Name: Diabetogenic 환경 화학 물질에 대 한 Murine 췌 장 섬 세포 기반 검사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 학습하세요 생쥐 췌장 섬세포 분리 및 활성산소 유도 물질 선별 기법을 통해 당뇨병 유발 환경화학물질을 탐색하는 방법입니다. 이 기법은 췌장 기능 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 NIEHS 및 국가 자연 과학 재단의 중국 (No. 31572626) 후원 CREH 센터에서 파일럿 프로젝트 교부 금에 의해 지원 되었다.

모든 동물 실험은 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관에 따라 실행 했다. 지도 및 게놈 의학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 텍사스 A & M 연구소의 승인 아래 프로토콜 입증 되 고 수행 되었다.
1. 솔루션 준비
<ol><li>두 배 증류수 H2O, 1 x 10 x 행 크의 균형된 소금 솔루션을 희석 하 고 4 ° c.에 저장</li>
	<li>HEPES (10 m m), MgCl2 (1 m m), 포도 (5 m m)를 추가 하 여 격리 솔루션을 준비 합니다. PH 7.4에 조정 하 고 얼음에 계속.</li>
	<li>유형 4 콜라에서 콜라 솔루션을 준비 합니다. 참고: 특히, 콜라 유형 4 건조 중량의 밀리 그램 당 160을 U 포함 되어 있습니다. 콜라 유형 4의 1 g 5 mL 두 배 증류수 H2O 200 mg/mL의 농도로 희석입니다. 희석된 콜라의 2 mL 30 mL 얼음 차가운 격리 솔루션에 추가 되 고 콜라 솔루션의 6 mL 50 mL 튜브 각 마우스에 대 한 전송 됩니다.</li>
	<li>1mm CaCl2 격리 솔루션에 추가 하 여 세척 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>찬 polysucrose/나트륨 diatrizoate 솔루션 (1.1119 g/mL, 5 mL) 정화 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>RPMI 매체에 L-글루타민 (20 m m), 페니실린 (100 U/mL), 스 (100 µ g/mL), 및 소 태아 혈 청 (FBS) (10%)를 추가 하 여 섬 문화 매체의 500 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>200 µ M에서 증류수에-20 ° c.에 게 분말을 용 해 하 여 DCFH-다 재고 솔루션을 준비 참고: 솔루션 얼룩 선생님 갓 RPMI에 5 µ M의 최종 농도에 DCFH-다 재고 솔루션을 diluting 하 여 이루어집니다. 이 시 약은 빛 으로부터 보호 되어야 한다.</li>
</ol>2. 수술 준비
<ol><li>Intraperitoneally 주사 (I.P.) avertin (2.5 %avertin, 0.4 mL/20 g)와 마우스. 마우스 완전히 마 취 후 더 이상 응답 pinches 발 뒷 다리를 하 고 마우스를 안락사 한 생물 후드로 이동.</li>
	<li>복 면이 위로 향하도록 안락사 마우스를 배치 하 고 피부 살 균에 대 한 70% 에탄올 스프레이.</li>
	<li>상단 복 부에 1cm U-절 개 된 복 부 구멍을 열고 복 부 구멍을 노출 가슴 위에 rostral 방향으로 피부를 제거 합니다.</li>
</ol>3. 췌 관류 및 제거
<ol><li>그림 1에서 볼 수 있듯이 ampulla의 위치를 찾아. 곡선된 집게의 쌍을 사용 하 여 십이지 장 Oddi의 괄약근의 위치에 가까운 클램프. 또 한 쌍의 곡선된 겸 자 사용 하 여 클램프 십이지 장 벽에는 십이지 장 담 즙 통로 차단. 참고: ampulla이이 단계에서 삽입 되지 않습니다 있다. 이 단계에서 십이지 장 담 즙 통로 차단 하도록 의미 된다.</li>
	<li>근 위 머리와 연구원에 관해서는 원심 발 마우스 위치를 변경할.</li>
