합 X 2의 25 µ L를 추가 합니다. 첫 번째 PCR 설치 (표 2)로 같은 PCR 프로 파일을 사용 하 여 PCR을 실행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 3' 경주의 두 번째 PCR 제품을 확인 하십시오.
<ol><li>받아 5-10 µ L의는 두 번째 PCR 제품 (PCRs 사본을 풍부 하 게 표현 하는 경우의 첫 번째 라운드에서 제품) 고는 agarose 젤에 실행 합니다. 젤 고 앞에서 설명한 전기 (5.2.3.1 5.2.3.3 단계)를 실행 합니다. 영상에 결과 시각화 한다.</li>
</ol>8. 제품 정화 및 시퀀싱
<ol><li>젤 PCR 파편 DNA 청소 시스템을 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 두 번째 PCR에서 젤 PCR 제품을 정화.</li>
	<li>수행 생어 시퀀싱 (또는 젤 정화 PCR 제품 샘플 및 시퀀싱 실험실에 적절 한 시퀀싱 뇌관 보낼). 후 생어 시퀀싱 데이터 분석 순서.</li>
	<li>시퀀스 분석 소프트웨어 다운로드 ( 재료의 표참조) 소프트웨어에 추적 파일을 가져옵니다. 개별 순수 베이스 QVs (품질 값) 기지를 사용 하 여 전화 정보18. 보기에 대 한 높은 품질 추적으로 크로마 다운로드. 선택 사항: 젤 정화 제품 수 복제 될 적절 한 복제 키트와 격리 된 클론 생어에 대 한 전송 사용 하 여 연속.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

대규모 병렬 시퀀싱 기술, 유전자에 의해 유전자 기준의 출현에도 불구 하 고 3' 경주 여전히 남아 있다 파 및 많은 꼬리에 인접 한 뉴클레오티드를 식별 하기 위해 쉽고 가장 경제적인 방법. 여기에 설명 된 적응을 증폭 ORF, 정지 codon 그리고는 전체 3' UTR ANKHD1 mRNA 사본 중의 일부를 포함 하는 시퀀스를 지도 3' 레이스 사용 하 여 확장 합니다. 3' 경주의 주요 이점은 그 몇 가지 사소한 조정으로 3' 경주에서 제품 수 복제 함수의 3' UTR 미르 타겟팅, 안정성 분석으로 다른 기계적 분석을 포함 한 다운스트림 심문을 촉진 하기 위하여 다른 벡터에 이다. 이 중첩 된 뇌관 시퀀스9,10금지 효소 사이트를 포함 하 여 수행할 수 있습니다. 조정만는 3' UTR 3' UTR 기능 분석 실험5복제 ORF에서 어떤 순서 없이 포함 하도록 만들 ...

