Name: 꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 배우세요 미세유체 장치를 이용한 성충 선충의 장기간 이미징 기법으로 행동 반응과 유전자 발현 동역학을 추적합니다. 이 방법은 동물의 환경 적응 메커니즘을 정량적으로 이해하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 보조금 PHY-1205494를 통해 국립 과학 재단 및 MCB 1413134 (엘)와 연구 재단 국립 부여 2017R1D1A1B03035671에 의해 지원 되었다 (KSL).

프로토콜 아래 WormSpa5, 벌레의 경도 이미징에 대 한 이전 설명 미세 장치를 사용합니다. WormSpa (CAD 파일 요청 시 저자에 게 서 얻을 수 있는 시작)의 제조는 간단 하지만 일부 전문성을 요구 한다. 대부분의 경우, 제작 쉽게 수행할 수 있습니다 핵심 시설에 의해 또는 그러한 서비스를 제공 하는 상업 회사에 의해. 장치를 조작 하는 경우 기능 높이 50 µ m 지정 있는지 확인 하십시오.
1. 실험 설치
<ol><li>전동된 스테이지는 거꾸로 형광 현미경에 미세 장치를 탑재 합니다.</li>
	<li>현미경, 가까운 궤도 통을 배치 하지만 뿌리에서 진동 직접 영향을 주지 않습니다 현미경. 예를 들어, 광학 테이블와 접촉 하 게 벽에 고정 하는 선반에 뿌리를 넣어.</li>
	<li>궤도 통에 주사기 펌프를 배치 합니다. 테이프는 통에 펌프 흔들어 동안 흔들림 하지 않습니다 있도록.</li>
</ol>2입니다. 미세 환경 준비
참고: 동안 실험, 4 개의 주사기 연결 되어있습니다 주사기 튜브를 통해 미세 장치에 그림 1에 설명 된 대로. 이 단계에서는 이러한 주사기의 준비를 설명합니다. 달리 언급 하지 않는 한 그들을 긴장 늦추지 않고 주사기 튜브를 가능한 한 짧게 유지.
<ol><li>콘센트 주사기와 주사기 튜브를 준비 합니다. 이 주사기 ( 그림 1에서 S1) 것입니다 나중 주사기 튜브를 통해 장치를 콘센트에 연결 하 고 장치에서 나오는 액체의 임시 저장을 위해 사용.<ol>
<li>어댑터 바늘만 바늘 (금속 부분)을 유지 하는 20 G x 1/2 인치 주사기 팁의 플라스틱 부분을 제거 하 여 확인 합니다. 펜 치와 플라스틱 및 금속 부품을 보유 하 고 그들을 떨어져 당기 여 그렇게. 바늘에 남은 플라스틱 찌 꺼 분 젠 버너 점화 수 있습니다.</li>
		<li>실험적인 체제의 형상에 따라 바늘 펜 치와 그것의 2 개의 끝을 잡고 구부려. 여기서 설명 하는 디자인에 ~ 110 °의 각도를 구 부리는 그것의 중간에 바늘이 가장 편리 합니다.</li>
		<li>튜브 어댑터 바늘 절반 방법을 연결 합니다. 나머지 절반은 나중에 장치에 연결 합니다. 주사기 튜브 누출 (0.86 m m 내경 및 외경 1.32 m m의 튜브 등) 없이 20 G 주사기 팁과 호환 되어야 한다. 권장된 튜브 길이 50 cm입니다.</li>
		<li>20 G x 1/2 인치 주사기 팁을 통해 주사기 튜브의 다른 (오픈) 끝에 10 mL luer 잠금 주사기를 연결 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>버퍼 입구 주사기를 준비 하 고 튜브 주사기. 이러한 주사기 중 하나 ( 그림 1에서 S2) 액을 사출 흐름을 제어 하 고 장치에 대 한 저수지로 사용 됩니다. 다른 주사기 ( 그림 1에 S3)는 버퍼 교환에 필요한 단계 3.2에 설명 된 대로.<ol>
<li>3-방향 밸브를 직접 10 mL 주사기 luer 잠금 (S2)를 연결 하 고 주사기 튜브 (그림 1)을 통해 같은 밸브에 연결할 다른 주사기 (S3): S3 주사기 팁을 통해 튜브를 연결 하 고 다른 주사기 팁을 통해 밸브에 튜브를 연결. 참고: 이러한 자료 연결 된 순서 대로 중요 하지 않습니다.</li>
		<li>3-방향 밸브의 나머지 포트에 주사기 튜브를 연결 합니다. 준비 단계 2.1.2, 에서처럼 다른 어댑터 바늘을 바늘 도중 주사기 튜브의 다른 (오픈) 끝.</li>
		<li>S3 닫혀 있는 동안 단계 2.2.2에 S2 주사기 튜브 연결 되도록 밸브를 설정 (그림 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>웜-입구 주사기와 주사기 튜브를 준비 합니다. 이 주사기 ( 그림 1에서 S4) 장치에 벌레를 로드 사용 됩니다.<ol>
