적정 수용 체 Ligand 상호 작용의 분리 상수를 결정 하는 방법으로 ELISA
2018년 2월 15일
자세한 프로토콜 ELISA 적정 수행을 설명 합니다. 또한, 새로운 알고리즘 적정 ELISAs를 평가 하 고 결정 플레이트 움직일 수용 체 성 ligand의 바인딩의 분리 상수를 제공 됩니다.
이 정량 ELISA의 전체 목표는 새로운 알고리즘을 사용하여 재현 가능하고 효율적인 방식으로 두 결합 파트너의 친화성 상수를 결정하는 것입니다. 이 방법은 단백질 리간드 상호 작용 및 수용체 연구 분야뿐만 아니라 제약 연구 및 약리학과 같은 응용 생명 과학 분야에서 주요 질문에 답할 수 있는 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수용체 리간드 상호 작용의 친화성 상수를 ELISA 플레이트에서 수용체를 리간드로 희석하고 새로운 평가 알고리즘을 사용하여 쉽게 결정할 수 있다는 것입니다.
이 절차는 Integrin Alpha 2 A 도메인의 스톡 용액을 TBS 마그네슘 염화물 버퍼로 마이크로그램 5당 밀리리터의 최종 농도로 희석하여 시작합니다. 이 시연에는 야생형 및 돌연변이 Integrin Alpha 2 A 도메인이 모두 사용됩니다. 하프 에리어 마이크로티터 플레이트의 한 행의 각 웰에 Integrin Alpha 2 A 도메인 코팅 용액 50마이크로리터를 채웁니다.
모든 정량 행을 적어도 이중으로 수행합니다. 이 예에서는 모든 정량 행을 4배수로 수행합니다. 호일로 플레이트를 밀봉하고 하루 동안 4도 섭씨에서 플레이트를 방치합니다.
다음 날, 코팅 용액을 제거하고 각 웰에 15마이크로리터의 TBS 마그네슘 염화물 버퍼를 채웁니다. 세척 용액을 제거하고 새로운 세척 용액으로 웰을 채웁니다. 세척은 물리적 흡수에 의해 플라스틱 표면에 고정되지 않은 용해성 수용체 분자를 제거합니다.
다음 단계는 각 웰에 TBS 마그네슘 염화물 버퍼에 1% BSA 용액 50마이크로리터를 추가하여 비특이적 결합 부위를 차단하는 것입니다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 마이크로티터 플레이트의 웰이 BSA로 차단되는 동안 리간드 Rhodocetin의 연속 희석을 준비합니다.
이 경우 243에나멜 침식 Rhodocetin의 시작 농도와 2.3의 희석 계수를 사용합니다. 이 실험의 8개 정량 곡선에 대해 테스트 튜브 번호 1의 최고 농도에서 1% BSA를 TBS 마그네슘 염화물에 920마이크로리터의 Rhodocetin 용액을 준비합니다. 2번부터 11번까지 레이블이 붙은 다른 10개의 테스트 튜브에 각각 520마이크로리터의 1% BSA 용액을 TBS 마그네슘 염화물로 파이펫합니다.
테스트 튜브에서 테스트 튜브 2로 Rhodocetin 용액 400마이크로리터를 이동합니다. 두 용액을 처터-아-션으로 혼합한 다음 이 혼합물에서 400마이크로리터를 테스트 튜브 3으로 이동합니다. 테스트 튜브 11까지 계속 연속 희석합니다.
이 절차의 성공을 위해서는 항상 매우 빠르게 모든 웰을 용액으로 채워 웰이 건조되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 1시간 배양이 완료되면 마이크로티터 플레이트 웰에서 차단 용액을 제거합니다. 즉시 테스트 튜브 1의 Rhodocetin 용액 50마이크로리터를 1열 웰에, 테스트 튜브 2의 용액을 2열 웰에 추가하고 11열까지 계속합니다.
12열 웰에 리간드 무 대조로 1% BSA 및 TBS 마그네슘 염화물 50마이크로리터를 추가합니다. 플레이트를 다시 밀봉하고 실온에서 1시간 30분 동안 배양합니다. 비결합 리간드 분자를 제거하기 위해 결합 용액을 제거하고 각 웰에 HBS 마그네슘 염화물 버퍼 50마이크로리터를 채웁니다.
그런 다음 HBS 버퍼를 제거하고 새로운 HBS 버퍼를 추가합니다. 수용체 및 결합된 리간드를 화학적으로 고정하기 위해 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 HBS 마그네슘 염화물 버퍼에 2.5% 글루타르알데히드 용액 50마이크로리터를 채웁니다. 마이크로티
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개요
본 논문은 수용체-리간드 상호작용의 친화도 상수를 결정하기 위한 적정 ELISA 수행 방법에 대한 상세 프로토콜을 설명합니다. 단백질 상호작용 및 약리학 연구에 도움이 될 수 있도록, 결과를 효율적으로 평가하기 위한 새로운 알고리즘이 소개되었습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생화학
- 약리학
배경
- 수용체-리간드 상호작용을 이해하는 것은 다양한 생물학 분야에서 매우 중요합니다.
- 전통적인 방법들은 효율성과 재현성이 부족할 수 있습니다.
- 적정 ELISA(Titration ELISA)는 결합 친화도를 측정하기 위한 체계적인 접근 방식을 제공합니다.
- 새로운 알고리즘을 통해 데이터 평가를 개선하여 정확도를 높였습니다.
연구 목적
- 친화도 상수를 결정하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발합니다.
- 단백질-리간드 상호작용 연구를 촉진합니다.
- 제약 응용 분야를 위한 도구를 제공합니다.
사용된 방법
- TBS 염화마그네슘 완충액을 이용한 Integrin Alpha 2 A Domain의 희석.
