Name: 향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 학습하세요 CRISPR/Cas9 RNP 복합체를 이용한 다양한 세포 및 유기체의 표적 유전체 편집 방법을. 이 기술은 효율성이 높고 off-target 효과가 적어 유전 질환 연구와 치료에 활용됩니다.

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우리는 우리의 실험실과 이러한 방법의 개발에 그들의 공헌에 대 한 베이 지역 게놈 편집 커뮤니티의 많은 이전 일원을 감사합니다. 우리는 비판적으로이 원고를 읽고에 대 한 로스 윌슨을 감사 합니다.
제이크 Aronov 선물 알렉산더 Marson의 연구를 지원 하 고 국가 다 발성 경화 증 사회 (CA 1074-A-21)을 부여 합니다. 알렉산더 Marson 버로우즈 Wellcome 기금에서 의료 과학자에 대 한 경력 수상을 보유 하 고 찬 주 커 버그 Biohub 탐정입니다. 야 곱 E. 옥수수의 연구는 재생 의학에 대 한 리 카 싱 재단, 유산 의료 의료 연구소, 그리고 캘리포니아 연구소에 의해 지원 됩니다. Behnom Farboud와 바바라 J. 마이어의 연구 부분에 NIGMS 보조금 R01 GM030702 바바라 제이 메이어, 누가 하 워드 휴즈 의학 연구소의 조사에 의해 자금입니다. 에 린 자비스와 Nipam 헤 파 텔의 연구는 일부 NSF 그랜트 IOS-1257379에 의해와 린 자비스 인정 NSF GRFP와 Philomathia 대학원 장학금 지원.

저자 알렉산더 Marson와 야 곱 E. 옥수수는 스포트라이트 치료제의 공동 설립자. 야 곱 E. 옥수수 임무 치료제 고문 이며 그의 실험실에서 아 스 트 라와 화 이자 후원된 연구 지원을 받고 있다. 알렉산더 Marson는 주노 치료제와 협정 치료제, 고문 그리고 그의 실험실 주노 치료제, Epinomics, 및 사노 피에서 후 원하는 연구 지원을 받고 있다. 그의 실험실은 또한 Cas9 RNP 기술 관련 특허에 대 한 적용 됩니다.