	<li>일반적인 담 관을 찾아서 30 G 바늘과 5 mL 주사기로 콜라 솔루션의 3 mL를 천천히 주입. 일반적인 담 관 및 췌 주입 후 증가 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>팽창된 췌 내림차순 콜론, 창 자, 복 부, 및 비장에서 분리 곡선된 겸 자 및 좋은 위를 사용 하 여 제거 합니다. 콜라 솔루션의 3 mL를 포함 하는 50 mL 튜브에 췌를 놓고 얼음에 그것을 유지 합니다.</li>
</ol>4. 췌 장 소화
<ol><li>37 ° C 물 목욕으로 각 50 mL 튜브를 놓습니다. 15-20 분 동안 품 어 (시간에 따라 다릅니다 긴장과 쥐의 나이).</li>
	<li>소용돌이 사용 하 여 튜브를 진동.</li>
	<li>대형 메 마른 싱크대 여과기에 4-5 소화 췌 풀 하 고 특 종 췌 철저 하 게 붕괴를 사용 하 여. 세척 솔루션을 포함 하는 23 G 바늘과 10 mL 주사기를 사용 하 여 강제로 화면에서 소화 셀 플라스틱. 세척 솔루션 50 mL 튜브에 수집 합니다.</li>
	<li>1 분에 4 ° C에서 97 x g에서 튜브 원심 고는 상쾌한 가만히 따르다.</li>
	<li>튜브를 세척 솔루션의 25 mL를 추가 하 고 다시 조직 부드러운 vortexing에 의해 일시 중단. 1 분에 4 ° C에서 97 x g에서 조직을 아래로 회전 시키십시오 그리고는 상쾌한 가만히 따르다. 3 번 반복 합니다. 수송과 조직을 꺼내 조심 해야.</li>
</ol>5입니다. 독도의 정화
<ol><li>씻어 조직 펠 릿을 정화 솔루션의 10 mL를 추가 하 고 내용을 부드럽게 resuspend.</li>
	<li>부드럽게 정화 솔루션에 격리 솔루션의 5 mL을 오버레이. 두 솔루션 간의 날카로운 액체 인터페이스를 유지 하려면 주의 해야 합니다.</li>
	<li>느린 가속 15 분 동안 4 ° C에서 g x 560 및 아무 브레이크 튜브 원심 인터페이스에는 피 펫을 삽입 하 고 새로운 50 mL 튜브에 독도 레이어를 수집 합니다.</li>
	<li>3.5 단계에서 설명한 대로 독도 씻어.</li>
</ol>6. 도금 및 작은 섬 세포의 치료
<ol><li>독도 문화 솔루션의 10 mL에는 독도 resuspend, 부드럽게 섞어 잘, 그리고 100 µ L/96 잘 접시에 멀티 채널 피 펫으로 잘 배치. 96 당 약 5 독도 잘 배치 합니다.</li>
	<li>12 h에 대 한 조직 문화 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>원심 (112 x g) 96 잘 접시와 문화 매체를 제거 합니다.</li>
	<li>독도 문화 매체에서 환경 화학 물질을 희석. 접시의 별도 우물에 각 화학 diluents 100 µ L를 추가 합니다. 각 잘에서 독도 resuspend 하 고 (다른 환경 화학 물질에 대 한 농도 다름) 37 ° C에 12 h에 대 한 품 어.</li>
</ol>7. 선생님 얼룩 및 측정
<ol><li>독도 치료 후 1 x PBS로 세척 (각 96 잘 200 µ L). 참고: 화학 물질의 농도 다음과 같습니다: AFB1: 3 µ M, 아트 가진: 100 µ M, BaP: 10 µ M, BPA: 100 µ M, β-에스트로겐, PCB126: 10 µ M, Nonylphenol, 및 BPA: 100 µ M.</li>
	<li>항 산화로 N-아 세 틸 시스테인 (NAC)를 사용 하 여 선생님을 끄다. NAC의 5mm 선생님 유발 화학 diluents을 추가 하 고 37 ° c.에 12 h에 대 한 품 어</li>
	<li>112 x g에서 96 잘 접시 원심 하 고 60 분 동안 37 ° C에서 5 µ M 솔루션 형광 프로브 (H2-DCFH-다 RPMI 미디어에 녹아 있는)의 품 어.</li>
	<li>PBS로 3 회 치료 작은 섬 세포를 세척 하 고 488에서 microplate 리더 형광 측정 nm. 참고: 셀에 DCF의 축적 증가 의해 형광 530에서 측정할 수 있습니다 때 샘플 488에 흥분은 nm nm.</li>
	<li>포도 당 자극 인슐린 분 비 (GSIS) 분석 결과9 선생님 유도 xenobiotic 수행 독도 췌 장 독도의 생리 기능에 xenobiotic 효과 측정 하기 위해 치료 독도 취급.</li>
</ol>

