Cytometry 사용 하 여 인간 지방 조직에서 면역 세포의 특성
March 6th, 2018
이 문서에서는 지방 조직 및 cytometry 사용 하 여 이후 분석에서 면역 세포의 고립에 의해 지방 조직의 면역 세포 콘텐츠를 분석 하는 방법을 설명 합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 유세포 분석을 사용하여 지방 조직 내에서 발견되는 다양한 면역 세포 집단의 표현형을 위해 인간 지방 조직에서 기질 혈관 분획을 분리하는 것입니다. 이 방법은 비만 개인의 지방 조직에 어떤 면역 세포가 축적되고 어느 정도까지 축적되는지와 같은 대사 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 면역 세포의 여러 마커를 동시에 측정하고 지방 조직에서 이러한 면역 세포를 식별 및 정량화할 수
있다는 것입니다.이 기술은 지방 조직 염증에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 장기 및 조직에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 주로 염색 절차 중 기질 혈관 세포 오염 및 세포 손실로 어려움을 겪을 것입니다. 제 박사 과정 학생 중 두 명인 Suzan Wetzels와 Mitchell Bijnen이 프로토콜을 실행할 것입니다.
먼저 메스를 사용하여 지방 조직 생검 1g을 약 2mm 제곱 조각으로 다집니다. 조각을 50ml 원심분리기 튜브에 옮기고 샘플에 10ml의 콜라겐분해효소 용액을 추가합니다. 조직 조각을 섭씨 37도의 수조에서 분당 60사이클로 60분 동안 배양합니다.
그런 다음 200마이크로미터 스트레이너를 통해 새로운 50ml 원추형 튜브로 여과합니다. 원심분리 전에 7ml의 PBS로 필터를 헹굽니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 전체 피펫 팁을 용액에 담그지 않고 상층액을 제거합니다.
펠릿은 명확하게 볼 수 있어야 하며 지방 세포로 인한 기질 혈관 분획의 오염을 방지하기 위해 거의 모든 상층액을 제거해야 합니다. 기질 혈관 세포 펠릿을 5ml의 신선한 PBS로 현탁시키고 70마이크로미터 스트레이너를 통해 기질 혈관 분획을 새 튜브로 여과합니다. 원심분리 후, 세척된 기질 혈관 분획 펠릿을 3ml의 적혈구 용해 완충액에 얼음 위에서 5분 동안 현탁시킵니다.
그런 다음 7ml의 PBS로 용해를 정지시키고 원심분리로 세포를 펠릿화합니다. 유세포 분석을 위해 기질 혈관 분획을 염색하려면 펠릿을 섭씨 4도 형광 활성화 세포 분류 또는 FACS 완충액 90마이크로리터에 재현탁하고 10마이크로리터의 인간 IgG로 비특이적 염색을 차단합니다. 96웰 v-바닥 플레이트의 두 웰 사이에 세포 현탁액을 분할하고 세포를 15분 동안 얼음 위에 놓습니다.
배양이 끝나면 각 샘플을 100마이크로리터의 FACS 버퍼로 세척하고 원심분리가 끝날 때 상등액을 버리기 위해 탭하지 않고 한 번의 부드러운 동작으로 플레이트를 거꾸로 뒤집습니다. 시술 중 세포 손실을 방지하기 위해 거꾸로 뒤집기 전에 플레이트 바닥에 있는 펠릿을 명확하게 볼 수 있는지 확인하십시오. 첫 번째 펠릿을 첫 번째 FACS 패널에 대해 29.5마이크로리터의 항체 칵테일에 재현탁하고 두 번째 펠릿을 두 번째 FACS 패널에 대해 23마이크로리터의 항체 칵테일에 재현탁합니다.
어둠 속에서 얼음 위에서 30분 후 웰당 150마이크로리터의 FACS 완충액으로 세포를 세척하고 150마이크로리터의 1% 포름알데히드 용액에 세포 펠릿을 고정합니다. 각 웰의 세포 현탁액을 적절한 해당 FACS 튜브로 옮기고 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 분석하기 전에 염색되지 않은 음성 대조군을 유세포 분석기에 로드하여 전방 산란 및 측면 산란 파라미터를 설정합니다.
그런 다음 관심 있는 모든 집단이 전방 산란 및 측면 산란 그래프에서 볼 수 있고 파편과 살아있는 세포를 구별할 수 있을 때까지 제조업체의 지침에 따라 유세포 분석기의 전압을 조정합니다. 모든 매개변수가 설정되면 첫 번째 실험 샘플을 800rpm으로 볼텍스하여 세포를 완전히 재현탁시키고 샘플을 세포분석기에 로드합니다. 라이브 게이트에서 최소 50, 000 개의 이벤트를 읽은 다음 소용돌이 치고 방금 시연 된대로 분석을 위해 두 번째 샘플을로드합니다.
이 대표적인 실험에서 지방 조직 대식세포 집단을 분석하기 위해 T 세포, B 세포, 호중구 및 자연 살해 세포와 같은 다른 면역 세포를 배제하여 CD11b+CD11c+대식세포, CD11B+CD11C-대식세포 및 CD11Blow-CD11C+수지상 세포의 존재를 밝혔습니다. 이들 세포의 주요 형광 강도를 정량화한 결과, CD11B+CD11C+ 및 CD11Blow-CD11C+ 세포에서 플라즈마 세포성 수지상 세포와 일반 수지상 세포 마커의 발현이 밝혀졌으며, CD11Blow-CD11C+ 세포에서 관찰된 두 마커의 발현이 더 높아 CD11Blow-CD11C+세포가 실제로 수지상 세포임을 확인했습니다. CD45 양성 세포의 게이팅은 CD19 양성 B 세포 및 CD3 양성 T 세포 집단을 나타냈으며, 후자는 CD3+CD4+T 도우미, CD3+CD8+세포독성 T 세포 부분 집합 및 CD3-CD56+자연 살해 세포로 더 세분화될 수 있습니다.