강력한 게놈 프로토콜 편집 설정 셀에 선 또는 관심의 유기 체 요구 최적화 하 고 경험적이 섹션에서 설명한 몇 가지 주요 매개 변수 테스트. 여기에 제시 된 일반적인 접근 방법의 몇 가지 유사 콘텐츠를 시도 하는 것은 매우 좋습니다. 이 프로토콜의 주요 한계는 다른 셀을이 메서드를 적용 하는 또는 생물 공부, 수 종에 따라 다른 결과가 발생할 수 있습니다 및 높은 효율 유전자 녹아웃 하는 실험적인 디자인 DNA 삽입을 홍보 하지 않을 수 있습니다. 따라서, 여기에 제시 된 및 아래에 설명 된 문제 해결 방법으로 시작 하는 것이 좋습니다.
게놈 편집 시 품질 문제 해결: 생성 또는 높은-품질의 시 약을 구입 어떤 게놈 프로토콜 편집에서 중요 한 단계입니다. Cas9 단백질 실험실에서 정화 하거나 상업적으로 구매 될 수 있습니다. 많은 프로토콜 RNP 조리법, Cas9에 대 한 최종 농도 참고 하지만 최적의 유전자 활동 편집 소스에 따라 달라 집니다 어떤 개별 Cas9 단백질 준비의 구체적인 활동에 따라 달라 집니다. 여기에 제시 된 프로토콜 동작 고려 RNP 넣는 Cas9 수준에 의해 최적 농도 설정 하는 데 사용의 양을 최적화: 불필요 한 대상에서 분열으로 인 없이 매우 구체적인 대상 DNA 분열을 제공 과도 한 Cas940.
가이드 RNA의 순도 균질 성공22편집 게놈의 결정을 수도 있습니다. 구입한 sgRNAs 또는 별도 crRNA 및 tracrRNA 구성 요소는 일반적으로 높은 품질의 시 약 하 고 다양 한 화학 수정 RNA 저하 문제를 방지 하거나 스며들 게 RNP91에 추가 기능을 사용할 수 있습니다. 화학적 수정 gRNAs 표준 게놈 편집 실험에 필요한 되지 않을 수 있습니다, 일부 단체는 훨씬 더 높은 효율성과 같은 시 약, 그래서 그들은 과정을 습득 후 시도할 만한 가치가 있을 수 있습니다 또는 때 편집 관찰 gRNA 저하 문제22,91나타납니다. 생체 외에서 전사 및 후속 젤 정화 실험17,21,,4950편집 일상적인 게놈에 대 한 충분 한 될 수 있는 저렴 한 대안 이다. 또한, 일반적으로 균질 성 gRNA 인구에서 vivo에서, 개별 가이드의 절단 ribozyme 및 tRNA 기반을 포함 한 생산에 적용, 연장 될 수 있습니다 체 외에서 RNA 준비 청소기를 생성 하는 몇 가지 방법을 제품92
가이드 RNA와 DNA 기증자 디자인 팁: 가이드 RNA 선택 대상에서 분열의 가능성을 최소화 하면서 매우 효율적인 대상에 편집 달성에 중요 한 요소 이다. 가이드 선택에 도움이, 몇몇 연구는 컴파일하는 데 사용 높은 처리량 화면 다음-세대 시퀀싱과 함께 성공적인 가이드47,79,,9394의 시퀀스 기능 , 9596. 이러한 기능은 예측 알고리즘 및 가이드 선택44,45,,4647,48에 도움을 온라인 도구를 개발 하기 위해 사용 되었습니다. 이러한 알고리즘은 가이드 RNA 식에 대 한 DNA 기반 시스템을 사용 하 여 화면에 기초 하 고. 가이드는 Pol III 발기인을 사용 하 여 표현 되 고 그들의 표정은 따라서 조기 종료 때 마주치의 uracil97,98, 트랙 등 유류 III 전사와 관련 된 제한 하는 경향이 99. 그러나, RNPs 사용 하 여 만든 체 외에-종합된 가이드 RNAs 그 우려를 무시 하 고 가이드 디자인에 제약을 간소화. 이 알고리즘에서 등장 하 고 매우 효과적인 게놈 편집과, 다 수의 연구에서 확인 되었다 일반적인 기능 퓨 린, 특히는 구 아닌, 가이드의 특정 대상 시퀀스의 3 ' 끝의 존재 이다. 이 가이드 기능 C. 선 충, 초파리, 그리고 zebrafish65,,100101포유류에서 배열 하는 생물 중 매우 성공 했다. 또한, C. 선 충에 대 한 가이드의 대상 지역의 3 ' 끝에 GG 디뉴클레오티드 가이드 디자인은 매우 효과적인 가이드 RNAs65예측을 위한 효과적인 전략. 이상적으로,는 특정된 응용 프로그램에 대 한 가장 성공적인 결정 하는 동시에 여러 명의 가이드를 테스트 합니다.
DNA 순서는 게놈으로 소개 하려고, 할 때 기증자 또는 템플릿 DNA의 디자인은 또한 중요 한. 단일 가닥 oligonucleotide 기증자 (ssODNs) 다른 일반적인 복구 템플릿, 선형 더블-좌초 및 플라스 미드 DNA54,,55102보다 더 안정적으로 삽입 됩니다. 일부 loci에서 비 대상에 보완 또는 DNA 물가 전치 고 상 동 팔 길이27,55에 비대칭을 ssODNs와 HDR 효율성을 개선할 수 있습니다. 복구 템플릿 컷된 사이트에 삽입 되 고 있기 때문에 대상된 시퀀스를 포함, 기증자 DNA 게놈 삽입 전후 고착에서 Cas9를 방지 하기 위해 단계를가지고 한다. 이 하 침묵 돌연변이 팸 시퀀스 또는 씨앗 지역 삽입된 유전자21,103의 기능을 유지 하면서 Cas9에 의해 인정을 피하 여 수행 됩니다. PAM에도 단일 뉴클레오티드 변화 바인딩104폐지 가능성이 있지만, 안전을 위해 적어도 4 개의 뉴클레오티드를 변경 하려고 합니다.
의미와 미래의 응용 프로그램: CRISPR Cas9와 함께 편집 하는 게놈 어떤 유기 체의 손쉬운 유전자 조작 사용 강력한 방법으로 떠오르고 있다. 편집 Cas9 RNP와 처음에 조금 더 많은 노력을 소요 아니지만 나면 시 약 및 프로토콜은 실험실에서 사용 하는 것은 간단. 적은 대상 오프 효과24,,2526 HDR를 통해 달성 하기 어려운 유전자 삽입을 포함 하 여 더 높은 전반적인 편집 효율성 리드 플라스 미드 DNA 대신 조립된 RNP와 셀 편집 , 27 , 29. 경험와 유전자 발현, RNA 저하, 단백질 폴딩, gRNA 및 Cas9 분자 셀22,23내 별도로 합성 간의 연결 문제를 방지 하는 더. 또한 insertional mutagenesis에 대 한 안전 우려를 circumvents RNP 편집 및 바이러스 전달 방법 됩니다 때 발생할 수 있는 지속적인된 식14임상 사용. 이러한 이점 때문에 전 임상을 실시 하는 많은 과학자 개념 증명 실험 부탁 RNP 인간의 치료 응용 프로그램에 대 한 편집. 둘 다 vivo에서 및 전 비보 RNP 기반 게놈 편집 접근을 하거나 심지어 조건, 듀 켄 씨 근이 영양 증105 및 낫 세포 질병27 같은 유전 질환에서의 다양 한 개발은 에이즈29 고 암11. 흥미롭게도, Cas9 RNP는 점점 농업 공학 식물33,,3436의 편집 ' DNA 무료 ' 수 있기 때문에 대 한 전달 방법으로 사용 됩니다.

