Name: 지질 풍부 및 평가의 지질 분포 나 일 빨강, 기름 빨간 O 얼룩으로 꼬마 선 충 의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 학습하세요 Caenorhabditis elegans에서 Nile red 및 oil red O 염색을 이용한 지질 정량화 및 조직별 분포 평가 방법입니다. 이 기술은 지질 대사 조절 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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이 작품 NIH 교부 금에 의해 가능 하 게 되었다: R01GM109028 (S.P.C.)

1. 나 일 빨강 (NR) 지질의 얼룩
<ol><li>5 mg/mL NR 재고 솔루션의 준비<ol>
<li>500 mL 병에서 NR 분말의 100 mg 100% 아세톤의 200 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>빛을 모든 노출을 피하기 위해 알루미늄 호 일 병을 커버.</li>
		<li>사용 하기 전에 어둠 속에서 2 시간에 대 한 솔루션을 저 어.</li>
		<li>장기 사용에 대 한 어떤 빛 노출 없이 단단히 밀봉된 병에 NR 재고 솔루션을 저장 합니다. 연구의 필요에 따라 NR 재고 솔루션을 확장 합니다. 동일한 재고 솔루션은 일관 된 얼룩 및 이미징 결과 NR 얼룩 실험에서 사용 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR 작업 솔루션의 준비<ol>
<li>40% 소 프로 파 놀 (v/v)의 모든 1 ml NR 재고 솔루션의 6 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>각 샘플에 대 한 NR 작업 솔루션의 600 µ L를 준비 합니다. 참고: 신선한 NR 솔루션 오른쪽 얼룩이 지기 전에 작업을 확인 합니다. NR 재고 솔루션 요구에 따라 15 mL 또는 졸업 50 mL 원뿔 튜브를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR 지질 얼룩에 대 한 벌레의 준비<ol>
<li>선 충 류 성장 매체 (NGM) 시드 후반 로그 OP50 대장균과 20 ° C에서 초기 L4 단계에 벌레를 성장.</li>
		<li>인산 염 버퍼 식 염 수 + 0.01% 트라이 톤 X-100 (PBST) 솔루션 x 1의 1 mL와 함께 접시에서 벌레를 세척 하 고 웜 현 탁 액 1.5 mL microfuge 관에 넣어.</li>
		<li>560 x g 1 분에 벌레 제거 반복 대장균 까지이 단계를 삭제 하 고 상쾌한 현 탁 액에서 원심 분리기.</li>
		<li>웜 펠 릿을 40% 소 프로 파 놀의 100 µ L을 추가 하 고 3 분 동안 실내 온도에 그것을 품 어.</li>
		<li>560 x g 1 분 동안에 벌레를 원심 고 웜 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 합니다. 참고: 경우 판에서 벌레를 세척 하는 PBST의 높은 볼륨 사용 큰 접시를 사용 하 여 또는 접시 당 더 많은 벌레를 얼룩. PBST에서 보다 더 15 분 샘플 고정 전에 벌레를 씻지 않는. 수행 추가 세척은 상쾌한 박테리아의 지워지지 않습니다. Nutator 또는 로커를 사용 하 여 40% 소 프로 파 놀에 보육을 실시 합니다. 항상 전체 샘플 동요 발생 되도록 튜브 모니터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nr 얼룩 지질<ol>
<li>어둠 속에서, 각 샘플에 NR 작업 솔루션의 600 µ L를 추가 합니다. 반전 튜브 세 번 하 고 NR 솔루션에서 벌레를 완벽 하 게 혼합.</li>
		<li>2 시간에 대 한 실 온에서 어둠 속에서 샘플을 회전 합니다.</li>
		<li>외피, 다음 1 분 동안 560 x g 에서 벌레를 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>PBST의 600 µ L을 추가 하 고 30 분 초과 NR 얼룩 제거에 대 한 어둠 속에서 샘플을 품 어.</li>
		<li>560 x g 1 분에 샘플 원심 고 상쾌한의 약 50 µ L를 제외한 모든 제거 하십시오. 참고: NR 인큐베이션 동요를 필요 하지 않습니다. 벌레의 정착은이 단계 동안 일반적 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>현미경 이미징에 대 한 슬라이드의 준비<ol>
<li>나머지 상쾌한에 웜 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>현미경 슬라이드에 벌레 서 스 펜 션의 5 µ L을 놓고 신중 하 게 트래핑 어떤 공기 방울을 피하기 위해 하는 coverslip 넣어 합니다.</li>
		<li>벌레를 이미징 하기 전에 매니큐어와 coverslip 인감.</li>
