지질 풍부 및 평가의 지질 분포 나 일 빨강, 기름 빨간 O 얼룩으로 꼬마 선 충 의 정량화
2018년 3월 5일
나 일 빨강 고정된 꼬마 선 충 의 얼룩 조직 중 지질 분포의 질적 평가 용이 하 게 기름 빨간 O 얼룩 동안 중립 지질 예금, 양적 측정 하기 위한 방법입니다.
이러한 염색 방법의 전반적인 목표는 세포 내 지질 풍부도를 정량화하고 서로 다른 조직 간의 지질 분포를 평가하는 것입니다. 이 방법은 지질이 유전적으로 및 생화학적으로 어떻게 조절되는지, 그리고 어떤 질병이 지질 항상성을 조절하는지와 같은 지질 대사의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수행하는 것이 비교적 간단하고 저렴하다는 것입니다.
나일 레드 지질 염색을 수행하기 위해 후기 로그 OP50 E.coli를 파종한 선충 성장 배지 또는 NGM에 플레이트를 만들고 섭씨 20도에서 초기 L4 단계까지 기생충을 성장시킵니다. 1mm의 PBST 용액으로 웜을 세척하고 웜 현탁액을 1.5ml 마이크로퓨지 튜브로 옮깁니다. 560배 중력에서 1분 동안 벌레를 원심분리합니다.
그런 다음 상층액을 제거하고 현탁액에서 대장균이 제거될 때까지 PBST 세척을 반복합니다. 다음으로, 웜 펠릿에 100마이크로리터의 40% 이소프로판올 또는 ORO 염색의 경우 60%를 추가하고 샘플을 실온에서 3분 동안 배양합니다. 이소프로판올의 첨가는 염색 전에 기생충의 적절한 투과화에 중요합니다.
560배 중력에서 1분 동안 벌레를 원심분리하고 벌레 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거합니다. 원심분리 단계에서 빛 노출을 최소화하는 것이 중요합니다. 이제 어둠 속에서 이전에 준비된 NR 작업 용액 600마이크로리터를 각 샘플에 추가합니다.
튜브를 세 번 뒤집고 벌레와 용액을 완전히 섞습니다. 그런 다음 실온의 어두운 곳에서 2시간 동안 샘플을 배양합니다. 배양 후 벌레를 원심 분리하고 상층액을 제거합니다.
그런 다음 600마이크로리터의 PBST를 추가하고 어두운 곳에서 30분 동안 샘플을 배양하여 과도한 NR 염색을 제거합니다. 이전과 같이 샘플을 다시 회전시킨 후 약 50마이크로리터의 상등액을 제외한 모든 것을 제거하고 나머지 용액에 웜 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 이미징을 위한 슬라이드를 준비하려면 5마이크로리터의 웜 현탁액을 현미경 슬라이드에 피펫팅하고 기포가 갇히지 않도록 커버슬립을 조심스럽게 적용합니다.
FITC GFP 채널을 사용하여 NR 염색된 지렁이를 이미지화하고 다양한 노출 시간을 시도하여 지렁이를 5배 배율로 이미지화하여 시야당 여러 동물을 캡처합니다. 그런 다음 개별 웜을 더 잘 정량화하기 위해 10배 배율로 전환합니다. 이미지를 정량화하려면 현미경 사진을 ImageJ에 업로드하십시오.
이미지 풀다운 메뉴에서 밝기, 이미지 데크의 대비를 조정하고 적용을 클릭하여 변경 사항을 모든 이미지에 전파합니다. 폴리곤 선택 도구를 사용하여 이미징된 각 웜을 묘사하고 분석 풀다운 메뉴에서 측정 기능을 사용하여 NR에서 방출되는 형광 강도를 검증합니다. 각 이미지에 대해 5개의 배경 위치를 측정하고 평균 배경 형광 강도를 계산합니다. 각 샘플에 600마이크로리터의 Oil Red O 또는 ORO 작업 용액을 추가하고 튜브를 세 번 뒤집어 웜과 ORO를 잘 혼합합니다.
샘플을 30RPM으로 회전하고 2시간 동안 실온합니다. 560배 중력에서 1분 동안 샘플을 원심분리하고 100마이크로리터를 제외한 모든 상층액을 흡인합니다. 그런 다음 600마이크로리터의 PBST를 사용하여 샘플을 재현탁하고 튜브를 30RPM으로 30분 동안 회전시켜 과도한 ORO 염색을 제거합니다.
장 세포에서 동물의 생식계 위치를 더 잘 구별하려면 ORO 작업 용액 1ml당 1마이크로리터의 DAPI를 추가하여 핵을 염색합니다. 그런 다음 이미징을 위한 슬라이드를 준비하려면 웜과 남아 있는 상층액을 재현탁하고 용액을 잘 혼합합니다. 현미경 슬라이드에 5마이크로리터의 웜 현탁액을 놓고 기포가 형성되지 않도록 커버슬립을 조심스럽게 적용합니다.
ORO 염색된 벌레를 이미지화하려면 5배 배율의 컬러 카메라를 사용하여 한 시야에 여러 벌레를 이미지화합니다. 그런 다음 개별 벌레를 더 잘 검사하기 위해 10배 배율로 전환하십시오. 마지막으로, 이미지를 ImageJ에 업로드하고 텍스트 프로토콜에 따라 이미지 데크를 만든 후 동물의 신체 전체 또는 특정 조직에 축적된 지질에 따라 이미지를 분류합니다.