<ol><li>Maruthur, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+prevalence+of+type+2+diabetes%3A+increased+incidence+or+improved+survival%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+diabetes+reports%22%5BJournal%5D)">The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?</a> Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).</li>
<li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li>
<li>Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+beta-cell+failure+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus.</a> Exp Diabetes Res. , 703538(2012).</li>
<li>Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biomarkers+of+oxidative+stress+in+aquatic+organisms+in+relation+to+toxic+environmental+pollutants%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+environmental+safety%22%5BJournal%5D)">Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).</li>
<li>Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+toxicity+in+%CE%B2-cells%3A+type+2+diabetes%2C+good+radicals+gone+bad%2C+and+the+glutathione+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection.</a> Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).</li>
<li>Kaneto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+induces+p21+expression+in+pancreatic+islet+cells%3A+possible+implication+in+beta-cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction.</a> Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).</li>
<li>Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+alters+mitochondrial+activation+and+insulin+secretion+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+palmitate+on+hepatic+insulin+resistance+are+mediated+by+NADPH+Oxidase+3-derived+reactive+oxygen+species+through+JNK+and+p38MAPK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).</li>
<li>Efendić, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreastatin+and+islet+hormone+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreastatin and islet hormone release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).</li>
<li>Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ah+receptor+and+NF-%CE%BAB+interactions%2C+a+potential+mechanism+for+dioxin+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).</li>
<li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnane+X+receptor+regulates+the+AhR%2FCyp1A1+pathway+and+protects+liver+cells+from+benzo-%5B%CE%B1%5D-pyrene-induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage.</a> Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).</li>
<li>Li, L. A., Wang, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCB126+induces+differential+changes+in+androgen%2C+cortisol%2C+and+aldosterone+biosynthesis+in+human+adrenocortical+H295R+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells.</a> Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).</li>
<li>Asahi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+induces+endoplasmic+reticulum+stress-associated+apoptosis+in+mouse+non-parenchymal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes.</a> Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2565847/">Murine pancreatic islet isolation.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255(2007).</li>
<li>Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelium+in+the+modulation+of+isoflurane-induced+vasodilatation+in+rat+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta.</a> British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).</li>
<li>Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+can+cause+sustained+hyperglycemia+in+C57%2FBL6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice.</a> Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).</li>
<li>Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phencyclidine+analogs+and+precursors%3A+rotarod+and+lethal+dose+studies+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).</li>
<li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

환경 화학 물질에 노출을 제안 증거를 축적 T2DM의 개발에 중요 한 역할. Xenobiotics 유도 선생님 T2DM의 발전에 기여 하는 잠재적인 etiological 요인으로 인식 하고있다. 인간은 다양 한 xenobiotic 화학 물질에 노출 되는 그리고 췌 장 이용과 효과적으로 식별 하 고 췌 장 세포에 독성의 기계 장치를 조사 하는 새로운 연구 기법에 대 한 큰 필요.
14, 게시 된 절차 따라 본이 연구에서는 우리 췌 장 세포를 산화 스트레스 유발 손상 xenobiotic 화학 물질과 세포 마우스와 화면에서 췌 장 독도 격리 프로토콜 개발 했습니다. 우리는 또한 xenobiotic 화합물에 의해 유도 된 췌 장 특정 독성 응답을 조사 하기 위해이 절차를 사용 합니다. 마우스에서 췌를 얻으려면, 우리는 혈액 포도 당 수치를 변경 하지 않습니다 하기 때문에 췌 장15,...