그런 다음 각 피험자에 대해 생존 가능한 면역 세포의 비율을 계산하여 비만 성인 남성 피험자의 내장 지방 조직에서 전염증성 CD11B+CD11C+대식세포의 비율이 크게 증가했음을 밝혔습니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 실행하면 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 완충액과 세포 분획을 얼음 위에 유지하는 것이 중요하며, 항체로 세포를 라벨링하는 동안 어두운 곳에 보관하는 것이 매우 중요합니다.
개발 후 이 기술을 통해 대사 연구 분야의 연구자들은 인간의 지방 조직에서 면역 세포의 변화를 탐구할 수 있었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 지방 조직 면역 세포를 분리하는 방법과 이러한 세포에서 유세포 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 포름알데히드와 같이 위험할 수 있는 감염 가능성이 있는 인체 물질 및 물질로 작업하고 있다는 점을 명심하십시오.
항상 장갑과 보안경을 착용하고 예방 조치를 취하십시오.
개요
이 기사는 면역 세포를 분리하고 유세포 분석을 사용하여 분석하는 지방 조직의 면역 세포 함량을 분석하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 특히 비만의 맥락에서 지방 조직의 면역 세포 집단에 대한 통찰력을 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 면역학
- 대사 연구
- 세포 생물학
배경
- 지방 조직의 면역 세포 역학을 이해하는 것은 대사 연구에 매우 중요합니다.
- 유세포 분석을 통해 여러 면역 세포 마커를 동시에 측정할 수 있습니다.
- 면역 세포 집단을 식별하면 비만에서 염증의 역할을 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 문제점에는 간질 혈관 세포 오염 및 염색 중 세포 손실이 포함됩니다.
연구 목적
- 인간 지방 조직에서 면역 세포를 분리하고 분석합니다.
- 비만인의 면역 세포 집단 구성을 결정합니다.
- 대사 연구에서 연구자들이 사용할 수 있는 프로토콜을 제공합니다.
사용된 방법
- 잘게 썬 지방 조직은 콜라게나제로 소화하여 간질 혈관 분획을 분리합니다.
- 세포는 유세포 분석을 위해 특정 항체로 염색됩니다.
- 유세포 분석기에서 생체 세포와 파편을 구분하기 위해 매개변수가 설정됩니다.
- 염증 수준을 평가하기 위해 면역 세포 집단의 정량화가 수행됩니다.
주요 결과
- 비만 대상자의 내장 지방 조직에서 염증 유발 대식세포의 현저한 증가가 관찰되었습니다.
- T 세포 및 B 세포를 포함한 다양한 면역 세포 집단이 성공적으로 식별되었습니다.
- 이 기술은 지방 조직의 면역 세포에 대한 상세한 표현형 분석을 허용합니다.
- 결과는 비만에서의 면역 변화를 이해하는 데 기여합니다.
결론
- 이 방법은 지방 조직의 면역 세포를 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 접근 방식을 제공합니다.
- 이는 유사한 분석을 위해 다른 조직 및 기관에 적용될 수 있습니다.
- 프로토콜을 올바르게 수행하면 4시간 이내에 결과를 얻을 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Quantitative immune cell profiling in human adipose tissue is critical for de-risking metabolic disease targets and clarifying inflammatory mechanisms in obesity-linked pathologies. Flow cytometry-based characterization of the stromal vascular fraction enables high-content, reproducible immune subset analysis, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. This capability strengthens portfolio decisions by providing robust, quantitative data on immune cell dynamics in disease-relevant tissues.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell accumulation and phenotype in adipose tissue relevant to metabolic disease hypotheses.
- Supports biological de-risking by distinguishing pro- and anti-inflammatory macrophage subsets and other immune populations.
- Provides quantitative immune profiling to inform target validation and triage decisions.
Screening & Assay Development
- Delivers validated immune cell subset identification for downstream assay development and screening workflows.
- Facilitates assay reproducibility and standardization through multiparametric flow cytometry panels.
- Enables scalable, quantitative readouts for immune cell composition in tissue samples.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune cell profiling with disease-relevant human tissue, supporting translational biomarker strategies.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling immune monitoring in human samples.
- De-risks mechanistic assumptions about inflammation in metabolic disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This flow cytometry protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust immune cell analysis in human adipose tissue biopsies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on immune cell infiltration and phenotype in metabolic disease.
- Screening: Provides standardized, quantitative immune cell subset data for assay readiness.
- Analytics: Delivers multiparametric measurements and gating strategies for comparative immune profiling.
- Translational Research: Connects immune cell dynamics in human tissue to preclinical and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for diverse tissues and marker panels, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune-driven disease models.
- Operational Value: Standardizes immune cell phenotyping with reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying immune mechanisms.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of metabolic and inflammatory disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and immune cell marker selection.
- Needs access to high-parameter flow cytometers and validated antibody panels.
- Demands rigorous cross-team standardization for sample handling and gating strategies.
- Adaptable to other tissues but may require protocol optimization for different sample types.
- Attention to cell loss and contamination is critical for reproducibility and data quality.