<li>10 mL 주사기 luer 잠금 (S4)를 긴 주사기 튜브를 연결 합니다. 로드; 하는 데 사용 하는 액체의 볼륨에서이 관의 길이 결정 예를 들어 100 cm 튜브의 액체의 2 개 mL 이상 지원 (또한, 단계 4.2 참조).</li>
		<li>2.1.2, 단계 에서처럼 또 다른 어댑터 바늘을 준비 하 고 하나의 플러그 주사기 튜브의 다른 (오픈) 끝에 바늘의 절반.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 주사기와 튜브 S 매체12 두 번 씻어. S-매체, 모든 기포를 제거 하도록 주사기와 튜브를 작성.</li>
	<li>장치 콘센트에 콘센트 주사기 튜브를 연결 합니다.<ol>
<li>출구 포트를 주사기 튜브의 끝에 어댑터 바늘에 연결 합니다.</li>
		<li>작은 S-중간 버퍼 입구와 웜 유입 때까지 장치를 채우기 위해 콘센트를 통해 S 매체의 작은 볼륨을 주입.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(1/32 인치 직경 스테인리스 못 핀) 핀 벌레 입구를 연결 하는 동안 버퍼 입구 주사기 튜브 장치, 버퍼 입구 포트에 연결 합니다.</li>
	<li>장치에 버퍼의 지속적인 흐름을 주사. 주사기 펌프13에 버퍼 입구 주사기 S2를 로드 하 고 s 2에서 매체에 지속적으로 장치 3 µ L/분의 유량에 주입 되도록 펌프를 설정.</li>
</ol>3. 미세 장치에 박테리아 로드
<ol><li>대장균 OP50 S-중간12에 준비 합니다.<ol>
<li>표준 프로토콜에 따라 파운드와 단일 식민지의 50 mL와 250 mL 플라스 크를 접종 하 고 하룻밤 37 ° c.에 품 어</li>
		<li>야간 문화 4000 rpm에서 10 분간 원심 하 고 S 매체의 30 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>5 µ m 주사기 필터를 통해 정지를 필터링 합니다. 600의 광학 밀도 의해 세균성 농도 측정 nm (OD600), 3의 세600 농도 조정 하 고. 이 높은 밀도 잘 먹이 벌레를 유지 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>OP50 서 스 펜 션 장치에 버퍼를 교환 합니다.<ol>
<li>OP50 서 스 펜 션으로 가득 (S5) 깨끗 한 주사기를 준비 합니다. 주사기를 수직으로 잡고 하 고 상단에 모든 공기 방울 수집 여러 번을 누릅니다.</li>
		<li>장치에 연결을 닫습니다 버퍼 입구 주사기의 3 방향 밸브를 설정 하 고 두 개의 주사기, S2 및 S3 연결. 주사기 펌프에서 S2를 분리 합니다.</li>
		<li>밸브에서 s 2를 분리 하 고 S5 밸브에 연결. S5의 상단에 s 3 밸브를 통해 때까지 수집 S3 들어가는 약간 OP50 버퍼의 모든 공기를 밖으로 밀어. 이렇게, 아니 공기 방울이 S5 또는 밸브에 남아 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>3-방향 밸브 S3와 S5 사이의 연결을 장치에 연결 하는 S5 원래 위치로 다시 설정. 주사기 펌프에 S5를 로드 합니다. 펌프를 보유 궤도 셰이 커를 켭니다. 약 200 rpm 진동 속도 설정 합니다.</li>
		<li>수 100 µ L/min 흐름 속도 설정 합니다. 새로운 버퍼 장치에서 벌레에 도착 하는 데 걸리는 시간 버퍼 입구 주사기 튜브 (위에서 설명한 튜브와 함께 약 5 분)의 길이에 따라 달라 집니다. 높은 흐름 속도 빠른 버퍼 exchange는 필요한 경우 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>OP50 버퍼 장치를 통해 확산, 일단 3 µ L/분에 다시 흐름 속도 설정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 미세 장치에 웜 로드