T2DM의 보급에 있는 증가 최근 몇 년 동안 공중 보건1에 심각한 위협이 포즈 세계 보건 위기 되고있다. 많은 요인이 발견 되었습니다 원인이 되는, T2DM의 개발에 연결 될 반복 결과 것이 좋습니다 이러한 요소에 대 한 하나의 일반적인 집중 포인트의 과도 한 선생님2 세대에 이르게 산화 스트레스의 유도 , 3.
환경 화학 물질 PCBs, 다이옥신, BaP 등의 다양 한 스펙트럼 유발 산화 스트레스, 췌 장 β 세포의 기능을 손상 하 고 인슐린 저항 및 T2DM4이어질 수 있습니다 발견 되었습니다. 선생님의 생리 적 수준 세포 기능에 중요 한 역할을, 비록 항 산화 시스템의 용량을 초과 하는 선생님에 노출 세포/조직에 손상 귀착되 고 질병5리드. 췌 장 β 세포 항 산화 효소의 낮은 수준의 표현 되며 따라서 산화 스트레스 중재 손상6,7에 대 한 중요 한 목표. 선생님의 상부에 만성 노출은 췌 장 세포 스트레스 유발 장애5 원인을 보여줘 되었습니다8간 및 지방 조직 인슐린 저항 뿐만 아니라.
이 프로젝트의 전반적인 목표는 췌 장 세포에 선생님의 그들의 유도에 따라 그들의 diabetogenic 잠재력에 대 한 화학 물질 화면에 세포 기반 분석 결과 개발 하는 것입니다. 췌 대사 해독 부족 고 xenobiotic 손상6,7에 대 한 중요 한 대상 이다. 따라서, 췌 장 세포에서 생성 하는 선생님을 직접 측정 하 여이 분석 결과 췌에 화학 유도 부상의 직접적인 근사를 제공 해야 합니다. 이 방법을 개발, 우리는 절연 마우스 췌 장 독도 교양 화학 물질, 셀 문화 조건 하에서 고립 된 섬 하 고 판독으로 유도 하는 화학 선생님 세대를 활용. 이 절차는 간단 하 고 효과적인 격리 된 섬; 선생님 유도 하는 화학 물질 식별 그것은 췌 체 외에 관련 된 독성의 메커니즘의 조사에 대 한 추가 개발할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>10&번; 행크' S 균형 잡힌 소금 용액&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 타입 4</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>CLS-4</td><td></td></tr><tr><td>폴리수크로오스/디아트리조산 나트륨 용액&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>2',7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA)</td><td>Sigma</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>형광 마이크로플레이트 리더&nbsp;</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>시그마</td><td>G8540-25G</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이신</td><td>GIBCO</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>avertin</td><td>시그마</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>쥐/마우스 인슐린 ELISA 키트</td><td>Millipore</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트용</td> <td>원심분리기</td><td>Sorval</td><td>Sorval RT7</td></tr><tr><td>Microplate reader</td> 형<td>광 판독용</td> <td>Biotek</td><td>Epoch 2</td></tr></tbody></table>