		<li>한 번에 단지 몇 가지 슬라이드를 준비 합니다. 이렇게 하면 NR 이미징 일정 하 게 유지 샘플에서. NR 스테인드 이미지의 품질에는 6 헤 이산 지질 방울 관찰 하기 곤란 하다 며 배경 형광, NR 신호 검출을 방해는 감소 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR 얼룩진 벌레의 이미징<ol>
<li>보기의 필드 당 여러 동물을 잡으려고 5 배 확대에 벌레 이미지.</li>
		<li>개별 벌레의 더 나은 정량화에 대 한 10 배 확대로 전환.</li>
		<li>FITC/GFP 채널을 사용 하 여 이미지 NR 스테인드 웜 및 정량화에 대 한 최적의 조건을 결정 하기 위해 다른 노출 시간을 시도.</li>
		<li>압축으로 인해 데이터 손실을 방지 하려면 TIF 형식으로 파일을 저장 합니다. 참고: 일반적인 노출 시간 100-1000 양 최적의 노출 시간에 이르기까지, 모든 샘플에 대 한 그것을 사용 하 여 이미징 일관성을 유지 하.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR 얼룩 이미지 정량화<ol>
<li>ImageJ를 현미경을 업로드. 플러그인 풀 다운 메뉴에서 이미지 파일 인식 되지 않으면 바이오 형식 함수를 사용 합니다.</li>
		<li>스택 함수에서 이미지 풀 다운 메뉴에서 이미지 스택 사용 하 여 여러 현미경을 비교 하면 이미지 스택을 만듭니다.</li>
		<li>같은 풀 다운 메뉴에서 이미지 스택의 밝기/대비를 조정 하 고 적용을 클릭 하 여 모든 이미지에 변경 내용을 전파 합니다.</li>
		<li>각 이미지 웜 윤곽을 그리 다 하는 NR에서 방출 되는 형광 강도 계량 분석 풀 다운 메뉴에서 측정 함수를 사용 하 여 다각형 선택 도구를 사용 합니다.</li>
		<li>각 이미지에 대 한 5 개의 배경 위치를 측정 하 고 평균 배경 형광 강도 계산 합니다.</li>
		<li>수식 N을 사용 하 여 각 이미지 웜으로부터 배경 형광 강도 빼기 = G-(A x B), N 순 형광, 총 형광에 대 한 G, 총 웜 지역 A와 B 평균 배경 형광에 대 한 의미.</li>
		<li>웜 크기에 의해 형광 강도 정상화 하려면 각 벌레의 전체 면적에 의해 net 형광을 나눕니다. 결과 형광 강도, 픽셀 당 임의의 단위 (거리)으로 보고 됩니다. 참고: JPEG 형식으로 이미지를 수출 하지 마십시오. 압축 파일 저장을 더 관리 하면,이 형식에 의해 데이터 무결성 손상 됩니다. 모든 이미지 수정 및 동일 하 게 분석 다는 것을 확인 하십시오. 제대로 다른 배율에서 크기를 평가 하는 눈금 막대를 포함 하도록 하십시오. ImageJ를 사용 하 여 형광 강도 차이 더 나은 시각화 하려면 8 비트 RGB에서 이미지 형식을 전환 하 고 이미지 룩 업 테이블 (LUT) 메뉴에서 화재를 선택 합니다. 이 증가 색상 밝기 증가 형광 강도 상관 열 맵 이미지를 만듭니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 석유 지질 빨간 O 얼룩 (오로)
<ol><li>오로 재고 솔루션의 준비<ol>
<li>250 mL 병에서 100% 소 프로 파 놀의 100 mL를 오로 가루 500 밀리 그램을 추가 하 고 잘 혼합.</li>
		<li>일단 준비, 단단히 빛 노출 없이 밀봉 하는 솔루션을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>오로 작업 솔루션의 준비<ol>
<li>60% 소 프로 파 놀에 물 (3:2) 오로 재고 솔루션을 희석.</li>
		<li>사용 하기 전에 작업 오로 솔루션 0.2 µ m 셀 루 로스 아세테이트 멸 균 주사기 필터를 통해 필터링. 참고: 최상의 솔루션 품질을 위해 준비 작업 오로 솔루션 하루 전에, 그리고 섞어 하룻밤 보자. 그러나 솔루션은 필요한 같은 날, 희석과 혼합 사용 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 로커에 오로 솔루션. 락, 전에 오로 솔루션의 누설을 피하기 위해 파라핀 테이프에 원뿔 튜브 포장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>벌레의 오로 지질 얼룩을 위한 준비<ol>
<li>선 충 류 성장 매체 (NGM) 원하는 생활 단계에 늦게 로그 OP50 대장균 으로 시드에 20 ° C에서 벌레를 성장.</li>
		<li>접시에 PBST 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 모든 벌레는 접시에서 때까지 소용돌이. 접시를 기울기와 PBST의 1 mL와 함께 그것을 씻어. 1.5 mL microfuge 관 벌레 중지 전송.</li>
		<li>원심 분리기 560 x g 1 분에 벌레 제거는 상쾌한 펠 릿 및 세척 단계 PBST의 1 mL와 함께 세 번 반복을 방해 하지 않고. 모든 표면에 뜨는 하지만 100 µ L을 제거 합니다.</li>
		<li>웜 펠 릿을 40% 소 프로 파 놀의 600 µ L을 추가 하 고 3 분 동안 실내 온도에 바위.</li>
