꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

이 절차의 전반적인 목표는 기생충 행동 반응 및 기생충 유전자 발현의 동역학을 추적하기 위해 통제된 환경 조건 하에서 성체 선충의 동적 과정을 종단적으로 이미지화하는 것입니다. 이 방법은 핵심 행동, 유전자 발현, 기억 및 학습의 차이를 포함하여 동물이 환경 변화에 어떻게 적응하는지에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 동적으로 제어되는 환경에서 개별 동물을 다중 종단 관찰할 수 있을 뿐만 아니라 고해상도에서 적응의 여러 측면을 동시에 샘플링할 수 있습니다.

이 기술의 의미는 고정밀 운동 데이터를 획득하면 수학적 모델링과 복잡한 가설의 공식화 및 테스트를 용이하게 할 수 있기 때문에 동물 적응에 대한 정량적 이해로 확장됩니다. 절차를 위해 장치를 설정하려면 먼저 배출구 주사기 팁을 50cm 주사기 튜브에 연결하십시오. 어댑터 바늘을 만들려면 플라이어를 사용하여 20 게이지 x 1/2 인치 바늘의 바늘 허브에서 바늘 샤프트를 당기고 분젠 버너를 사용하여 남은 플라스틱 잔여물을 제거합니다.

바늘의 양쪽 끝을 플라이어로 잡고 실험 설정의 형상에 따라 어댑터 바늘을 구부리고 바늘을 출구 주사기 튜브의 다른 쪽 끝에 반쯤 꽂습니다. 다음으로, 하나의 버퍼 주사기 팁을 3방향 밸브에 직접 연결하고 버퍼 주사기를 1미터 주사기 튜브에 연결합니다. 어댑터 바늘을 튜브의 열린 끝 부분에 반쯤 삽입하고 주사기 팁을 통해 버퍼 교환 주사기를 50cm 주사기 튜브에 연결합니다.

주사기 튜브를 3방향 밸브의 나머지 포트에 연결하고 밸브를 닫습니다. 어댑터 바늘을 사용하여 방금 시연한 대로 웜 주입구 주사기를 1미터 길이의 주사기 튜브에 연결합니다. 그런 다음 모든 재료를 S-medium으로 두 번 헹구고 헹궈진 주사기와 튜브를 새 S-medium으로 채우고 기포를 제거하도록 주의합니다.

이제 배출 주사기 튜브를 장치 콘센트에 연결하고 배출 주사기 튜브 끝에 있는 어댑터 바늘을 배출구 포트에 꽂습니다. 배출구를 통해 소량의 S-매체를 주입하여 S-매체가 버퍼와 웜 흡입구에서 모두 나올 때까지 장치를 채웁니다. 버퍼 주사기 튜브를 장치의 버퍼 입구 포트에 연결하고 웜 입구를 직경 30초 직경의 스테인리스 스틸 맞춤 핀으로 꽂습니다.

전동 스테이지가 있는 도립 형광 현미경에 미세유체 장치를 장착하고 주사기 펌프를 현미경 근처의 셰이커에 테이프로 붙여서 흔들리는 동안 펌프가 흔들리지 않도록 합니다. 그런 다음 버퍼 주사기 주사기를 주사기 펌프에 로드하고 분당 3마이크로리터의 유속으로 S-매체의 연속 흐름을 장치로 전달하도록 펌프를 설정합니다. microfluidic 장치로 박테리아를 적재하기 위하여는, 첫째로 E.coli OP50의 고밀도 현탁액을 가진 새로운 주사통을 적재하십시오.

주사기를 수직으로 돌리고 배럴을 여러 번 두드려 주사기 상단의 모든 기포를 모읍니다. 오비탈 셰이커를 끄고 버퍼 주사기 주사기의 3방향 밸브를 닫습니다. 버퍼 주사기를 박테리아가 장착된 주사기로 교체하고 박테리아 현탁액이 약간 버퍼 교환 시스템으로 들어가고 OP50 장착 주사기 또는 밸브에 기포가 남아 있지 않을 때까지 주사기 상단에 수집된 모든 공기를 밀어냅니다.