<ol><li>작은 낮은 바인딩 microcentrifuge 튜브 (650 µ L)를 준비 하 고 100 µ L OP50 서 스 펜 션의 그것을 채우십시오. 주위 전송 20-30 나이 동기화 젊은 성인 벌레 (46 시간 25 ° C에서 L1 애벌레 체포를 게시) NGM (선 충 류 성장 매체) 한 천 배지에서 튜브를 그들에 게 벌레와 함께 하나 하나를 선택 하 여 선택. 12표준 프로토콜 따라 나이 동기화를 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>웜-입구를 채우기 주사기와 주사기 튜브 ( 그림 1에서 S4) OP50 서 스 펜 션. 벌레와 함께 microcentrifuge 관에 액체의 ~ 500 µ L를 삽입할. 웜-입구 주사기 튜브에 벌레와 함께 정지를 그립니다. 주사기 튜브는 충분히 있는지 확인 하십시오 (> 1 m) 그린된 웜 주사기 튜브에 하 고 하지 않는 게 줄곧 주사기 S4.</li>
	<li>웜-인렛에 s 4를 연결 합니다. 미세 장치에 웜 유입 주사기 튜브에서 모든 벌레를 주사. S4 및 주사기 튜브를 분리 합니다. 연결 핀 웜 입구.</li>
	<li>기계식 펌프 ( 그림 1)에서 버퍼 입구 주사기 S2를 분리 하십시오 하 고 수동으로 제어 s 1과 s 2를 별도 채널에 모든 벌레를 밀어. S 2를 누르면 이동 합니다 벌레는 채널에 동안 s 1을 누르면 반대 방향에서 그들을 이동 합니다. 채널 로드 되 면 각 채널에 벌레 다른 벌레의 항목을 차단 합니다.</li>
	<li>웜 2-3 시간 동안 새로운 환경에 적응 하자.</li>
</ol>5. 영상 프로토콜 설정
<ol><li>안전 하 게 장치에 있는 모든 벌레를 찾아서 당신의 현미경을 제어 하는 이미지 수집 소프트웨어에 그들의 각각에 대 한 이미지 위치를 설정. 어떤 경우에 유의 (예: 높은 확대를 원하는 또는 작은 CCD 센서와 카메라를 사용 하는 경우) 여러 영상 위치는 각 채널에 대 한 필요. 참고:이 수동으로 할 수 있습니다, 하는 동안 일부 수집 소프트웨어 패키지 이미지 취해야 한다 위치를 나열 하는 텍스트 파일을 로드할 수 있습니다. 주문 때문에이 위치는 정기적으로 WormSpa에, 사용자는 이러한 목록을 자동으로 생성 하는 작은 스크립트를 (예를 들어, Python 또는 상용 소프트웨어)를 작성할 수 있습니다. 이 스크립트의 정확한 형식 것 수집 소프트웨어 ( 보충 자료 1에서 예를 참조)에 의해 필요한 파일 형식에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>시간 경과 화상의 필요한 주파수를 설정 합니다. 예를 들어 감염에 면역 유전자 응답의 영상 프레임 당 10 분의 주파수에서 이루어집니다. 모든 시간 지점에서 모든 필요한 채널 (예: 밝은 분야 및 GFP 형광)을 인수 하는 다는 것을 확인 하십시오.</li>
</ol>6. 호스트 응답 모나 스 감염으로
참고:이 단계는 호스트 병원 체 상호 작용을 공부에 대 한 특정. 또는, 하나 (biotic 및 abiotic 스트레스, 약물, 신호 분자, 등등)의 다른 환경 단서를 포함 하는 버퍼를 준비할 수 있습니다.
<ol><li>녹 농 균 PA14 SK-중간14에서 일시 중지를 준비 합니다.<ol>
<li>파운드와 단일 식민지의 50 mL와 250 mL 플라스 크를 접종 하 고 하룻밤 37 ° c.에 품 어</li>
		<li>파운드의 50 mL 및 문화의 약 수와 함께 또 다른 250 mL 플라스 크를 접종 하 고 하룻밤 37 ° c.에 품 어</li>
		<li>야간 문화 4000 rpm에서 10 분간 원심 하 고 SK-매체의 10 mL에 펠 릿을 resuspend. 세균 농도 측정 하 고 OD600 농도 조정 = 4.</li>
		<li>깨끗 한 플라스 크에 정지를 전송 하 고 24 시간 동안 37 ° C에서와 동요 하는 동안 24 시간 동안 25 ° c를 품 어. 이 단계는 표준 분석 결과14를 죽이고 접시 인큐베이션 단계를 모방 합니다.</li>
		<li>5 µ m 주사기 필터를 통해 정지를 필터링 합니다. 이것은 장치를 막힘에서 세균성 집계를 방지 하기 위해입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PA14 서 스 펜 션, 3.2 단계와 같은 절차에 따라 OP50 서 스 펜 션 장치에서를 교체 합니다. 10 시간 동안 이미지 유지입니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