3' 끝의 형성은 사전-mRNA의 하류 ~ 250 untemplated adenines 많은 꼬리1,2를 구성 하는 추가 다음 파의 분열을 구성 하는 mRNA 성숙에 중요 한 단계입니다. 많은 의무적인 단백질 (PABP) 많은 꼬리를 한다이 저하에서 mRNA 사본 보호 하 고 번역1을 용이 하 게 한다.
현재 견적 인간 유전자의 70% 여러 패스, 따라서 여러 3' 끝3인 양자 택일 polyadenylation 받아야 좋습니다. 따라서, 많은 꼬리의 3' UTR, 나머지 연결 식별 어떤 주어진된 대 본에서 사용 하는 파를 식별 하는 것이 중요 하다. 차세대 시퀀싱의 출현 Utr 및 유전자의 수천의 패스의 3' 동시 식별에 결과 있다. 시퀀싱 기능에 있는이 증가 bioinformatic 3' 끝의 양자 택일 polyadenylation 관련 데이터를 분석 하는 알고리즘의 개발을 요구 했다. 드 노 보 탐지 또는 유효성 검사는 파의 및 그러므로 대규모 시퀀싱 데이터에서 개별 유전자의 3' 끝의 매핑, 3' 경주 남아 선택4,5의 방법. 3' 경주의 cDNA 제품에 일반적으로 포함 하는 시퀀스의 3' UTR 많은 꼬리, 분열 사이트, 우선권, 및 상류는 파의 순서에 있는 부분에만 포함 됩니다. 디자인 및 유전자 특정 앞으로 역 뇌관의 사용 필요, PCR와 달리 3' 레이스만 요구 한다 2 개의 유전자 특정 중첩된 앞으로 뇌관을. 따라서, PCR 증폭된4,6되 고 유전자의 큰 영역의 뉴클레오티드 순서의 더 상세한 지식이 필요 합니다. 3' 레이스 사용 같은 뇌관 그 목표는 많은 모든 polyadenylated RNA 사본에 대 한 꼬리, 앞으로 뇌관 될 필요가 유전자 특정, 따라서,만 요구 하는 mRNA의 크게 작은 영역의 지식 역. 그 시퀀스는 완전히 특징이4,7영역의 확대 수 있습니다. 이 수 있다 3' 경주 뿐만 아니라, 유전자의 3' 끝을 결정 하지만 또한 결정 하 고 큰 지역 상류의 3' UTR 상당 부분을 형성 하는 파의 특성 사용. 5'는 수정 3' 3' UTR의 큰 부분 및 측면에 서 지구를 포함 하는 레이스와 레이스를 결합 함으로써 완전히 순서 또는 그것의 3' 끝85' 끝에서 한 전체 mRNA 사본 복제 가능 하다.
이 응용 프로그램의 수정 3' 레이스의 예는 소설 CCND1 MRCK 융합 유전자 사본 맨 틀 세포 림프 종 세포 선 암 환자에서의 최근 id입니다. 3' UTR CCND1 및 MRCK 유전자에서 시퀀스의 구성 그리고 미르 규정9완강히 저항 했다. 두 개의 중첩 된 CCND1 특정 앞으로 뇌관 즉시 인접 하 고 CCND1 정지 codon의 하류 지역에 보완 했다. 금융 자원 또는 수 있도록 bioinformatic 전문 많은 연구소 있습니다 부족 특정 bioinformatic 도구 함께 전체 transcriptome 시퀀싱 3' UTR10유전자 융해를 감지 사용할 수 있습니다, 있지만이 기술의 사용. 따라서, 3' 레이스 드 노 보 식별 및 소설 퓨전 유전자 포함 3' UTR의 유효성 검사에 대 한 대안 이다. 고려는 과감 한 보고 융합 유전자의 수에 있는 증가 뿐 아니라 성적 증명서를 통해 읽기, 3' 경주 되고있다 유전자 시퀀스11,12특성화에 강력한 도구. 또한, 최근 연구의 3' UTR 길이 뿐 아니라 3' UTR에서 서로 다른 시퀀스를 영향을 미칠 수 mRNA 사본 안정성, 현지화, translatability, 및 기능13나타났습니다. 때문에 부분 관심 증가 transcriptome 매핑, 실험실에서 사용 하기 위해 개발 되 고 다른 DNA polymerases의 증가 되었습니다. 그것은 어떤 유형의 수정 할 수 있다 3 ' 경주 프로토콜에서 DNA polymerases 사용할 수 있는 레 퍼 토리를 활용 하기 위해서는 결정 해야 합니다.
이 작품 보고 적응 3' 경주에 매핑하는 전체 3' UTR, 우선권, 및 3' 끝 분열의 사이트를 사용 하 여 ANKHD1 사본 중첩 사본 및 두 개의 서로 다른 DNA polymerases의 ANKHD1 섹션에서 뇌관.