밸브를 닫은 상태에서 박테리아가 주입된 주사기를 주사기 펌프에 연결하고 오비탈 셰이커를 켭니다. 흔들기 속도를 약 200RPM으로 설정하고 유속을 분당 100마이크로리터로 설정합니다. OP50 버퍼가 장치 전체에 퍼지면 유속을 분당 3마이크로리터로 다시 설정합니다.

장치에 선충을 로드하려면 먼저 650마이크로리터의 낮은 결합 마이크로 원심분리기 튜브에 100마이크로리터의 새로운 OP50 현탁액을 채우고 지렁이 따개를 사용하여 선충 성장 배지 한천 플레이트에서 튜브로 20-30개의 연령 동기화 성인 기생충을 개별적으로 이동합니다. 웜 주사기 주사기와 주사기 튜브에 새 OP50 현탁액을 채우고 약 500마이크로리터의 현탁액을 마이크로 원심분리기 튜브에 주입합니다. 그런 다음 웜 현탁액을 웜 주사기 튜브로 끌어당기고 웜 주사기를 웜 주둥이에 연결합니다.

웜 주사기 튜브를 통해 모든 웜을 미세유체 장치에 주입하고 웜 주사기 주사기와 주사기 튜브를 분리합니다. 핀으로 웜 주입구를 막고 기계 펌프에서 버퍼 주사기를 분리합니다. 버퍼 주입구 주사기를 사용하여 수동으로 웜을 채널로 이동시키고 배출구 주사기를 사용하여 필요에 따라 웜 이동을 역전시킵니다.

동물을 싣는 데는 약간의 조정이 필요합니다. 주사기 플런저를 부드럽게 밀어 채널과 정렬하고 약간 더 세게 밀어 웜을 끝까지 밀어 넣습니다. 그런 다음 실험을 시작하기 전에 2-3시간 동안 지렁이가 새로운 환경에 적응하도록 합니다.

벌레는 자신의 통로에 국한되어 있지만 움직이지 않습니다. 대부분의 벌레는 실험이 진행되는 동안 채널에 남아 있지만 일부는 탈출하거나 미세 균열에 얽힐 수 있습니다. 여기에서 장치에서 10시간 동안 하나의 대표적인 웜의 명시야 이미지를 관찰할 수 있습니다.

면역 반응 유전자 one promoter에서 GFP를 발현하는 형질전환 웜을 사용하여 P.Aeruginosa, PA14 감염 시 병원체에 노출된 후 처음 5시간 동안 기생충의 중간체와 꼬리에서 GFP 발현이 관찰되고 다음 5시간 동안 강력한 전신 발현으로 증가합니다. 각 기생충의 총 형광을 감염 후 시간의 함수로 표시하면 면역 반응 유전자 1 유도의 역학과 유도 시기와 정도에 대한 기생충 간 변동성을 설명할 수 있습니다. 각 채널에서 기생충이 낳은 알의 타임 랩스 이미징을 통해 각 기생충이 낳은 누적 알의 수를 감염 후 시간의 함수로 표시할 수 있으며, 감염이 진행됨에 따라 병원체에 의한 알낳기 감소뿐만 아니라 동물에서 동물로의 변동성을 포착

일단 마스터하면 미세유체 장치를 1시간 안에 준비하고 로드할 수 있습니다. 장치가 로드되고 기생충이 적응되면 특정 약물 또는 관심 있는 화학적 단서와 같은 다른 시약을 기생충에게 전달하여 선충 신경 세포 및 유전 시스템의 제어에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 우리와 공동 연구자들은 이 기술을 사용하여 다양한 환경에서 열 쇼크 감염 및 기아에 대한 선충의 섭식 행동과 벌레 유전적 반응을 해부했습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 미세 유체 장치를 사용하여 종단 에세이를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.