미세 도구 공부 벌레에 여러 혜택을 제공 합니다. PDMS에 이미징 장치 표준 NGM 천 판에 비해 더 높은 영상 품질을 제공 합니다. 대조적으로 전통적인 방법 동물 접시에서 고른 및 이미징 위한 현미경 슬라이드에 장착 된 단일 벌레에서 여러 개의 이미지를 취할 수 있습니다. 또한, 웜 거주 하는 microenvironment 상수 또는 원하는 정확한 환경 구성 및 동물의 응답 사이의 매핑 허용으로 변조 된 보관할 수 있습니다.
여기 우리는 사용자 정의 미세 장치 (WormSpa)를 사용 하 여 기회 주의 병원 체 피 농 균 PA14에 여러 개의 개별 벌레의 응답을 이미징 하 여 세균 감염에 대 한 호스트 응답의 경도 측정을 수행 하는 방법을 시연 했다. 밝은 분야 및 형광 이미지 지속적인 실험을 perturbing 없이 여러 번에서 촬영 했다. 특히, 계란-누워 고 irg 1 유전자 발현의 활동 매 10 분, 전통적인 방법<sup class="x...

환경에서 변화 유도 및 특정 유전자1,2의 식의 억제를 동반 하는 유전 프로그램의 활성화로 이어질 수 있습니다. 이러한 운동 변화 조직 같은 동물 및 다른 동물 사이 중 변수를 있을 수 있습니다. 같은 유전 프로그램의 연구는 따라서 개별 동물의 경도 이미징 허용 및 환경 조건의 정확한 동적 제어를 제공 하는 방법에 대 한 호출 합니다.
최근 몇 년 동안, ﹙ 유체 장치 응답 및 작은 동물, 벌레, 파리, 물 곰 그리고 더 많은3,,45,6,를 포함 하 여 행동의 여러 측면을 연구 하는 데 사용 되었습니다. 7. 응용 프로그램 포함, 예를 들어 깊은 형질, optogenetic 화학 자극에 응답에 신경 활동의 기록 하 고 운동 등 펌핑8,,910 모터 동작 추적 , 11.
미세-기반 접근 개최 지역 microenvironment의 유지 보수를 허용 하는 유연한 디자인의 정확한 동적 제어를 포함 한 환경 신호에 응답의 장기 경도 이미징 혜택을 수 있는 많은 속성 별도 숙소, 및 이미징에 대 한 유리한 속성에 개별 동물. 그러나, 그들의 잘 존재에 불리 한 영향을 최소한의 오랜 시간에 대 한 미세 챔버에 동물을 유지 하는 것은 실험의 실행에서 뿐만 아니라 미세 소자의 디자인에 특별 한 주의 요구 하는 도전입니다.
여기 WormSpa, 꼬마 선 충의 경도 이미징 미세 장치를 사용 하 여를 설명합니다. 5 개별 웜 챔버에 국한 됩니다. 액체와 세균 현 탁 액의 지속적인 낮은 흐름 벌레가 잘 먹이 충분히 좋은 건강을 유지 하 고 스트레스를 완화 하는 활성는 챔버의 구조로 벌레 알을 낳 기를 보장 합니다. 디자인의 단순 하 고 WormSpa의 그들의 자신의 연구 계획에이 장치를 통합 하는 마이크로에 이전 경험을 가진 연구원을 허용 해야 합니다.