fThe CRISPR Cas9 시스템 과학자 들은 게놈1의 대상된 영역을 변경할 수 있습니다. 이 신속 하 고 저렴 한 기술 기초 연구에 혁명을 고2넘어 개인된 질병 치료, 정밀 농업의 발전에 지대한 영향을 만들 것을 약속 드립니다. CRISPR 편집 democratizing 도구 이며 게놈 엔지니어링, 그냥 기본적인 분자 생물학 기술 없이 특정 전문 지식이 필요로 새로운 실험실에는 시스템을 구현 합니다. 연구원은 지금 이전 다루기 힘든 생물 유전자 조작3,4에 대 한 몇 가지 대체 수단을 공부할 수 있습니다. 지난 5 년간 혼자 CRISPR 게놈 편집 사용 되었습니다 200 개 이상의 다른 척추 동물, 무척추동물, 식물, 그리고 미생물 종 하.
CRISPR 간결한 방어 통로에서 적응, 사이트별 게놈 편집에 필요한 핵심 요소 Cas9 단백질의 S. pyogenes 에서 일반적으로 및 추가 핵 지 방화 신호 (NLS), 그리고 그것의 전문화 된 코 돈 최적화 RNA 가이드5,6. 여기 설명 하지, 비록 다른 Cas9 orthologues 또는 CRISPR endonucleases 또한 사용할 수 있습니다. 자연스럽 게 발생 gRNA 두 별도로 베낀된 조각, CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스 활성화로 구성 된다 crRNA (tracrRNA)7. 이러한 RNAs 단일 가이드 RNA (sgRNA)8로 알려진 단일 사본으로 융합 될 수 있다. 대부분 게놈 편집자 선택 유선형된 sgRNA9, 듀얼 가이드 이기도 하지만10,11을 정기적으로 사용. 경험 20-뉴클레오티드 (nt) 게놈 DNA 대상, 그것은 protospacer 인접 한 모티브 (PAM), 라는 Cas9 인식에 필요한 짧은 라이센스 서명 옆 거짓말 보장 선택한 보완 시퀀스12 포함 하는 gRNA 디자인 .
일단 셀, 안으로 RNP 복잡 한 게놈 목표, gRNA 기초 쌍 무료 dna 물가, 및 다음 효소 앞 이중 가닥을 생성 하기 위해 두 DNA 가닥 휴식2. 두 개 이상의 경로 중 하나에 의해 DSB를 해결 하는 세포 수리 기계: 오류가 아닌-동종 끝 결합 (NHEJ) 통로 또는 상 동 감독 수리 (HDR)는 완벽 하 게 틈의 양쪽에 상 동의 ' 무기'를 포함 하는 DNA를 통합. 이전 복구 경로 일반적으로 이끌어 낸다 indel 형성과 필연적인 유전자 장애, 후자 허용 경험을 삽입 하거나 DNA 시퀀스1을 변경 하는 동안.
편집 효율성과 정확도는 Cas9와 gRNA는 셀에 입력 하는 방법에 따라 달라 집니다. 이러한 구성 요소는 배양된 세포, 배아, 또는 핵 산의 모양으로 또는 유기 체 소 RNP 복잡 한13,,1415로 전달 수 있습니다. 일반적인 핵 산 기반 배달 방법에는 바이러스 성 변환, transfection, 또는 electroporation mRNA 또는 플라스 미드 DNA의 포함 됩니다. Cas9 단백질 및 가이드 RNA는 세포 내에서 생산 다음 및 그들은 복합물을 형성 하.
RNP의 직접 배달 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 별도 정화를 요구 한다. 이 사내, 행 해질 수 있다 또는 단백질과 sgRNA 여러 상용 공급 업체 중 하나에서 구입하실 수 있습니다. 획득 되 면 Cas9와 gRNA 효소 유능한 RNP 복합물을 형성 하기 위하여 섞는 그리고 수정 된 달걀/배아, 지질에 기초를 둔 transfection16또는 electroporation에 직접 주입 하 여 셀 소개. RNP 편집의 첫 번째 보고서 관련 C. 선 충 의 생식 선17에 주입. Microinjection은 여전히 효과적인 electroporation 마우스18,19 와 쥐20 배아에서 입증 되었습니다 비록 배아와 전체 유기 체, RNP 도입의 선호 하는 수단. 우리는 직접 주입 RNP C. 선 충 의 생식 선 및 P. hawaiensis 배아에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 특수 유형의 electroporation RNP 인간의 기본 셀을 편집할 때 제공 하는 것이 좋습니다. 이 방법은, nucleofection, 최적화 된 electroporation 프로그램 및 셀 형식 관련 솔루션을 포함 하 세포질 및 핵21입력 RNP 하며
게놈 RNP 편집 여러 가지 이점을 제공 합니다. 때문에 단백질 및 RNA 구성 요소 조립, 배달 하기 전에 품질을 보장 될 수 있는, RNP 편집 관련 핵 산 기반 배달 된 많은 함정을 피할 수 있습니다. 즉, Cas9 인코딩 DNA 주인 게놈으로 통합의 위험, mRNA는 결코 저하, 노출 그리고 vivo에서 gRNA 또는 단백질 식, 접는, 그리고 협회22,23문제 circumvents. 또한, 낮은 독성 및 플라스 미드 기반 식, 셀24,25,,2627안으로 RNP의 짧은 반감기의 결과 보다 훨씬 적은 오프 대상 이벤트 리드 RNP 사용 하 여.
마지막으로, RNP 편집 명백 하 게 이끌어 인간 세포 라인, 1 차 셀의 다양 한에서 높은 편집 속도 같은 섬유 아 세포, 배아 줄기 세포 (ESCs), 유도 만능 줄기 세포 (iSPCs), HSPCs, T 세포16,24, 25,26,27,,2829; 무척 추 동물을 포함 하 여 C. 선 충, P. hawaiensis및 과일 파리3,,1730; zebrafish, 쥐, 및 쥐31,32; 처럼 척 추가 있는 종 식물 종 등 애기, 담배, 상 추, 쌀, 포도, 애플, 옥수수, 밀33,,3435,36; 그리고 Chlamydomonas, 푸른 곰 팡이, 및에서 Candida 종37,,3839. Indel 형성의 주파수 RNP 플라스 미드 배달에 비해 사용 하 높을 수 있습니다 그리고 HDR 중재 DNA 삽입25,,2729달성 하기 쉬울 수 있다.
여기에 설명 된 프로토콜 Cas9 RNP 사용 하 고 다양 한 생물 학적 시스템40,41, 특히 일 수 없는 셀에에서 적용 하는 것은 간단를 효과적이 고, 쉽게 적응할 수 있는 기술 이다 그리고 정확한 유전자 조작에 대 한 확고 한 시스템 없이 유기 체에서. 우리는 디자인 가져오고 다른 모델 세포 유형 및 유기 체 그것의 사용을 취재 하기 전에 Cas9 RNP를 조립 하는 방법을 설명 하 여 시작 합니다. 조 혈 줄기/뿌리 (HSPCs) 세포 그리고 T 세포 그들은 함께 단계 2와 3이이 프로토콜의 덮여 있다 그래서 동일한 방법을, nucleofection를 사용 하 여 편집 됩니다. C에 대 한 절차를 편집. 선 충 4-5, 단계에 설명 되어 있습니다 및 P. hawaiensis 편집 단계 6과 7에에서 덮여 있다. 마지막으로, 모든 유기 체에서 유전자 편집 실험의 성공 유전자 시퀀싱에 의해 사정 될 수 있습니다, 모든 세포와 유기 체는 프로토콜에서 설명에 대 한 가능한 분석 방법을 설명 하는 하위 단계 8 단계에서 설명 되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Reagents/Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA oligonucleotides</td><td>Integrated DNA</td> <td>Technologies-IDT</td><td>는 표 1 가이드 RNA를 포함한 맞춤형 DNA 염기서열을 제공할 예정이다</td></tr><tr><td></td><td>Synthego-Synthego</td><td></td>는 <td>표 1에 포함된 표적화 염기서열을 포함하는 맞춤형 sgRNA를 포함하여 S. pyogenes Cas9에 대한 고품질 sgRNA를 제공할</td></tr> 예정이다 <tr><td>정제된 Cas9 단백질(EnGen&nbsp; Cas9 NLS,&nbsp;S. pyogenes)</td><td>New England Biosciences</td><td>M0646T</td><td>가능하다면, Cas9를 직접 정제하거나 현지 핵심 시설에서 구입하는 것이 더 저렴한 옵션입니다.