diabetogenic 환경 화학 물질에 대 한 murine 췌 장 섬 세포 기반 검사

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

인간과 동물에서 특정 환경 화학 물질에 노출은 타입-2 당뇨병 mellitus (T2DM)의 개발으로 이어질 것 이다 췌 장 β 세포의 세포 손상을 발견 되었습니다. 화학 유도 β 세포 손상에 대 한 메커니즘은 불분명 하 고 복잡 한 것 같다, 비록 한 되풀이 발견은 이러한 화학 물질에 손상을 유발합니다 과도 한 반응성 산소 종 (선생님)의 생성을 선도 하는 산화 스트레스 유발 β 세포입니다. 우리 C57BL/6 마우스의 췌 장 섬 세포과 교양된 섬 셀 96 잘 세포 배양 배지;에 있는 고립 된 잠재적인 diabetogenic 환경 화학 물질 식별, 그리고, 작은 섬 세포는 화학 물질과 복용 했다 선생님 세대 2', dichlorofluorescein (DCFH-다)-7' 형광 염료에 의해 발견 되었다. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 bisphenol A (BPA), Benzo [a] pyrene (BaP), 그리고 비페닐 (PCBs), 그들은 잠재적으로 작은 섬 세포에 손상을 유발 수 있습니다 제안 하는 선생님의 상부 유도 수 있습니다. 이 메서드는 diabetogenic xenobiotics를 심사 하는 데 유용 해야 합니다. 또한, 경작된 작은 섬 세포 췌 장 세포에서 화학 유도 된 독성의 생체 외에서 분석에 맞게 수도 있습니다.

건강 한 고립 된 섬의 현미경 사진 그림 2, 독도 원형 또는 타원형 모양으로 비교적 균일 한 크기 (비록 크기 균일성 스트레인 스트레인에서 다를 수 있습니다)를가지고 있는에 표시 됩니다. 우리 다음 조사 생체 외에서 분석 결과에서 췌 장 섬 기능 분리는 섬 하 고 문화 독도에서 인슐린 분 비를 자극. 그림 3 GSIS 분석 결과 3.3 m m와 16.7 m m 포도 당9에 의해 유도 된 C57BL/6 마우스 고립 된 독도에서 우리의 일반적인 분석을 보여준다.
플레이트 형식 화면 메서드를 사용 하 여 우리는 작은 섬 세포 (그림 4) 선생님의 중요...

여기 우리는 잠재적인 diabetogenic xenobiotic 화학 물질 식별는 xenobiotics에 의해 선생님 inductions을 심사에 대 한 마우스 췌 장 섬 세포 격리 프로토콜을 제시.