<table><tbody><tr><td>웜스파</td><td>해당 없음</td><td>해당 사항 없음</td><td>WormSpa용 CAD 파일은 Levine 연구소에서 구할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>복합 현미경</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver Z1</td> 전동 스테이지 주사기 펌프<td>가 있는 도립 형</td></tr>광 <tr><td>현미경</td><td>New Era 펌프 시스템 NE-501</td><td></td><td></td></tr><tr><td>튜빙</td><td>SCI Scientific Commodities, Inc.</td><td>BB31695-PE/5</td><td>0.034인치 (0.86mm) 내경 x 0.052인치 (1.32의 mm) O.D</td></tr><tr><td>주사기 팁</td><td>CMLsupply</td><td>901-20-050</td><td>20 게이지 x 1/2" 무딘 팁 스테인리스 스틸 캐뉼라</td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>PALL</td><td>4650</td><td>Acrodisc 32mm 주사기 필터 5 um Supor 멤브레인</td></tr><tr><td>주사기</td><td>Qosina</td><td>C3307</td><td>10 mL 남성 Luer Lock 주사기</td></tr><tr><td>3 방향 밸브</td><td>ColeParmer</td><td>FF-30600-23</td><td>대형 보어 3-방향, 남성 잠금, 스톱콕, 10/팩, 비멸균</td></tr><tr><td>다월 핀</td><td>McMaster-Carr</td><td>90145A317</td><td>18-8 스테인리스 스틸 다월 핀(1/32" 직경 x 1/2" Lg.)</td></tr><tr><td>낮은 결합 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>CL S3206</td><td>0.65 mL 낮은 결합 스냅 캡 마이크로 원심분리기 튜브</td></tr></tbody></table>

꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

지난 10 년간에서 미세 꼬마 선 충, 선 충 류 등 작은 동물을 연구에 적용 된 기술과의 정밀 하 게 제어 기능을 제공 하는 편리한 라이브 이미징 플랫폼으로 유용한 증명 실시간으로 실험 조건입니다. 이 문서에서는 개별 웜 WormSpa, 이전에 게시 사용자 지정 미세 장치 채용의 라이브 이미징을 설명 합니다. 장치에서 여러 벌레는 개별적으로 별도 챔버, 다양 한 생물 학적 과정의 다중화 경도 감시 허용에 국한 됩니다. 기능을 설명 하기 위해 수행 하는 병원 성 박테리아, 장치에 웜 감염 했다 그리고 면역 반응 유전자와 달걀 누워의 표현의 역학 개인에서 지속적으로 감시 되었다 증거의 원리 실험 동물입니다. 단순한 설계와 동작이 미세 기반 실험 이전 경험을 가진 사용자에 게 적합 합니다. 우리는이 이렇게 잘 정의 된 조건 하에서 생물 학적 과정의 종 적 관찰에 관심이 많은 연구원을 위한 도움이 될 것입니다 제안 합니다.