</td></tr><tr><td>정상 주변 혈액 CD34+ 줄기/전구 세포</td><td>AllCells</td><td>PB032-2</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM&nbsp;</td><td>StemCell Technologies</td><td>09650</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan CC110</td><td>StemCell Technologies</td><td>02697</td><td></td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 매체, 중탄산나트륨, L-글루타민 없음, 액체</td><td>Sigma</td><td>R0883-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade; 인간 T 세포 분리 키트</td><td>Stemcell</td><td>17951</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플레이트, 96 웰, 라운드</td><td>Fisher Scientific</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>CTS (세포 치료 시스템) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Life Tech</td><td>40203D&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Reombinant Human IL-2</td><td>UCSF Pharmacy</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SepMate-50 500팩 IVD</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85460</td><td></td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP-50</td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr> <tr><td>Petri Dish의 선충 성장 배지 한천</td><td>-</td><td>-</td><td>Stiernagle, T 참조(ref. 59)</td></tr><tr><td>표준 붕규산 유리 모세혈관과 필라멘트:&nbsp; 4 인치 (100 mm), 1/0.58 OD/ID</td><td>월드 정밀 기기</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>단일 배럴 표준 보로실리케이트 유리 캐필러리: 6 인치 (152 mm), 2/1.12 OD/ID&nbsp;</td><td>월드 정밀 기기</td><td>1B200-6&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리; 24 &times; 50 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544E</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리; 22 &times; 22 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-518-105K</td><td></td></tr><tr><td>Apex LE 아가로스</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon oil 700</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H8898-100ML</td><td></td></tr><tr><td>pCFJ90 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>19327</td><td></td></tr><tr><td>압축 질소</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mM 배양 접시</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>모세관 필라멘트: 4 인치 (1.0 mm)&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>T2100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 (100 &times; 15 mm)</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 와이어 (0.005 in. 직경)</td><td>Ted Pella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfluoroalkoxy alkane (PFA)</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marine</td> <td>salt-9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>" pasteur pipettes</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제-프리 워터</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td><강한>장비</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4D 핵펙터</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>MZ75&nbsp; 실체현미경</td><td>Leica&nbsp;</td><td>생산 중단. 현재 모델은 M80 실체현미경</td><td></td></tr><tr><td>Axio Vert35 도립 위상차 형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td>생산 중단입니다. 현재 모델은 Axio VertA.1</td><td></td></tr><tr><td>레이저 기반 마이크로피펫 풀러(C. elegans 프로토콜용)</td><td>Sutter Instrument&nbsp;</td><td>FG-P2000</td><td></td></tr><tr><td>Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator</td><td>Narishige International</td><td>MO-202U</td><td></td></tr><tr><td>Coarse manipulator</td><td>Narishige International</td><td>MMN-1</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller (for P. hawaiensis protocol)</td><td>Sutter Instrument&nbsp;</td><td>P-80/PC</td><td></td></tr><tr><td>마이크로인젝터(P. hawaiensis 프로토콜용)</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>마이크로로더 피펫 팁</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>NG-agar</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 cas9 ribonucleoprotein 편집