- 수용체 용액을 이용한 마이크로타이터 플레이트 코팅.
- 데이터 분석을 위한 새로운 평가 알고리즘의 활용.
- 야생형 및 변이형 Integrin Alpha 2 A Domain의 비교.
주요 결과
- 이 방법은 친화도 상수를 쉽게 결정할 수 있게 해줍니다.
- 결과는 서로 다른 실험 간의 재현성을 입증합니다.
- 새로운 알고리즘은 결합 상호작용에 대한 정확한 평가를 제공합니다.
- 얻은 통찰력은 제약 연구 및 수용체 연구에 영향을 미칠 수 있습니다.
결론
- 적정 ELISA 방법은 수용체-리간드 상호작용을 연구하는 데 효과적입니다.
- 새로운 알고리즘은 데이터 분석 효율성을 크게 향상시킵니다.
- 이 접근 방식은 다양한 응용 생명 과학 연구를 발전시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업계 관련성 요약
수용체-리간드 해리 상수의 정확한 결정은 약물 발견 과정의 타겟 검증 및 리드 최적화에 필수적입니다. 새로운 비선형 회귀 알고리즘으로 강화된 이 적정 ELISA 방법은 그래픽 추정 없이도 재현 가능한 친화도 측정을 가능하게 하여, 데이터 기반의 진행 여부(go/no-go) 결정 능력을 지원합니다. 이 접근 방식은 다양한 리간드 변체와 수용체 돌연변이체 전반의 결합 강도를 정량화함으로써 초기 발견 단계의 예측 신뢰도를 향상시킵니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 야생형 및 돌연변이 수용체에 대한 리간드 결합 친화도의 정량적 비교를 가능하게 하여, 구조-활성 관계의 가설 검증을 지원합니다.
- 운영적 가치: 원시 신호 데이터로부터 해리 상수 값을 직접 산출하여, 친화도 순위 결정 시의 변동성을 줄여줍니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 여러 리간드에 대한 표준 적정 곡선을 동시에 생성하여, 고정화된 표적에 대한 화합물 라이브러리의 병렬 스크리닝을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: ELISA 호환 검출 방식을 사용하여 기존 면역 분석 플랫폼에 통합함으로써 확장 가능한 친화도 프로파일링이 가능합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: Kd와 함께 결합 활성 수용체 농도를 측정하여, 질병 관련 시스템 내의 타겟 결합 예측에 필요한 정보를 제공합니다.
- 운영적 가치: 반복적인 적정 곡선으로부터 통계적 평가가 가능한 파라미터를 도출하여, 리스크가 조정된 추진 결정 과정을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 타겟 검증부터 리드 화합물 발굴에 이르는 발견 연속체 과정에 적합하며, 정량적 친화도 데이터를 통해 우선순위 결정 및 기전적 리스크 감소를 수행할 수 있습니다.
- 발견 생물학: 돌연변이 또는 변형이 리간드 결합 친화도를 어떻게 변화시키는지 정량화함으로써 치료 가설의 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 농도 범위 전반에서 신뢰할 수 있는 화합물 평가를 가능하게 하는 재현 가능하고 정량적인 결합 신호를 제공합니다.
- 분석학: 비선형 회귀 분석을 통해 해리 상수와 수용체 농도를 산출하여, 구조-활성 분석을 위한 비교 가능한 판독값을 제공합니다.
- 중개 연구: 약물 내성과 관련된 돌연변이 수용체의 친화도 변화를 특성화하여 in vitro 결합 데이터를 전임상 연속성과 연결합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 단백질-리간드 쌍에 대한 친화도 프로파일링을 위한 재사용 가능한 플랫폼을 구축하여, 처리량이 낮은 대안 방식에 대한 의존도를 낮춥니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 알고리즘 기반의 정확한 Kd 결정을 통해 표적-리간드 상호작용에 대한 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 여러 실험실과 프로젝트 전반에서 결합 친화도 측정의 재현성과 표준화를 강화합니다.
- 전략적 가치: 리간드 및 돌연변이체의 신속한 친화도 순위 지정이 가능하게 하여 후기 단계의 탈락 위험을 줄임으로써 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 정량적 결합 데이터와 수용체 결합 가능성을 바탕으로 약물 후보 물질의 위험 조정 우선순위 선정을 용이하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 단백질 정제, ELISA 기술 및 GraphPad Prism과 같은 소프트웨어를 이용한 비선형 회귀 분석에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 재현성 있는 리간드 적정을 위해 마이크로타이터 플레이트 리더, 피펫팅 시스템 및 인큐베이션 제어 장치에 대한 접근이 필요합니다.
- 변동성을 최소화하기 위해 버퍼 조건, 블로킹 제제 및 고정 프로토콜에 대한 팀 간의 표준화가 필수적입니다.
- 이 방법을 서로 다른 수용체-리간드 쌍에 적용할 때, 특히 고정 효율과 리간드 안정성과 관련된 적응 고려 사항이 포함됩니다.
- 글루타르알데히드 고정으로 인한 잠재적인 에피토프 파괴와 같은 실질적인 제한 사항이 있으며, 이는 각 표적 쌍에 대해 실험적으로 검증되어야 합니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:04
Title
0:45
Immobilization of the Receptor (Integrin α2A-domain) to a Microtiter Plate
2:09
Preparation of a Serial Dilution Row of the Ligand (Rhodocetin)
3:25
Binding of Ligand at Different Concentrations to Immobilized Receptor
5:03
Quantification of Receptor-bound Ligand by ELISA
7:06
Evaluation of the Titration Signals
10:58
Conclusion
9:30
Results: Rhodocetin Binds with Lower Affinity to Mutant Integrin α2A-domain