(46 시간 게시물 25 ° C에서 L1 애벌레로)12 프로토콜에 설명 된 대로 장치에 로드 된 젊은 성인 벌레를 나이 동기화. 벌레는 개별적으로 병원 체에 동물의 응답의 경도 측정을 사용 하면 별도 채널에 위치 했다. 실험 성공 하면 대부분 웜 실험의 기간에 대 한 그들의 채널에 남아 있습니다. 이 경우 개별 벌레의 이미지는 단순히 동물을 적극적으로 찾이 필요가 이미지 경로에 그들의 채널을 배치 하 여 촬영 한. 그림 2 A 장치에서 10 시간에 걸쳐 단일 대표 벌레의 필드 밝은 이미지를 보여줍니다. 벌레는 그들의 채널 내에서 수감 된다, 하는 동안 그들은 이동할 수 업 및 다운스트림, 자유롭게 그들의 머리를 설정할 수 있습니다. 이것은 중요 장치 자체 원인 스트레스 또는 동물을 해 하지 않습니다.
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이 문서에서는 사용자 지정 미세 장치를 채용 하는 개별 벌레의 라이브 이미징을 설명 합니다. 장치에서 여러 벌레는 개별적으로 별도 챔버, 다양 한 생물 학적 과정의 다중화 경도 감시 허용에 국한 됩니다.