<table><tbody><tr><td>HeLa 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>자궁경부암 세포주.</td></tr><tr><td>Jeko-1 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>맨틀 세포 림프종 세포주.</td></tr><tr><td>Granta-519 세포</td><td>DSMZ</td><td>ACC-342</td><td>맨틀 세포 림프종 세포주.</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>시그마 Aldrich</td><td>F6178</td><td>세포 배양을 위한 소 태아 혈청.</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15140122</td><td>항생제 및 항진균제.</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9545</td><td>침전제.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>10569044</td><td>GlutaMAX를 함유한 Gibco 브랜드 세포 배양 배지입니다.</td></tr><tr><td>뉴클레아제 자유수</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>AM9938</td><td>Ambion DNase 및 RNAse 자유수(비DEPC 처리).</td></tr><tr><td>둘베코' s 인산염 완충 용액</td><td>Corning</td><td>21-030</td><td>1X PBS.</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마&nbsp; Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>2-프로판올</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>시약 알코올</td><td>시그마 Aldrich</td><td>793175</td><td>에탄올</td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15596026</td><td>Monophasic phenol 및 guanidine isothiocyanate 시약.</td></tr><tr><td>2X Extender PCR-to-Gel 마스터 믹스</td><td>Amresco</td><td>N867</td><td>2X PCR-to-Gel 마스터 믹스&nbsp; 일상적인 빠른 PCR 분석 및 프라이머 검색에 사용되는 로딩 염료를 포함하고 있습니다.</td></tr><tr><td>10mM dNTP</td><td>Amresco</td><td>N557</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Dnase 치료 키트.</td></tr><tr><td>Gel Loading Dye Orange (6X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>F531S</td><td>2X PCR MasterMix는 Pyrococcus-like 교정 중합효소 및 기타 시약에 융합된 DNA 결합 도메인으로 구성된 키메라 DNA 중합효소를 포함합니다.</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA 중합효소</td><td>Agilent Technologies</td><td>600670</td><td>Pyrococcus furiosus(Pfu)의 변형된 DNA 중합효소.</td></tr><tr><td>RevertAid RT 역전사 키트</td><td>Thermo Fischer</td><td>K1691</td><td>mRNA의 cDNA 합성에 사용됩니다. 키트에는 다음이 포함됩니다&nbsp; Ribolock RNAse 억제제, RevertAid M-MuLV 역전사효소 및 원고에 등재된 기타 시약.</td></tr><tr><td>Pefect 크기 1Kb 사다리</td><td>5 프라임</td><td>2500360</td><td>분자량 DNA 사다리.</td></tr><tr><td>Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>브롬화 에티듐 염색 아가로스 겔을 시각화하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>저분자량 사다리</td><td>New England BioLabs</td><td>N3233L</td><td>분자량 DNA 사다리.</td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>MidSci</td><td>VM-3200</td><td></td></tr><tr><td>미니 원심분리기</td><td>MidSci</td><td>C1008-R</td><td></td></tr><tr><td>건식 수조</td><td>MidSci</td><td>DB-D1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000C</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>ND-2000C</td><td>분광 광도계.</td></tr><tr><td>와이드 미니 서브&nbsp; Cell GT 수평 전기영동 시스템</td><td>BioRad</td><td>1704469</td><td>전기영동 장비 - 겔 설정</td></tr><tr><td>장치 PowerPac 기본 전원 공급 장치</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>겔 전기영동을 위한 전원 공급 장치.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Dot Scientific</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler 그라디언트</td><td>Eppendorf</td><td>950000015</td><td>PCR 열순환기.</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel 및 PCR Fragment DNA Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Zero Blunt TOPO PCR 클로닝 키트, 원샷 포함&nbsp; TOP10 화학적 적성 대장균 세포</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>K280020</td><td></td></tr><tr><td>MyPCR 준비 스테이션 Mystaire</td><td>MidSci</td><td>MY-PCR24</td><td>PCR 작업 전용 후드.</td></tr><tr><td>Hamilton SafeAire II 흄 후드</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td>흄 후드.</td></tr><tr><td>벡크만 쿨터 Z1&nbsp; 입자&nbsp; 카운터</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td>입자 카운터. 도금 전 세포 계산용&nbsp; RNA 추출을 위해.</td></tr><tr><td>Applied Biosystems 염기서열 스캐너 소프트웨어 v2.0</td><td>Applied Biosystems(ThermoFisherScientific을 통해)</td><td></td><td>Sanger 염기서열분석 데이터를 분석하는 소프트웨어.</td></tr></tbody></table>