Diabetogenic 환경 화학 물질에 대 한 Murine 췌 장 섬 세포 기반 검사

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

췌장 세포는 제2형 당뇨병의 발병과 관련된 ROS 유도 손상에 민감한 표적입니다. 췌장 세포 기반 분석은 ROS 유도 화학 물질을 식별하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 당뇨병 유발 가능성이 추가될 수 있는 ROS 유도 화학 물질을 간단하고 효과적으로 식별하기 위해 분리된 췌장 섬 세포를 사용하는 것입니다.이 방법은 포도당 자극 인슐린 분비와 같은 췌장의 생리적 기능에 대한 화학 물질의 영향에 대한 체외 분석에도 사용할 수 있습니다. 한 쌍의 구부러진 집게를 사용하여 십이지장을 Oddi의 괄약근 위치에 가깝게 고정합니다. 또 다른 구부러진 집게로 십이지장 벽을 고정하여 담즙 경로를 막습니다.총담관을 찾아 30게이지 바늘과 5ml 주사기로 3ml의 콜라겐분해효소 용액을 천천히 주입합니다. 그런 다음 머리는 근위부, 발은 원위부로 마우스를 재배치합니다. 주사 후 총담관과 췌장이 팽창되었는지 확인하십시오.구부러진 집게와 가는 가위를 사용하여 팽창된 췌장을 제거하여 하행 결장, 장, 위 및 비장과 분리합니다. 그런 다음 3ml의 콜라겐 분해 효소 용액이 들어 있는 50ml 튜브에 장기를 넣고 얼음 위에 보관합니다. 각 50ml 튜브를 섭씨 37도의 수조에 넣고 15-20분 동안 배양합니다.튜브를 소용돌이치게 한 다음 4-5개의 소화된 장기를 대형 멸균 싱크 여과기에 모으고 스쿱을 사용하여 췌장을 완전히 분해합니다. 23게이지 바늘과 세척 용액이 들어 있는 10밀리리터 주사기를 사용하여 소화된 세포를 화면에서 격렬하게 피펫으로 분리합니다. 그런 다음 50ml 튜브에 세척 용액을 모으십시오.튜브를 97g과 섭씨 4도에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 디캔팅합니다. 튜브에 세척액 25ml를 넣고 부드럽게 와류로 조직을 재현합니다. 그런 다음 조직을 스핀다운하고 상층액을 디캔팅합니다.펠릿 조직이 빠지지 않도록 주의하면서 세척을 세 번 반복합니다. 섬을 정화하려면 세척된 조직 펠릿에 10ml의 정화 용액을 첨가하고 내용물을 부드럽게 재현탁시킵니다. 5ml의 분리 용액을 정제 용액에 부드럽게 덮습니다.두 솔루션 사이에 날카로운 액체 계면이 유지되는지 확인하십시오. 560g에서 섭씨 4도에서 15분 동안 튜브를 천천히 가속하고 중단 없이 원심분리합니다. 그런 다음 인터페이스에 피펫을 삽입하고 섬 층을 수집합니다.방금 시연한 것처럼 섬을 세척하기 전에 용액을 새 50ml 튜브로 옮깁니다. 최종 세척을 제거한 후 10ml의 섬 배양 용액을 넣고 부드럽고 철저히 혼합하여 섬을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 다중 채널 피펫을 사용하여 웰당 100마이크로리터를 96웰 플레이트의 웰로 이동합니다.조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 12시간 동안 배양합니다. 그런 다음 112g에서 플레이트를 원심분리하고 배양 배지를 제거합니다. 섬 배양 배지에서 환경 화학 물질을 희석하십시오.각 화학 희석제 100마이크로리터를 플레이트의 별도 웰에 추가합니다. 각 우물에 섬을 다시 매달아 놓고 섭씨 37도에서 12시간 동안 접시를 배양합니다. 섬의 화학 처리 후 1x PBS를 사용하여 샘플을 세척합니다.그런 다음 항산화제로 5밀리몰의 N-아세틸 시스테인 또는 NAC를 웰에 첨가하여 ROS를 소멸시키고 플레이트를 섭씨 37도에서 12시간 동안 배양합니다. 96웰 플레이트를 112g으로 원심분리한 다음 형광 프로브의 5마이크로몰 용액을 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 60분 동안 배양합니다. PBS를 사용하여 처리된 섬 세포를 세 번 세척하고 480나노미터의 마이크로플레이트 리더를 사용하여 형광을 측정합니다.마지막으로, ROS 유도 생체이물 처리 및 미처리 섬에서 포도당 자극 인슐린 분비 또는 GSIS 분석을 수행하여 췌장 섬의 생리학적 기능에 대한 이종생물 효과를 측정합니다. 여기에 보이는 것은 C57 Black/6 마우스에서 분리된 건강한 췌장섬으로, 모양이 둥글거나 타원형이며 크기가 비교적 균일합니다. 이 GSIS 분석에서는 인슐린을 분비하기 위해 포도당으로 자극된 고립된 섬을 사용하여 용량 의존적 반응이 관찰되었습니다.여기에 나열된 생체이물(xenobiotics)로 분리된 섬을 처리했을 때, 아트라진(Atrazine), BaP, BPA 및 PCB를 포함한 여러 화학 물질이 활성 산소 종의 상당한 유도를 일으켰습니다. 그러나 NAC를 추가하면 화학적 처리로 ROS 생산을 줄일 수 있었습니다. 또한, PCB126과 BPA를 전처리한 췌장도는 대조군에 비해 인슐린 분비가 현저히 감소하는 것으로 나타나 T2DM을 유발하는 췌장베타세포의 생리적 기능에 손상을 입히는 ROS의 중요한 역할을 확인하였다.일단 숙달되면 췌장 섬의 격리는 적절하게 수행되면 2 시간 내에 완료 할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 구배 원심분리를 사용하여 다른 췌장 파편으로부터 섬을 정화하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 포도당 자극 인슐린 분비와 같은 다른 방법을 수행하여 췌장 섬의 생리적 기능에 대한 화학 물질의 영향과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.개발 후, 이 기술은 독성학 분야의 연구자들이 고립된 쥐 췌장 섬 세포에서 환경 화학 물질의 당뇨병 유발 가능성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 쥐 췌장 섬을 분리하고 이러한 섬 세포를 식별에 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Murine 췌장 아일릿 격리

랑게르한스의 고립 된 마우스 독도를 이용하여 체외 β-세포 기능을 시금 당뇨병의 병태 생리 및 치료의 연구에 중요한 구성 요소입니다. 많은 다운 스트림 응용 프로그램을 사용할 수 있지만,이 프로토콜은 특히 β-세포의 기능을 결정하는 중요한 매개 변수로 세포 내 순환 아데노신 monophosphate (캠프)의 측정에 대해 설명합니다.