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

이 절차의 전반적인 목표는 기생충 행동 반응 및 기생충 유전자 발현의 동역학을 추적하기 위해 통제된 환경 조건 하에서 성체 선충의 동적 과정을 종단적으로 이미지화하는 것입니다. 이 방법은 핵심 행동, 유전자 발현, 기억 및 학습의 차이를 포함하여 동물이 환경 변화에 어떻게 적응하는지에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 동적으로 제어되는 환경에서 개별 동물을 다중 종단 관찰할 수 있을 뿐만 아니라 고해상도에서 적응의 여러 측면을 동시에 샘플링할 수 있습니다.이 기술의 의미는 고정밀 운동 데이터를 획득하면 수학적 모델링과 복잡한 가설의 공식화 및 테스트를 용이하게 할 수 있기 때문에 동물 적응에 대한 정량적 이해로 확장됩니다. 절차를 위해 장치를 설정하려면 먼저 배출구 주사기 팁을 50cm 주사기 튜브에 연결하십시오. 어댑터 바늘을 만들려면 플라이어를 사용하여 20 게이지 x 1/2 인치 바늘의 바늘 허브에서 바늘 샤프트를 당기고 분젠 버너를 사용하여 남은 플라스틱 잔여물을 제거합니다.바늘의 양쪽 끝을 플라이어로 잡고 실험 설정의 형상에 따라 어댑터 바늘을 구부리고 바늘을 출구 주사기 튜브의 다른 쪽 끝에 반쯤 꽂습니다. 다음으로, 하나의 버퍼 주사기 팁을 3방향 밸브에 직접 연결하고 버퍼 주사기를 1미터 주사기 튜브에 연결합니다. 어댑터 바늘을 튜브의 열린 끝 부분에 반쯤 삽입하고 주사기 팁을 통해 버퍼 교환 주사기를 50cm 주사기 튜브에 연결합니다.주사기 튜브를 3방향 밸브의 나머지 포트에 연결하고 밸브를 닫습니다. 어댑터 바늘을 사용하여 방금 시연한 대로 웜 주입구 주사기를 1미터 길이의 주사기 튜브에 연결합니다. 그런 다음 모든 재료를 S-medium으로 두 번 헹구고 헹궈진 주사기와 튜브를 새 S-medium으로 채우고 기포를 제거하도록 주의합니다.이제 배출 주사기 튜브를 장치 콘센트에 연결하고 배출 주사기 튜브 끝에 있는 어댑터 바늘을 배출구 포트에 꽂습니다. 배출구를 통해 소량의 S-매체를 주입하여 S-매체가 버퍼와 웜 흡입구에서 모두 나올 때까지 장치를 채웁니다. 버퍼 주사기 튜브를 장치의 버퍼 입구 포트에 연결하고 웜 입구를 직경 30초 직경의 스테인리스 스틸 맞춤 핀으로 꽂습니다.전동 스테이지가 있는 도립 형광 현미경에 미세유체 장치를 장착하고 주사기 펌프를 현미경 근처의 셰이커에 테이프로 붙여서 흔들리는 동안 펌프가 흔들리지 않도록 합니다. 그런 다음 버퍼 주사기 주사기를 주사기 펌프에 로드하고 분당 3마이크로리터의 유속으로 S-매체의 연속 흐름을 장치로 전달하도록 펌프를 설정합니다. microfluidic 장치로 박테리아를 적재하기 위하여는, 첫째로 E.coli OP50의 고밀도 현탁액을 가진 새로운 주사통을 적재하십시오.주사기를 수직으로 돌리고 배럴을 여러 번 두드려 주사기 상단의 모든 기포를 모읍니다. 오비탈 셰이커를 끄고 버퍼 주사기 주사기의 3방향 밸브를 닫습니다. 버퍼 주사기를 박테리아가 장착된 주사기로 교체하고 박테리아 현탁액이 약간 버퍼 교환 시스템으로 들어가고 OP50 장착 주사기 또는 밸브에 기포가 남아 있지 않을 때까지 주사기 상단에 수집된 모든 공기를 밀어냅니다.밸브를 닫은 상태에서 박테리아가 주입된 주사기를 주사기 펌프에 연결하고 오비탈 셰이커를 켭니다. 흔들기 속도를 약 200RPM으로 설정하고 유속을 분당 100마이크로리터로 설정합니다. OP50 버퍼가 장치 전체에 퍼지면 유속을 분당 3마이크로리터로 다시 설정합니다.장치에 선충을 로드하려면 먼저 650마이크로리터의 낮은 결합 마이크로 원심분리기 튜브에 100마이크로리터의 새로운 OP50 현탁액을 채우고 지렁이 따개를 사용하여 선충 성장 배지 한천 플레이트에서 튜브로 20-30개의 연령 동기화 성인 기생충을 개별적으로 이동합니다. 웜 주사기 주사기와 주사기 튜브에 새 OP50 현탁액을 채우고 약 500마이크로리터의 현탁액을 마이크로 원심분리기 튜브에 주입합니다. 그런 다음 웜 현탁액을 웜 주사기 튜브로 끌어당기고 웜 주사기를 웜 주둥이에 연결합니다.웜 주사기 튜브를 통해 모든 웜을 미세유체 장치에 주입하고 웜 주사기 주사기와 주사기 튜브를 분리합니다. 핀으로 웜 주입구를 막고 기계 펌프에서 버퍼 주사기를 분리합니다. 버퍼 주입구 주사기를 사용하여 수동으로 웜을 채널로 이동시키고 배출구 주사기를 사용하여 필요에 따라 웜 이동을 역전시킵니다.동물을 싣는 데는 약간의 조정이 필요합니다. 주사기 플런저를 부드럽게 밀어 채널과 정렬하고 약간 더 세게 밀어 웜을 끝까지 밀어 넣습니다. 그런 다음 실험을 시작하기 전에 2-3시간 동안 지렁이가 새로운 환경에 적응하도록 합니다.벌레는 자신의 통로에 국한되어 있지만 움직이지 않습니다. 대부분의 벌레는 실험이 진행되는 동안 채널에 남아 있지만 일부는 탈출하거나 미세 균열에 얽힐 수 있습니다. 여기에서 장치에서 10시간 동안 하나의 대표적인 웜의 명시야 이미지를 관찰할 수 있습니다.면역 반응 유전자 one promoter에서 GFP를 발현하는 형질전환 웜을 사용하여 P.Aeruginosa, PA14 감염 시 병원체에 노출된 후 처음 5시간 동안 기생충의 중간체와 꼬리에서 GFP 발현이 관찰되고 다음 5시간 동안 강력한 전신 발현으로 증가합니다. 각 기생충의 총 형광을 감염 후 시간의 함수로 표시하면 면역 반응 유전자 1 유도의 역학과 유도 시기와 정도에 대한 기생충 간 변동성을 설명할 수 있습니다. 각 채널에서 기생충이 낳은 알의 타임 랩스 이미징을 통해 각 기생충이 낳은 누적 알의 수를 감염 후 시간의 함수로 표시할 수 있으며, 감염이 진행됨에 따라 병원체에 의한 알낳기 감소뿐만 아니라 동물에서 동물로의 변동성을 포착할 수 있습니다.일단 마스터하면 미세유체 장치를 1시간 안에 준비하고 로드할 수 있습니다. 장치가 로드되고 기생충이 적응되면 특정 약물 또는 관심 있는 화학적 단서와 같은 다른 시약을 기생충에게 전달하여 선충 신경 세포 및 유전 시스템의 제어에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 우리와 공동 연구자들은 이 기술을 사용하여 다양한 환경에서 열 쇼크 감염 및 기아에 대한 선충의 섭식 행동과 벌레 유전적 반응을 해부했습니다.이 비디오를 시청한 후에는 미세 유체 장치를 사용하여 종단 에세이를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