암에 성적표를 매핑할 cdna의 급속 한 확대 끝 적응 3'

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

진 핵 mRNAs의 성숙 3' 끝 형성을, 많은 꼬리의 추가 포함 하는 포함 한다. 유전자의 3' 끝, 지도 하기 위하여 선택의 전통적인 방법은 cDNA 끝 (3' 경주)의 3' 급속 한 확대 이다. 3' 레이스에 대 한 프로토콜 설계 및 관심의 대상 유전자의 3' 되지 않은 지역 (3' UTR) 내에서 중첩 된 뇌관의 선택을 요구 한다. 그러나, 몇 가지 수정 프로토콜 포함 전체 3' UTR 및 ORF와 3' UTR 사이의 관계의 더 포괄적인 그림을 제공 하는 열려있는 독서 프레임 (ORF), 내에서 시퀀스를 사용할 수 있습니다. 이것은 기존의 3' 경쟁에서 제공 하는 분열 polyadenylation 사이트 뿐만 아니라 polyadenylation 신호 (PA)의 외 이다. 특이 한 3' Utr, 3' UTR, 내 유전자 융해를 포함 하 여 검색할 수 있습니다 확장 된 3' 경주 그리고 시퀀스 정보 잠재적인 미르 바인딩 사이트 뿐만 아니라, 누구나 풍부한 사본의 안정성에 영향을 미칠 수 있는 요소를 불안정을 예측에 사용할 수 있습니다.

중첩 된 앞으로 뇌관 검색:
Agarose 젤에서 그림 1 에서는 두 가지 PCR 젤 제품 (1, 2 차선)는 사용 같은 전달 하지만 다른 역방향 뇌관 뇌관. 레인 3 뚜렷한 PCR 제품 고 뚜렷한 정방향 및 역방향 뇌관을 있다. 기반으로 하는 PCR 반응에 사용할 이상적인 뇌관은 하나의 뚜렷한 PCR 제품 (3 차선) 하는 그. 레인 1과 2에 사용 앞으로 입문서 강한 밴드를 제공 고 (예상), 가장 큰 PCR 제품을 제공 하 고 첫 번째 앞으로 뇌관으로 사용 됩니다. 3' 경주에서 PCR 반응의 두 번째 집합에 대 한 두 번째 중첩 된 뇌관 레인 3에서 앞으로 입문서가입니다.
3'...

CDNA 끝 (3' 경주)의 두 개의 서로 다른 3' 급속 한 확대 프로토콜 설명된 여기 확인 지도 열려있는 독서 프레임 (ORF), 정지 codon 그리고는 전체 3' UTR RNA를 사용 하 여 증명서의 세그먼트를 포함 하는 시퀀스를 두 개의 서로 다른 DNA polymerases의 사용 다른 암 세포 선에서 얻은.

암에 성적표를 매핑할 CDNA의 급속 한 확대 끝 적응 3'