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

우리는 여기에서 제2형 당뇨병의 마우스 모델, Leprdb에서 섬을 분리하기 위한 프로토콜과 2개의 광자 현미경을 사용하는 온전한 섬에서 인슐린 분비를 측정하기 위한 라이브 셀 분석의 세부 정보를 제시합니다.

Lepr<sup&gt; DB</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

자기 갱신 성인 쥐의 췌장으로부터 분리 전구 세포의 분화를 검출하는 시험 관내 콜로니 검정 고안되어있다. 이러한 분석에서, 췌장 전구 세포가 메틸 - 함유 반고체 배지에서 3 차원 공간에서 세포 콜로니를 야기. 단일 세포와 개별 식민지의 특성을 처리하기위한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리

당뇨병 연구 분야에 중요한 도전은 섬 β 세포 복제를 조절하고 β - 세포 재생을 자극하는 방법을 개발하는 분자 메커니즘을 이해한다. 여기서 높은 콘텐츠 스크리닝 방법 식별 및 작은 분자의 β 세포의 복제를 촉진 활성을 평가하기 제시된다.

높은 콘텐츠<em&gt; 체외</em&gt; 췌장 작은 섬의 β 세포 복제 디스커버리 플랫폼

단일 셀 RNA 시퀀싱 뒤 미 발달, 신생아 및 산 후 췌 내 분 비 세포의 격리 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법을 사용 하면 분석 췌 장 내 분 비 계보 개발의 셀이 transcriptomic 역학.

마우스 췌 장 내 분 비 세포의 단일 셀 Transcriptomic 분석

이 연구는 마우스 췌장에서 기능성 원차 섬과 선반세포를 효율적으로 추출하는 단순화된 방법을 개발하여, 급성 췌장염 유발 당뇨병의 발병 기전에서 세포 간 소통을 연구하는 귀중한 도구를 제공하였습니다.

마우스에서 1차 섬과 1차 췌장 아시나세포를 동시에 분리하는 간단하고 신속한 방법

우리는 인간 줄기세포에서 유래한 췌장 줄기세포 섬을 면역결핍 쥐에 근육 내 이식하여 생체 내 이식과 후속 분석을 위한 최소 침습 프로토콜을 제공합니다.

쥐에서 인간 다능성 줄기세포 유래 췌장 내분비세포의 근육 내 이식

이 프로토콜은 루이스 쥐 췌장 섬의 외과적 채취, 효소 소화 및 밀도-구배 정제를 표준화하는 방법을 설명하여, 이식 또는 시험관 내 연구에 직접 사용할 수 있는 고수율, 고순도 제제를 가능하게 합니다.

효소 소화 및 밀도-구배 분리를 이용한 루이스 쥐로부터의 췌장 섬 분리 및 정제

thermostability 공학 분야에 해당 소설 감독 진화 방법은 bacteriolytic 효소 용으로 개발하고 결과적으로 확인되었습니다. 고온의 부화 후 야생 형 단백질에 비해 무작위 mutagenesis의 한 라운드, 발전 bacteriolytic 효소, PlyC 29C3는 두 번 잔류 활동보다 더 큰 표시 한 후.

내열 Bacteriolytic 효소의 감독 진화에 대한 새로운 검사 방법

학습하세요 생쥐 췌장 섬세포 분리 및 활성산소 유도 물질 선별 기법을 통해 당뇨병 유발 환경화학물질을 탐색하는 방법입니다. 이 기법은 췌장 기능 연구에 활용됩니다.

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