향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

이 프로토콜의 전반적인 목표는 CRISPR/Cas9 리보핵단백질 복합체를 사용하여 다양한 세포 및 유기체에서 표적 게놈 변화를 만드는 것입니다. 이 방법은 연구자에게 모델 및 비모델 유기체의 변형되지 않은 게놈에서 맞춤형으로 설계된 삽입, 삭제 및 치환을 생성할 수 있는 기능을 제공함으로써 근본적인 생물학적 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 플라스미드 DNA 대신 리보핵단백질 또는 RNP 복합체를 사용하는 주요 이점은 효율성이 더 높고 off-target event가 감소한다는 것입니다.

이 기술의 의미는 암, HIV 또는 유전 질환과 같은 것과 싸우기 위한 생체 외 요법으로 확장됩니다. 게놈 편집은 유해한 돌연변이를 교정하거나 해로운 질병과 싸우는 세포의 능력을 향상시키는 데 사용될 수 있기 때문입니다. 따라서 이 방법은 1차 인간 세포, 예쁜꼬마선충(C.elegans) 및 파히알레 하와이엔시스(Parhyale hawaiensis)에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

이전에는 다루기 어려웠던 유기체를 포함하여 수백 개의 다른 시스템에서 유전적 변화를 일으키는 데 적용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 가이드 RNA의 설계 및 준비로 이 절차를 시작합니다. 1-2배의 몰 크기의 가이드 RNA를 총 10마이크로리터 부피의 Cas9 단백질 200피코몰과 혼합하여 RNP 복합체를 조립합니다.

매우 천천히 농축된 Cas9를 가이드 RNA에 약 30초 동안 첨가하여 피펫과 함께 빠르게 원을 그리십시오. 최종 Cas9 농도를 20 마이크로 몰로 가져옵니다. 다음으로, 각 큐벳 웰에 10마이크로리터의 RNP를 추가합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 HSPC를 준비한 후 혈구계로 세포를 계수하고 큐벳당 150, 000 - 200, 000개의 세포를 원심분리기 튜브로 전기천공합니다. 중력의 100배로 튜브를 10분 동안 돌려 세포를 펠릿화합니다. 피펫이나 진공 청소기로 상층액을 흡인하여 기포를 제거합니다.

큐벳 웰당 20마이크로리터의 전기천공(electroporation) 완충액으로 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다. 그런 다음 이미 10 μl의 RNP를 보유하고있는 각 큐벳 웰에 150, 000 - 200, 000 HSPC를 포함하는 20 마이크로 리터의 셀을 추가하고 기포를 생성하지 않고 위아래로 피펫팅하여 잘 혼합합니다. 마지막으로, 큐벳을 Nucleofector에 넣은 후 전기천공합니다.

HSPC의 경우 펄스 코드 ER-100을 사용합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 아가로스 패드에서 예쁜꼬마선충을 준비하는 것으로 시작합니다. 아가로스 주사 패드를 놓고 슬립을 해부 내시경에 덮습니다.

웜 픽을 사용하여 패드의 한쪽 가장자리를 따라 할로카본 오일의 작은 트랙을 놓습니다. 그런 다음 오일로 코팅 된 웜 픽을 사용하여 NG 한천 플레이트에서 여러 웜을 들어 올려 오일 트랙으로 들어 올립니다. 속눈썹이나 고양이 수염과 같은 피펫에 가는 털을 붙이고 벌레를 평행하게 놓고 벌레를 아가로스 패드에 부드럽게 밀어 넣습니다.

미세 주입 절차에 익숙해질 때까지 한 번에 하나의 웜만 주입하십시오. 제자리에 놓고 패드에 부착하면 웜 픽 끝에서 Halocarbon 오일 몇 방울을 더 떨어뜨려 웜을 오버레이합니다. 장착된 웜이 있는 커버 슬립을 주입 현미경에 놓습니다.

낮은 배율에서 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 RNP 용액으로 채워진 주사 바늘에 수직으로 웜을 배치합니다. 고배율로 전환하고 생식선 팔에 인접한 바늘을 재배치하며, 이는 파키텐 중기에서 후기의 핵 근처 영역에 해당합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘을 벌레에 대고 움직여 큐티클을 약간 누릅니다.

그런 다음 한 손으로 현미경 스테이지의 측면을 두드려 큐티클을 통해 바늘을 밀어 넣습니다. 주입 패들 또는 버튼을 누르고 생식선 팔에 주입 혼합물을 천천히 채우고 바늘을 제거합니다. 다른 생식선 팔에 대해 단계를 반복합니다.

벌레가 주입되면 커버 슬립과 아가로스 패드를 제거하고 해부 현미경 아래에 놓습니다. 당겨진 모세관 피펫을 사용하여 M9 버퍼를 웜 위에 피펫으로 웜의 오일을 제거합니다. 이 치료를 수행하여 한천에서 기생충을 풀어줍니다.