a-microfluidic-platform-for-longitudinal-imaging-caenorhabditis

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

이 문서는 선충류에 embryogenesis의 초기 이벤트의 시각화를위한 기술을...

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

간단한 마이크로 유체 장치는 마취 무료를 수행하기 위해...

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치<em&gt; 생체 내</em의&gt; 이미징<em&gt; C. elegans</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt;와 Zebrafish

에 주문형 운동을 유도하는 반자동 마이크로 전기 유체...

의 주문형 정량 분석​​을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em&gt; &#39;로코

동물을 움직이지 않게 하지 않고 장시간 척도에 걸쳐 행동과 신경 활동을 영상화하는 것이 행동을 이해하기 위한 전제 조건입니다. 아가로스 미세유체 챔버 이미징(AMI)은 예쁜꼬마선충의 모든 생애 단계에 대한 신경 활동과 행동을 이미지화하는 데 사용할 수 있습니다.

의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

C. 선 충 수 컷의 효율적인 칼슘 이미징에 대 한 적응된 "후 각 칩"를 사용 하 여 여기에 설명 되어 있습니다. 글리세롤과 페로몬에 남성 노출의 연구도 표시 됩니다.

남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여

여기에서 우리는 생활 C 에서 고해상도 현미경, 전산 도구 및 단일 세포 라벨링을 사용 하 여 조합 접근법을 제시 합니다. 신경 발달 중에 단일 세포 역학을 이해 하는.

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

이 프로토콜은 최대 36 시간 동안 지속적인 식품 공급이있는 상태에서 C. elegans를 성장시키는 데 사용되는 간단한 미세 유체 칩 설계 및 미세 가공 방법론을 설명합니다. 성장 및 이미징 장치는 또한 며칠 동안 개발 중에 세포 및 하위 세포 프로세스의 간헐적 인 장기 고해상도 이미징을 가능하게합니다.

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

여기에서 우리는 평생 생리학적 매개변수 추적 및 형광 정량화를 위해 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 배양 시스템에는 동물이 도망가는 것을 방지하기 위해 단일 벌레 우물 주위에 팔미트산 장벽이 포함되어 있어 병원성 박테리아 및 화학적 스트레스 요인을 포함한 혐오적인 개입을 사용할 수 있습니다.

Longitudinal Fluorescence Monitoring and Averseive Interventions를 위한 고체 배지에서 개별 Caenorhabditis elegans 의 장기 배양

이 프로토콜은 배아 후 발달 전반에 걸친 미세유체 기반 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 타임랩스 이미징을 설명합니다.

모든 유충 단계에서 이미징하는 고해상도 C. elegans

배우세요 미세유체 장치를 이용한 성충 선충의 장기간 이미징 기법으로 행동 반응과 유전자 발현 동역학을 추적합니다. 이 방법은 동물의 환경 적응 메커니즘을 정량적으로 이해하는 데 활용됩니다.

꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

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