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

사이트별 진 핵 게놈 편집 CRISPR (클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복)-Ca (CRISPR 관련 된) 시스템 신속 하 게 다양 한 생물 학적 질문을 추구 하는 연구원 사이 평범한 되고있다. 사용자는 가장 자주 쉽게 재설정된 가이드 RNA (gRNA)와 함께 복잡 한 연쇄 상 구 균 pyogenes 에서 파생 하는 Cas9 단백질을 사용 합니다. 이러한 구성 요소는 셀에 도입 하 고 이중 가닥 DNA (dsDNA) 게놈의 상호 보완적인 영역을 페어링 자료를 통해 효소 앞 두 배 물가 틈 (DSB)를 생성 하기 위해 두 가닥. 후속 복구 무작위 삽입 또는 삭제 이벤트 (indels) 또는 휴식의 사이트에서 실험 제공 DNA의 이끌어 낸다.
순화 된 단일 가이드 RNA와 Cas9 단백질, 소는 RNP 형성 하 고 세포에 직접 전달의 사용은 매우 효율적인 유전자 편집 달성 하기 위한 강력한 접근 이다. RNP 편집 특히 유전자 삽입, 결과 달성 도전 자주 그의 속도를 향상 시킵니다. 셀 내에 Cas9 RNP의 짧은 지 속성은 플라스 미드를 통해 배달에 비해 적은 오프 대상 이벤트 리드.
자사의 장점에도 불구 하 고 CRISPR 유전자 편집의 많은 캐주얼 사용자 덜이 기술을 잘 알고 있다. 낮은 진입 장벽, 우리는 그것의 독특한 혜택 및 다양 한 응용 프로그램 컨텍스트 범위에서 RNP 전략을 구현 하기 위한 상세한 프로토콜 개요. 우리는 두 가지 유형의 기본 인간 세포, T 세포 및 조 혈 줄기/시 조 세포 (HSPCs)에서 편집 커버. 우리는 또한 어떻게 편집 하면 Cas9 RNP 최근 클래식 모델 거 위 꼬마 선 충 그리고 더 많은 포함 한 전체 유기 체의 손쉬운 유전자 조작 도입 모델 갑각류, Parhyale hawaiensis을 보여줍니다.