10분 후 기생충이 완충액 내에서 몸부림치기 시작하면 당겨진 모세관 피펫을 사용하여 OP50 박테리아가 있는 NG 한천 플레이트로 이동합니다. 벌레가 회복되어 움직일 때까지 2-3시간 동안 접시를 섭씨 20도에 놓습니다. 복구되면 OP50을 사용하여 웜을 NG 한천 플레이트로 개별적으로 옮깁니다.

그런 다음 플레이트를 섭씨 25도의 인큐베이터로 옮깁니다. 수정 후 0-4시간에 0.02%정향유와 해수로 임신성 암컷을 먼저 마취하여 단세포 Parhyale 배아를 수집합니다. 화염으로 당겨진 둥근 유리 피펫과 둔한 3번 집게를 사용하여 복부 부화 주머니에서 배아를 부드럽게 긁어냅니다.

압축 질소를 사용하여 미세주입기와 미세조작기를 사용하여 해부 현미경으로 Parhyale 배아를 주입합니다. 1.5마이크로리터의 주입 혼합물을 마이크로로더 피펫 팁을 사용하여 당겨진 모세관 뒤쪽에 로드합니다. 주사 장치에 바늘을 설치한 후 해부 범위 아래에 있는 한 쌍의 집게를 사용하여 바늘 끝을 부러뜨립니다.

Halocarbon oil 700에 주입하고 기포의 직경을 측정하여 전달된 부피를 보정합니다. 면도날을 사용하여 경화제에서 물통을 잘라냅니다. 여과 살균된 해수로 반쯤 채우고 Parhyale 배아를 주사를 위해 여물통에 정렬합니다.

microinjection 설정을 사용하여 배아를 주입하고 주입하는 동안 한 쌍의 집게로 각 배아를 안정화합니다. 주입 후 유리 전사 피펫을 사용하여 배아를 여과 살균된 해수로 반쯤 채운 신선한 60mm 배양 접시에 배아를 옮긴 후 다양한 단계에서 배아를 해부하고 고정합니다. 인슐린 바늘 끝에 약 0.5인치 길이의 구부러진 텅스텐 와이어 조각을 끼워 해부 바늘을 만듭니다.

1밀리리터 주사기를 해부 바늘의 손잡이로 사용하고 수산화나트륨에서 바늘을 전류 아래에서 날카롭게 합니다. 3웰 유리 접시의 한 웰에 PEM 버퍼 9부, 10X PBS 1부, 32% PFA 1부로 구성된 갓 만든 용액을 반쯤 채웁니다. 3-5개의 배아를 접시에 넣고 날카로운 텅스텐 바늘로 구멍을 뚫어 구멍을 뚫고 약간 무딘 바늘로 구멍을 뚫어 안정시켜 노른자가 나오고 고정액이 흘러나오게 합니다.

한 쌍의 날카로운 텅스텐 바늘을 사용하여 Parhyale 배아를 둘러싼 바깥쪽 두 개의 막을 부드럽게 떼어냅니다. 배아를 더 튼튼하게 만들기 위해 고정제로 해부하되 막이 배아에 고정되어 막 제거를 더 어렵게 만드는 것을 방지하기 위해 빠르게 작업합니다. 항체 염색의 경우 총 15-20분, 현장 교잡의 경우 40-50분 동안 배아가 고정되도록 합니다.

때때로 편집 실험의 결과는 실험적 분석을 통해 가장 잘 평가됩니다. 야생형 T 세포와 CD25 녹아웃 세포의 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다. 유세포분석은 Cas9 RNP로 편집되지 않은 세포가 CD25를 발현한다는 것을 보여줍니다.

그러나 CD25가 녹아웃된 세포는 단백질을 발현하지 않습니다. 대규모 섭동의 경우 편집 결과에는 명확한 시각적 표현형이 있을 수 있습니다. 예를 들어, 야생형 Parhyale hawaiensis는 수영과 닻 다리가 있는 정상적인 복부를 가지고 있습니다.

Abd-B 유전자를 파괴하면 복부 수영 다리와 앵커 다리가 점프 다리와 걷기 다리로 대체되는데, 이는 일반적으로 흉부와만 관련이 있습니다. 표현형을 확인하는 것 외에도 실험자는 유전자형을 분석하여 전반적인 편집 효율성을 평가하고 특정 유전적 변화를 감지해야 합니다. 단일 클론의 경우, 이는 간단한 Sanger 염기서열분석을 통해 달성할 수 있습니다.

세포가 혼합된 집단에서는 보다 고급 염기서열분석 분석이 권장됩니다. 예를 들어, TIDE는 RNP 편집 풀 내의 개별 세포에서 발생한 모든 다양한 indel을 매핑할 수 있습니다. 이 절차를 처음 시도할 때 표 1에 나열된 포지티브 컨트롤 중 하나를 사용해 보십시오.

검증된 가이드 RNA를 사용하면 자신의 실험을 설계하기 전에 RNP로 편집하는 데 도움이 될 수 있습니다.