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

이 절차의 전반적인 목표는 2개의 후속 PCR에서 전사체 특이적 중첩 프라이머를 사용하고 정제된 PCR 산물을 염기서열분석함으로써 3-프라임 말단에서 단백질 코딩 영역 내 영역까지의 mRNA 전사체의 염기서열을 결정하는 것입니다. 이 방법은 폴리아데닐화 신호, 정지 코돈 및 전사체의 3-프라임 번역되지 않은 영역의 염기서열 결정과 같은 유전 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 열린 판독 프레임의 작은 영역의 서열이 종양 특이적 융합 유전자 및 스플라이스 변이체를 검출할 수 있기 때문에 이 기술의 의미는 암 진단으로 확장되는 경우 모든 전사체에 적용할 수 있다는 것입니다.이 방법에 대한 아이디어는 이전에 특성화되지 않고 3개의 프라임이 있는 번역되지 않은 영역이 있는 새로운 전사체를 식별했을 때 처음 떠올랐습니다. 프로토콜을 시작하려면 페놀과 구아니딘 이소티오시아네이트 세포 혼합물을 얼음에서 해동합니다. 해동되면 PCR 후드의 미세 원심분리기 튜브에 클로로포름 100마이크로리터를 추가합니다.혼합물이 분홍색과 불투명해질 때까지 10-15초 동안 샘플을 소용돌이치게 합니다. 다음으로, 얼음 위에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 배양 후 20, 800g 및 섭씨 4도에서 15분 동안 샘플을 원심분리합니다.상부 무색 수성상을 조심스럽게 제거하고 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 침전으로 이동하여 샘플에 동일한 부피의 이소프로판올을 추가합니다. 1마이크로리터의 보조 침전제를 샘플에 추가하여 RNA의 운반체 역할을 하고 후속 단계에서 RNA를 시각화하는 데 도움을 줍니다.샘플을 섭씨 80도에서 최소 4시간 동안 배양합니다. 배양 후 샘플을 냉각된 원심분리기로 옮기고 섭씨 20, 800g 및 섭씨 4도에서 35분 동안 회전합니다. 스핀 후 RNA는 튜브 바닥에 파란색 사양으로 나타납니다.샘플에서 이소프로판올을 조심스럽게 제거합니다. 500마이크로리터의 80% 에탄올을 추가하고 3초 동안 잠시 와류로 펠릿을 재현탁합니다. 샘플을 다시 원심분리하십시오.샘플에서 모든 에탄올을 제거하고 샘플을 약 10분 동안 자연 건조시킵니다. 샘플이 건조되면 35마이크로리터의 RNase-free 물에 재현탁합니다. 그런 다음 샘플을 가열 블록에 놓습니다.섭씨 65도에서 5분 동안 설정하여 RNA가 용액에 완전히 들어가도록 합니다. 가열 후에는 즉시 튜브를 얼음 위에 올려 놓으십시오. 최종 반응 부피가 50마이크로리터인 경우 총 22마이크로리터의 총 부피에 물이 첨가된 총 RNA 4마이크로그램을 새 튜브에 추가합니다.10마이크로몰 프라이머 용액에서 Oligo dT 25 프라이머 2마이크로리터를 추가합니다. 역전사 키트에서 RNase 억제제 2마이크로리터, 5x 반응 완충액 8마이크로리터, 10밀리몰 dNTP 4마이크로리터 및 역전사효소 2마이크로리터를 추가합니다. 음성 대조군으로 작용하기 위해 역전사효소 없이 반응을 설정합니다.튜브를 섭씨 42도에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 튜브를 가열 블록으로 운반하기 전에 튜브를 얼음으로 직접 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 75도에서 5분 동안 가열합니다.섭씨 75도로 가열한 후 튜브를 얼음 위에 올려 놓습니다. 2마이크로리터의 cDNA를 새로운 0.5ml PCR 튜브로 옮깁니다. 10 밀리몰 프라이머 용액에서 1 마이크로 리터의 정방향 프라이머와 1 마이크로 리터의 역방향 프라이머를 추가합니다.8.5 마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 최대 12.5 마이크로리터를 만들고 12.5 마이크로리터의 2x PCR을 겔 마스터 믹스에 첨가합니다. 