이러한 실험 쇼 어떻게 조립된 Cas9 RNP 기본 세포와 모든 생물의 유전자 조작에 사용할 수 있습니다. 연구원 정화 또는 구매 Cas9 단백질 및 sgRNA, 콤플렉스를 미리 구성 하는 두 요소를 결합 하 고 그들의 세포 또는 관심의 유기 체에는 RNP 소개. 후 발생 및 출생 (있는 경우) 다음 세대의 자손, 고기에 대 한 확인 및 수집 유전형 셀 편집을 위한 충분 한 시간을 허용 합니다. 고기는 기능적인 분석 실험, 식 분석, 시각화 (눈 또는 현미경 검사 법), 또는 실험에 따라 다른 방법을 통해 관찰 될 수 있습니다.
예를 들어 HSPCs 낫 세포 질병의 원인 β-globin 돌연변이 해결 하기 위해 편집 된 적혈구로 분화 수 하 고 건강 한의 생산 또는 겸 상 적혈구 헤모글로빈27,87 (그림 1에 대 한 분석 A). T 세포는 높은 선호도 일리노이-2 수용 체 유전자, CD25 밖으로 노크 편집 (IL2RA), 수 표면 얼룩 및 교류 cytometry88, 분석 하 고 일리노이-2 자극 (그림 1B신호 응답을 감지 하기 기능 분석 ). T 세포는 HIV 감염89 의 효능을 포함 하 여 다른 고기에 대 한 평가 필요로 하는 많은 임상으로 중요 한 방법으로 재설정 또한 수 그리고 vivo에서 antitumor 효능 자동차 T의 세포11.
공동-CRISPR/co conversion 심사 방식을 사용 하 여, C. 선 충 벌레 두 loci62에서 동시에 편집 됩니다. Dpy 10 참조 유전자는 ssODN를 사용 하 여에 HDR 쉽게 득점 지배적인 dpy 10 이득의 기능 돌연변이에서 템플릿 결과 복구 합니다. Heterozygous F1dpy-10(gof) 동물 롤러 (Rol) 이며 homozygous dpy-10(gof) 동물은 땅딸막한 (Dpy). 표현 형의 존재는 Cas9 편집이 동물에서 발생 나타내고 식별 Rol 또는 Dpy F1 동물에서 두 번째 장소에서 편집 이벤트의 확률을 향상 시킵니다. 성공적인 편집 실험 주입된 P0 웜 저조한 Rol 또는 Dpy90는 20 이상의 F1 자손의 33-50% 발생 한다. 그것은 다음 wildtype dpy 10 반환 하 여 관심의 homozygous 편집에 대 한 선택 비 Rol 동물을 선택 수 있습니다. 엄지손가락의 규칙으로 서 co CRISPR 참조 유전자를 대상으로 하는 crRNA의 농도 대상으로 관심사의 유전자는 crRNA의 그 절반 이어야 한다. 관심사의 유전자에는 편집, 복구 되지 않은 경우 원하는 돌연변이 복구의 가능성을 높이기 위해 두 CRISPR RNAs의 비율을 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 참조 유전자 crRNA에 상대적인 관심사의 유전자에 대 한 crRNA의 양을 증가 하는 것은 벌레 벌레는 또한 참조 유전자 소재 시에 편집의 인구 내의 관심사의 유전자에서 편집 보유의 비율을 증가 합니다. 공동 변환 주파수가 다르지만 요금은 일반적으로 20-60%, F1 세대 (그림 1C)에서 homozygous 편집 자주 떨어졌다.
P. hawaiensis 파묻혀 복 B 유전자 (Abd-B) 밖으로 노크 편집 표시 분명 형태학 이상이3 (그림 1D). 이 유전자는 올바른 복 부 패턴화 하기 위한 필요 하며 흉부 유형 점프 및 교체는 일반적으로 수영, 앵커 다리 다리 걷기의 중단 결과 복 부에 존재.
결정 하는 genotypic 수준에서 결과 편집 하는 게놈 시퀀싱 또는 생체 외에서 분석 결과 시퀀스 변경 사항을 감지 하는 필요 합니다. 여기, 우리가 표시 대표 시퀀싱 데이터에서 우리의 모델 세포 유형 및 유기 체, 정량화 편집에 다른 접근을 강조. 그림 레이블 모든 방법을 여기에 표시 된 어떤 생물 학적 시스템에 적용 될 수 있기 때문에 일반화는 note.
시퀀싱-기반 접근 기술적인 복잡성과 결과의 깊이에서 변화 한다. 클론 편집된 인구 또는 쉽게 분리할 수 있는 개별 유기 체, 편집된 개인 게놈 DNA 추출 다음 시퀀싱 수 있습니다. 표준 생어 시퀀싱 결과 순서 변경 기능 (그림 2A)를 방해 것이 가상 frameshifts와 주어진된 개인에서 Cas9 컷 사이트에서 발표할 예정 이다. 시퀀싱에 사용 되는 온라인 도구가입니다 다른 생어 시퀀싱 기반 접근 방식을 개별 돌연변이78보다는 오히려 혼합된 인구에 적용 될 수 있는. 시퀀스는 주된 시퀀스 결과 뿐 아니라 전체 편집 효율 대략적인 수 있는 온라인 도구와 분석 된다. 대표적인 데이터 그림 2B에 나와 있습니다.
여기 설명 하는 가장 철저 한 시퀀싱 방법을 깊은 시퀀싱 (높은 처리량 또는 다음-세대 시퀀싱 라고도 함)입니다. 이 메서드는 혼합된 인구에 개별 게놈에서 DNA 시퀀스를 제공합니다. 이러한 데이터 다양 한 방법으로 설명 될 수 있다. 여기, 우리 편집 결과 (그림 2C)에 따라 편집된 셀에서 개별 연속 읽기를 분류 했습니다. 대부분의 세포는 일반적으로 유전자 장애 귀착되는 NHEJ 통로 통해 편집 됩니다. 다른 사람에서는, HDR27를 통해 다른 버전에 대 한 대상 유전자 스와핑할 되어 있다.
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57350/57350tbl1v2.jpg"> 표 1: 긍정적인 예비 게놈 실험 편집에 대 한 제어. 이 표에서 처음 게놈 편집 하는 각 셀이이 프로토콜에서 설명 하는 유기 체에서 실험을 수행 하는 데 필요한 중요 한 정보를 보여 줍니다. 이러한 매개 변수를 다음 프로토콜을 테스트 하는 데 사용할 수 있는 성공적인 결과가 것 또는 비교를 한 번에 대 한 기준으로는 실험 대상으로 그들의 자신의 관심사의 유전자. F: 앞으로, r: 리버스, HDR: homology 감독 수리. <a href="/files/ftp_upload/57350/Farboud_et_al_Table_1.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57350/57350fig1v2.jpg"> 그림 1 : 대표 phenotypic 결과 Cas9 RNP 편집 기본 인간 세포와 유기 체에서. (A) 후 성공적인 게놈 편집, HSPCs 단계의 erythroblasts로 분화 하는 겸 상 적혈구 헤모글로빈 보다는 더 많은 기능 헤모글로빈을 생산할 예정 이다 보여주는 HPLC 추적입니다. 돌연변이 적혈구 생산 겸 상 적혈구 헤모글로빈 (HbS) 동안 성공적으로 편집 셀 태아 헤모글로빈 (HbF) 뿐만 아니라 건강 한 헤모글로빈 (HbA와 HbA2)을 생산할 예정 이다. 흡수도 임의 단위 (au) 그래프. 이 패널 처음 윗 et 그리고 다른 곳 에 게시 된 27. 과학의 전진을 위한 미국 협회에서 허가로 증 쇄 하는. (B) 각 조건에 대 한 왼쪽에이 패널 CD25 유전자 RNP와 제압 된 후 T 세포 표면 얼룩이 CD25를 표현 하지 않습니다 보여주는 흐름 cytometry 데이터를 보여줍니다. CD25 풍부 x 축에서 y 축에 셀 크기와 플롯 됩니다. 각 조건에 대해 오른쪽이 패널 일리노이-2와 유도 후 인-Stat5 (pStat5) 부 량을 보여줍니다. 신호는 일리노이-2 수용 체 (CD25 코) 결 석 때 감소 된다. PStat5 풍부는 x 축에 표시 하 고 일리노이-2 입력의 세 가지 다른 수준에서 발생 하는 데이터는 수직으로 비교 됩니다. (C)이 이 패널 꼬마 선 충 공동-CRISPR/co conversion 화면 dpy 10 공동 변환 표식으로 타겟팅을 보여줍니다. 2 안내 RNAs 대상 두 loci, dpy-10 당신의 좋아하는 유전자 (yfg), 동일한 P0에서-주입 된 동물. Dpy 10 에서 HDR 결과 Rol 또는 Dpy 표현 형. Rol 또는 Dpy F1 동물의 선택 하면 식별 하는 두 번째 장소에서 편집의 가능성이 높아집니다. (D)이 이 패널 wildtype Parhyale hawaiensis 파묻혀 수영 및 앵커 다리 정상적인 인체를가지고 있음을 보여준다. Abd-B 노크 아웃 파묻혀 (F0 개인)는 복 부 흉부 쪽으로 변형 개발. 따라서, 수영 및 앵커 다리 간은 고 정상 흉부와 관련 된 점프 그리고 다리에 의해 대체. <a href="/files/ftp_upload/57350/57350fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57350/57350fig2v2.jpg"> 그림 2 : 편집 결과 분석 방법에서 전형적인 결과. (A) 가이 패널에서 개별 F1 P. hawaiensis , 포함 한 유기 체 wildtype 시퀀스 및 열려있는 독서 프레임을 이동 하 여 유전자 기능을 방해 하는 3 개의 다른 indels 시퀀싱 결과 생어의 예를 보여줍니다. (B) 이 조 수 결과 삽입 및 시퀀스 된 T 세포의 수영장에서 Cas9 대상 사이트에서 발생 한 삭제 이벤트의 범위를 보여. X 축 지정된 삽입 또는 삭제 뉴클레오티드에의 길이 나타냅니다. (C) 이러한 깊은 시퀀싱 결과 표시 없이 nucleofection 또는 gRNA, 아무 게놈 편집 및 성공적인 그대로 Cas9 RNP와 편집, 결과별 DNA 수리 HSPCs. <a href="/files/ftp_upload/57350/57350fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