SKN-1은 포유류 Nrf2와 상동성을 공유하며 지방산 산화를 매개하는 것으로 나타났습니다. 이 그림은 지질 수치를 증가시키는 조건에 노출된 활성화된 SKN-1 동물을 보여줍니다. 이 이미지에서 볼 수 있듯이 FITC GFP 채널을 사용하여 캡처한 NR 형광은 장을 따라 두드러지지만 머리, 꼬리 및 장 내강에서는 더 어둡습니다.
연령에 따른 체세포 지방 고갈 또는 ASDF의 유무에 따라 기생충을 분류하는 것은 쉽지만 중간 지방 감소가 있는 동물을 식별하는 것은 어려울 수 있습니다. 반투명 영역이 거의 없고 몸 전체에 밝은 붉은색으로 얼룩이 지는 비 ASDF 동물과 비교했을 때, ASDF 기생충은 장 세포에서 눈에 띄는 지방 고갈을 보입니다. ASDF가 발병하는 과정에 있는 동물은 종종 대부분의 지방 손실이 결국 발생하는 반투명 반점을 보입니다.
더욱이, ASDF 기생충은 여전히 머리와 꼬리 부위에 밝은 붉은색 염색을 특징으로 할 수 있는데, 이는 표현형이 완전한 체세포 지방 손실에 의해 정의되지 않고 노화되지 않은 동물에 비해 광범위한 지방 고갈에 의해 정의되기 때문입니다. 이 기술을 마스터하면 3시간 안에 완료할 수 있으며 제대로 수행되면 이미징 시간을 더할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 염색하기 30분 이내에 기생충을 씻고 투과화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라 CARS 현미경 검사와 같은 다른 방법을 수행하여 각 기술이 식별하는 지질 종의 유형을 비교하고 특정 유형의 질문에 더 적합한 방법을 결정할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 Nile Red 및 Oil Red O 염색을 사용한 후 ImageJ 현미경 사진 분석을 사용하여 지질을 정량화하고 지렁이의 지질 분포를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
고정된 Caenorhabditis elegans의 나일 레드 염색은 중성 지질 침착의 정량적 측정 방법이며, 오일 레드 O 염색은 조직 간 지질 분포의 정성적 평가를 용이하게 합니다. 이러한 기술은 지질 대사와 그 조절을 이해하는 데 필수적입니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생화학
- 지질 대사
배경
- 세포 내 지질 함량은 세포 기능에 중요합니다.
- 지질 분포는 조직마다 다릅니다.
- 지질 대사를 이해하면 질병 상태를 알 수 있습니다.
- 간단하고 비용 효율적인 염색 방법은 연구에 유익합니다.
연구 목적
- 세포 내 지질 함량을 정량화합니다.
- 조직 간 지질 분포를 평가합니다.
- 지질의 유전자 및 생화학적 조절을 탐구합니다.
사용된 방법
- E. coli가 접종된 선충 성장 배지(NGM)에 선충을 배양합니다.
- 20도 섭씨에서 초기 L4 단계까지 선충을 자랍니다.
- 선충을 PBST 용액으로 씻습니다.
- 중력의 560배로 1분 동안 선충을 원심분리합니다.
주요 결과
- 중성 지질 침착의 성공적인 정량화.
- 지질 분포의 효과적인 정성적 평가.
- 지질 대사 조절에 대한 통찰.
- 방법의 단순함과 비용 효율성을 입증했습니다.
결론
- 나일 레드 및 오일 레드 O 염색은 귀중한 기술입니다.
- 이러한 방법은 지질 대사에 대한 이해를 향상시킵니다.
- 지질 항상성에 대한 미래 연구의 기초를 제공합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Quantitative and qualitative lipid analysis in Caenorhabditis elegans using Nile Red and Oil Red O staining provides a scalable, cost-effective platform for interrogating lipid metabolism genes and pathways. These methods enable high-throughput screening and functional target validation relevant to metabolic disease research. Their reproducibility and accessibility support early-stage discovery and mechanistic de-risking in metabolic and energy homeostasis pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of genetic and biochemical regulators of lipid metabolism.
- Supports functional validation of conserved lipid genes implicated in human disease.
- Facilitates mechanistic de-risking by mapping lipid distribution across tissues.
- Provides a platform for rapid triage of metabolic pathway targets.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, reproducible staining protocols for quantitative lipid measurement.
- Supports high-throughput screening of gene or compound effects on lipid accumulation.
- Enables standardized image-based quantification using open-source tools like ImageJ.
- Prepares robust biological systems for downstream phenotypic screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for metabolic syndrome and related disorders.
- Provides continuity from genetic discovery to preclinical validation of lipid-modulating interventions.
- Enables comparative analysis with advanced label-free lipidomics for translational biomarker development.
- Supports risk-adjusted advancement of metabolic targets based on functional lipid phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
These staining and quantification methods integrate at the early discovery and screening stages, bridging genetic target identification with phenotypic validation and preclinical model development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on lipid regulation and pathway mapping in a genetically tractable system.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for compound or gene perturbation studies.
- Analytics: Enables standardized fluorescence and colorimetric measurements for cross-condition comparison.
- Translational Research: Facilitates alignment with human metabolic disease pathways through conserved gene analysis.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, scalable workflow for metabolic research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in lipid biology.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable protocols for lipid quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of metabolic targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of metabolic disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling and imaging techniques.
- Needs access to fluorescence and colorimetric microscopy and image analysis software.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and quantification protocols.
- Adaptation to other model systems may require protocol optimization.
- Limited in resolving lipid species diversity; complementary label-free methods may be needed for detailed lipidomics.