그런 다음 화면에 나열된 PCR 열 순환 조건을 입력하고 PCR을 실행합니다. PCR 후 브롬화 에티듐으로 염색된 1% 아가로스 젤을 준비합니다.100ml의 트리아세테이트 또는 TAE 완충액에 아가로스 1g을 250ml 플라스크에 녹입니다. 내용물을 전자레인지에 끓입니다. 젤을 1분 동안 식히고 흄 후드에 7.5마이크로리터의 브롬화 에티듐 용액을 추가합니다.플라스크를 휘젓아 잘 섞습니다. 내용물을 수평 젤 장치에 붓고 젤이 배기 후드의 실온에서 최소 30분 동안 응고되도록 합니다. 겔을 1x TAE 완충액으로 덮고 PCR 산물 10마이크로리터를 DNA 분자량 래더 3-5마이크로리터와 함께 아가로스 겔에 로드합니다.젤을 175볼트에서 10분 동안 실행합니다. 첫 번째 PCR의 경우, 1마이크로리터의 cDNA를 PCR 튜브에 옮기고 5마이크로리터의 10x Pfu 반응 완충액을 추가합니다. 10밀리몰 용액에서 첫 번째 중첩 전방 프라이머 1마이크로리터, T7 Oligo dT 25 프라이머 1마이크로리터, dNTP 1마이크로리터를 추가합니다.40마이크로리터의 물을 추가하여 최대 49마이크로리터의 총 부피를 만듭니다. Pfu DNA 폴리메라이제 1 마이크로 리터를 첨가하고 잘 섞습니다. 그런 다음 PCR을 실행합니다.다음으로, 제2 PCR을 준비한다. 첫 번째 PCR에서 생성물 2마이크로리터를 새 PCR 튜브로 옮기고 5마이크로리터의 10x Pfu ultra two 반응 완충액과 혼합합니다. 두 번째 중첩 PCR 프라이머 1마이크로리터, T7 프라이머 1마이크로리터 및 dNTP 1마이크로리터를 추가합니다.39 마이크로리터의 물을 첨가하고 1 마이크로리터의 Pfu DNA 중합효소를 첨가하여 최대 49 마이크로리터의 총 반응 부피를 만듭니다. 첫 번째 PCR 설정과 동일한 PCR 프로필을 사용하여 PCR을 실행합니다. 양자택일로, Pfu DNA 폴리메라이제를 사용하는 대신에, 키메라 DNA 폴리메라이제는 2개의 다른 PCRs에서 이용될 수 있다.두 번째 PCR 산물 5-10 마이크로 리터를 가져 와서 아가로 스 겔에서 실행하십시오. 마지막으로 이미저에서 결과를 시각화합니다. 이 아가로스 젤은 동일한 앞으로 뇌관 그러나 다른 반전 뇌관 및 명백한 앞으로와 반전 뇌관이 있는 명백한 PCR 제품에는 이용하는 2개의 명백한 PCR 제품을 보여줍니다.PCR 기반 반응에 사용할 수 있는 이상적인 프라이머는 하나의 별개의 PCR 산물을 제공하는 프라이머입니다. Pfu DNA 중합효소 및 키메라 DNA 중합효소를 사용한 두 번째 PCR 반응의 산물은 3 프라임 RACE에 대한 PCR 사이클링 조건이 달랐음에도 불구하고 동일한 크기의 PCR 산물을 생성했습니다. 역전사효소 음성 대조군은 cDNA 합성뿐만 아니라 후속 다운스트림 반응에 사용된 RNA의 게놈 오염을 보여주지 않았습니다.염기서열분석을 위해 겔 정제된 PCR 산물을 보냈습니다. 염기서열 크로마토그램의 대표적인 Sanger 염기서열은 정지 코돈의 위치, 추정 폴리아데닐화 신호 및 부위뿐만 아니라 three-prime RACE 산물에서 폴리 A 꼬리를 식별했습니다. 이 절차를 시도하는 동안 항상 보호 장비와 장갑을 착용해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.또한 시약, 튜브 및 기타 일회용품에 멸균 DNase 및 RNase를 사용하십시오. 페놀과 클로로포름으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 그리고 이 절차를 수행하는 동안 후드에 시약을 사용하고 지정된 폐기물 용기에 물질을 버리는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

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암에 성적표를 매핑할 CDNA의 급속 한 확대 끝 적응 3'

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