소 Cas9를 활용 하 여 복잡 한 ribonucleoprotein (RNP)은 정확 하 고 효율적인 게놈 편집에 대 한 강력한 방법입니다. 여기, 우리가 강조의 유틸리티 세포와 생물의 광범위 한 범위에 걸쳐 기본 인간 세포 등 모두 클래식 하 고 모형 유기 체를 신흥.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 CRISPR/Cas9 리보핵단백질 복합체를 사용하여 다양한 세포 및 유기체에서 표적 게놈 변화를 만드는 것입니다. 이 방법은 연구자에게 모델 및 비모델 유기체의 변형되지 않은 게놈에서 맞춤형으로 설계된 삽입, 삭제 및 치환을 생성할 수 있는 기능을 제공함으로써 근본적인 생물학적 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 플라스미드 DNA 대신 리보핵단백질 또는 RNP 복합체를 사용하는 주요 이점은 효율성이 더 높고 off-target event가 감소한다는 것입니다.이 기술의 의미는 암, HIV 또는 유전 질환과 같은 것과 싸우기 위한 생체 외 요법으로 확장됩니다. 게놈 편집은 유해한 돌연변이를 교정하거나 해로운 질병과 싸우는 세포의 능력을 향상시키는 데 사용될 수 있기 때문입니다. 따라서 이 방법은 1차 인간 세포, 예쁜꼬마선충(C.elegans) 및 파히알레 하와이엔시스(Parhyale hawaiensis)에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.이전에는 다루기 어려웠던 유기체를 포함하여 수백 개의 다른 시스템에서 유전적 변화를 일으키는 데 적용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 가이드 RNA의 설계 및 준비로 이 절차를 시작합니다. 1-2배의 몰 크기의 가이드 RNA를 총 10마이크로리터 부피의 Cas9 단백질 200피코몰과 혼합하여 RNP 복합체를 조립합니다.매우 천천히 농축된 Cas9를 가이드 RNA에 약 30초 동안 첨가하여 피펫과 함께 빠르게 원을 그리십시오. 최종 Cas9 농도를 20 마이크로 몰로 가져옵니다. 다음으로, 각 큐벳 웰에 10마이크로리터의 RNP를 추가합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 HSPC를 준비한 후 혈구계로 세포를 계수하고 큐벳당 150, 000 - 200, 000개의 세포를 원심분리기 튜브로 전기천공합니다. 중력의 100배로 튜브를 10분 동안 돌려 세포를 펠릿화합니다. 피펫이나 진공 청소기로 상층액을 흡인하여 기포를 제거합니다.큐벳 웰당 20마이크로리터의 전기천공(electroporation) 완충액으로 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다. 그런 다음 이미 10 μl의 RNP를 보유하고있는 각 큐벳 웰에 150, 000 - 200, 000 HSPC를 포함하는 20 마이크로 리터의 셀을 추가하고 기포를 생성하지 않고 위아래로 피펫팅하여 잘 혼합합니다. 마지막으로, 큐벳을 Nucleofector에 넣은 후 전기천공합니다.HSPC의 경우 펄스 코드 ER-100을 사용합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 아가로스 패드에서 예쁜꼬마선충을 준비하는 것으로 시작합니다. 아가로스 주사 패드를 놓고 슬립을 해부 내시경에 덮습니다.웜 픽을 사용하여 패드의 한쪽 가장자리를 따라 할로카본 오일의 작은 트랙을 놓습니다. 그런 다음 오일로 코팅 된 웜 픽을 사용하여 NG 한천 플레이트에서 여러 웜을 들어 올려 오일 트랙으로 들어 올립니다. 속눈썹이나 고양이 수염과 같은 피펫에 가는 털을 붙이고 벌레를 평행하게 놓고 벌레를 아가로스 패드에 부드럽게 밀어 넣습니다.미세 주입 절차에 익숙해질 때까지 한 번에 하나의 웜만 주입하십시오. 제자리에 놓고 패드에 부착하면 웜 픽 끝에서 Halocarbon 오일 몇 방울을 더 떨어뜨려 웜을 오버레이합니다. 장착된 웜이 있는 커버 슬립을 주입 현미경에 놓습니다.낮은 배율에서 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 RNP 용액으로 채워진 주사 바늘에 수직으로 웜을 배치합니다. 고배율로 전환하고 생식선 팔에 인접한 바늘을 재배치하며, 이는 파키텐 중기에서 후기의 핵 근처 영역에 해당합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘을 벌레에 대고 움직여 큐티클을 약간 누릅니다.그런 다음 한 손으로 현미경 스테이지의 측면을 두드려 큐티클을 통해 바늘을 밀어 넣습니다. 주입 패들 또는 버튼을 누르고 생식선 팔에 주입 혼합물을 천천히 채우고 바늘을 제거합니다. 다른 생식선 팔에 대해 단계를 반복합니다.벌레가 주입되면 커버 슬립과 아가로스 패드를 제거하고 해부 현미경 아래에 놓습니다. 당겨진 모세관 피펫을 사용하여 M9 버퍼를 웜 위에 피펫으로 웜의 오일을 제거합니다. 이 치료를 수행하여 한천에서 기생충을 풀어줍니다.10분 후 기생충이 완충액 내에서 몸부림치기 시작하면 당겨진 모세관 피펫을 사용하여 OP50 박테리아가 있는 NG 한천 플레이트로 이동합니다. 벌레가 회복되어 움직일 때까지 2-3시간 동안 접시를 섭씨 20도에 놓습니다. 복구되면 OP50을 사용하여 웜을 NG 한천 플레이트로 개별적으로 옮깁니다.그런 다음 플레이트를 섭씨 25도의 인큐베이터로 옮깁니다. 수정 후 0-4시간에 0.02%정향유와 해수로 임신성 암컷을 먼저 마취하여 단세포 Parhyale 배아를 수집합니다. 화염으로 당겨진 둥근 유리 피펫과 둔한 3번 집게를 사용하여 복부 부화 주머니에서 배아를 부드럽게 긁어냅니다.압축 질소를 사용하여 미세주입기와 미세조작기를 사용하여 해부 현미경으로 Parhyale 배아를 주입합니다. 1.5마이크로리터의 주입 혼합물을 마이크로로더 피펫 팁을 사용하여 당겨진 모세관 뒤쪽에 로드합니다. 주사 장치에 바늘을 설치한 후 해부 범위 아래에 있는 한 쌍의 집게를 사용하여 바늘 끝을 부러뜨립니다.Halocarbon oil 700에 주입하고 기포의 직경을 측정하여 전달된 부피를 보정합니다. 면도날을 사용하여 경화제에서 물통을 잘라냅니다. 여과 살균된 해수로 반쯤 채우고 Parhyale 배아를 주사를 위해 여물통에 정렬합니다.microinjection 설정을 사용하여 배아를 주입하고 주입하는 동안 한 쌍의 집게로 각 배아를 안정화합니다. 주입 후 유리 전사 피펫을 사용하여 배아를 여과 살균된 해수로 반쯤 채운 신선한 60mm 배양 접시에 배아를 옮긴 후 다양한 단계에서 배아를 해부하고 고정합니다. 인슐린 바늘 끝에 약 0.5인치 길이의 구부러진 텅스텐 와이어 조각을 끼워 해부 바늘을 만듭니다.1밀리리터 주사기를 해부 바늘의 손잡이로 사용하고 수산화나트륨에서 바늘을 전류 아래에서 날카롭게 합니다. 3웰 유리 접시의 한 웰에 PEM 버퍼 9부, 10X PBS 1부, 32% PFA 1부로 구성된 갓 만든 용액을 반쯤 채웁니다. 3-5개의 배아를 접시에 넣고 날카로운 텅스텐 바늘로 구멍을 뚫어 구멍을 뚫고 약간 무딘 바늘로 구멍을 뚫어 안정시켜 노른자가 나오고 고정액이 흘러나오게 합니다.한 쌍의 날카로운 텅스텐 바늘을 사용하여 Parhyale 배아를 둘러싼 바깥쪽 두 개의 막을 부드럽게 떼어냅니다. 배아를 더 튼튼하게 만들기 위해 고정제로 해부하되 막이 배아에 고정되어 막 제거를 더 어렵게 만드는 것을 방지하기 위해 빠르게 작업합니다. 항체 염색의 경우 총 15-20분, 현장 교잡의 경우 40-50분 동안 배아가 고정되도록 합니다.때때로 편집 실험의 결과는 실험적 분석을 통해 가장 잘 평가됩니다. 야생형 T 세포와 CD25 녹아웃 세포의 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다. 유세포분석은 Cas9 RNP로 편집되지 않은 세포가 CD25를 발현한다는 것을 보여줍니다.그러나 CD25가 녹아웃된 세포는 단백질을 발현하지 않습니다. 대규모 섭동의 경우 편집 결과에는 명확한 시각적 표현형이 있을 수 있습니다. 예를 들어, 야생형 Parhyale hawaiensis는 수영과 닻 다리가 있는 정상적인 복부를 가지고 있습니다.Abd-B 유전자를 파괴하면 복부 수영 다리와 앵커 다리가 점프 다리와 걷기 다리로 대체되는데, 이는 일반적으로 흉부와만 관련이 있습니다. 표현형을 확인하는 것 외에도 실험자는 유전자형을 분석하여 전반적인 편집 효율성을 평가하고 특정 유전적 변화를 감지해야 합니다. 단일 클론의 경우, 이는 간단한 Sanger 염기서열분석을 통해 달성할 수 있습니다.세포가 혼합된 집단에서는 보다 고급 염기서열분석 분석이 권장됩니다. 예를 들어, TIDE는 RNP 편집 풀 내의 개별 세포에서 발생한 모든 다양한 indel을 매핑할 수 있습니다. 이 절차를 처음 시도할 때 표 1에 나열된 포지티브 컨트롤 중 하나를 사용해 보십시오.검증된 가이드 RNA를 사용하면 자신의 실험을 설계하기 전에 RNP로 편집하는 데 도움이 될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

체세포를 유 전적으로 조작하는 능력의 최근 진보는 기본 및 응용 연구에 큰 가능성을 안겨줍니다. 여기, 우리는 선택 마커의 사용 여부에 관계없이 포유류 세포주에서 CRISP / Cas9 생성 녹아웃 생산 및 스크리닝을위한 두 가지 접근법을 제시한다.

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

이 프로토콜 편집 시스템 복구에 대 한 포유류 세포에 있는 점 돌연변이의 CRISPR/Cas9 기반 유전자의 워크플로 설명 합니다. 여기, 우리 유전자 편집 대상 사이트에서 indel 형성을 측정 하기 위한 상세한 후속 실험 전략으로 조합 방식을 사용-본질적으로, 현장 mutagenesis 분석.

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

타겟된 유전자 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 편집 크게 유전자의 생물 학적 기능에 대 한 이해를 촉진 했다. 여기, 우리가 그들의 종양 활동을 공부 하기 위하여 모델 calreticulin 돌연변이 cytokine 종속 조 혈 모 세포에서에 CRISPR/Cas9 방법론을 활용 합니다.

CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 돌연변이 Calreticulin Cytokine 종속 조 혈 모 세포에서의 종양 활동을 조사 하기 위해 편집

여기, 우리는 CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins 및 homology 종속 복구 서식 파일을 사용 하 여 C. 선 충 의 게놈을 엔지니어링 하는 방법 제시.

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

CRISPR-Cas는 식물과 동물의 복잡 한 유전자를 강력한 기술. 여기, 우리는 효율적으로 다른 Cas endonucleases를 사용 하 여 인간 게놈을 편집 하려면 프로토콜 선발. 우리는 중요 한 고려 사항 및 설계 매개 변수 편집 효율 최적화를 강조 표시 합니다.

포유류 세포 라인 CRISPR Cas를 사용 하 여 게놈 편집

여기에 제시된 것은 튜브 전기포공을 이용한 포유류 세포에서 효율적인 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질 매개 유전자 편집을 위한 프로토콜이다.

CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질-튜브 전기포공에 의한 정밀 유전자 편집

미리 조립된 Cas9/가이드 RNA 리보뉴클레오단백질 복합체의 직접 전달은 조혈 세포에서 게놈 편집을 위한 빠르고 효율적인 수단입니다. 여기서, 우리는 RUNX1 인트로닉 소음기를 삭제하고 OCI-AML3 백혈병 세포에서 전사 반응을 검사하기 위해 이 접근법을 활용한다.

급성 골수성 백혈병 세포에서 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질에 의한 RUNX1 내성 소음기의 전사 적 역할 조사

여기에서는 piggyBac계 공여 플라스미드와 Cas9 nickase 돌연변이체를 이용한 인간 만능줄기세포에서 원활한 유전자 편집을 위한 상세한 방법을 설명한다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4α) 유전자좌의 엑손 8에 2 점 돌연변이가 도입되었다.

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

CRISPR-Cas9 게놈 편집 시스템은 모델 및 비모델 종에서 사용되어 온 사용하기 쉬운 게놈 편집기입니다. 여기서 우리는 비 모델 필라멘트 아스피세테 곰팡이의 짝짓기 유전자에 조기 정지 코동을 도입하는 데 사용 된이 시스템의 단백질 기반 버전을 제시합니다.

필라멘트 아콤유세테 헌티엘라 오만시스에서 CRISPR-Cas9 중재 게놈 편집

이 프로토콜의 목표는 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체와 스크리닝을 위한 dpy-10 공동 CRISPR 마커를 사용하여 C. elegans 게놈의 원활한 CRISPR/Cas9 편집을 가능하게 하는 것입니다. 이 프로토콜은 삽입, 삭제, 유전자 대체 및 코돈 대체를 포함하여 C. elegans에 있는 유전 수정의 각종을 만들기 위하여 이용될 수 있습니다.

CRISPR/Cas9 Dpy-10 공동 CRISPR 스크리닝 마커 및 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체를 사용하여 C. elegans rbm-3.2 유전자의 편집.

학습하세요 CRISPR/Cas9 RNP 복합체를 이용한 다양한 세포 및 유기체의 표적 유전체 편집 방법을. 이 기술은 효율성이 높고 off-target 효과가 적어 유전 질환 연구와 치료에 활용됩니다.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

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