		<li>G 30 s 및 모든 표면에 뜨는 제거 하지만 100 µ L x 560에서 웜 웜 펠 렛을 방해 하지 않고 원심. 참고: PBST의 높은 볼륨을 사용 하 여 높은 처리량 얼룩 하 고 접시에서 벌레를 씻어. 웜 PBST에 보다 더 많은 샘플 고정 이전 15 분 세척 하지 마십시오. 추가 세척 할 상쾌한 박테리아의 지워지지 않습니다. 40% 소 프로 파 놀 nutator 또는 로커를 사용 하 여 부 화를 실시 합니다. 항상 전체 샘플 동요 발생 되도록 튜브 모니터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>오로와 얼룩 지질<ol>
<li>각 샘플에 600 µ L 오로 작업 솔루션을 추가 합니다. 반전 튜브 세 번 하 고 오로에서 벌레를 섞으십시오.</li>
		<li>실 온에서 2 h 30 rpm에서 샘플을 회전 합니다.</li>
		<li>1 분 동안 560 x g 에서 샘플 원심 고 모든 표면에 뜨는 하지만 100 µ L을 제거 합니다.</li>
		<li>PBST의 600 µ L에서 샘플을 resuspend 하 고 30 분 초과 오로 얼룩 제거 30 rpm에서 튜브를 회전.</li>
		<li>샘플 1 분 560 x g 에서 원심 하 고 상쾌한의 50 µ L를 제외한 모든 제거.</li>
		<li>더 나은 동물의 생식과 창 자 세포의 위치를 구별할,의 1 µ L을 추가 하 여 핵을 얼룩 (2-(4-amidinophenyl)-1 시간-indole-6-carboxamidine) (DAPI) 오로 작업 솔루션의 모든 1 ml. 이미징에 대 한 슬라이드를 장착 하기 전에 DAPI를 추가 2 h에 대 한 얼룩 오로 실시 합니다. 장 핵 크기에 더 큰 고 생식 개발 생식 세포에 의해 구별 된다. 참고: 후 오로 얼룩, 웜 수 있습니다 microfuge 관의 양쪽에 준수 고 눈에 띄는 펠 릿을 형성 하기 위하여 실패. 이 경우, 다시 벌레를 원심 하거나 적어도 10 분 동안 중력에 의해 침전 하는 벌레를 허용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>웜 이미징에 대 한 슬라이드의 준비<ol>
<li>나머지 상쾌한에 벌레를 resuspend 하 고 솔루션을 잘 섞는다.</li>
		<li>현미경 슬라이드에 벌레 서 스 펜 션의 5 µ L를 넣고 공기 폼 거품 확보는 coverslip 신중 하 게, 장소.</li>
		<li>매니큐어와 이미지 웜 coverslip 인감. 참고: 고정 하 고 얼룩, 후 웜 매우 견고 하 고 플라스틱 하기 어려운 수 있습니다. 회피, 그들의 끝을 절단 하 여 넓은 구멍 펫을 확인 합니다.</li>
		<li>안 착 직후 이미징 하는 경우 24 h까지 4 ° C에서 마이크로 원심 분리기 랙에 슬라이드를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>오로 얼룩진 벌레의 이미징<ol>
<li>색상 가능 카메라 이미지 오로 얼룩진 벌레를 사용 하 여.</li>
		<li>5 배 확대를 사용 하 여 이미지 보기의 한 필드에 여러 가지 벌레를.</li>
		<li>개별 벌레의 더 나은 시험 10 배 확대로 전환.</li>
		<li>압축으로 인해 데이터 손실을 방지 하려면 TIF 형식에서 이미지를 내보냅니다. 참고: 경우 오로 + DAPI 얼룩, 형광을 캡처할 수 있는 하나에 색상 가능 카메라를 전환.</li>
	</ol>
</li>
	<li>오로 얼룩진 벌레의 이미지 분석<ol>
<li>ImageJ를 micrograph(s)을 업로드. 플러그인 풀 다운 메뉴에서 이미지 파일 인식 되지 않으면 바이오 형식 함수를 사용 합니다.</li>
		<li>스택 함수에서 이미지 풀 다운 메뉴에서 이미지 스택 사용 하 여 여러 현미경을 비교 하면 이미지 스택을 만듭니다.</li>
		<li>지질 작은 물방울의 가시성을 개선 하기 위해 동일한 풀-다운 메뉴에서 밝기/대비를 조정 합니다.</li>
		<li>특정 조직 또는 동물의 체 내 지질 축적에 따라 이미지를 분류할 수 있습니다.</li>
		<li>지질 지역화의 더 나은 평가 및 일반적인 이미지 유물 ImageJ를 사용 하 여 식별 이미지 풀 다운 메뉴에서 색상 기능을 선택 하 고 표시 각 RGB 구성 요소의 신호를 RGB로 스택 클릭 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nile+red%3A+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).</li>
<li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets at a glance.</a> J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).</li>
<li>Horobin, R. W., Kiernan, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHorobin%2C+RW+%22Conn%27s+biological+stains%3A+a+handbook+of+dyes%2C+stains+and+fluorochromes+for+use+in+biology+and+medicine%22">Conn's biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine</a>. , BIOS Scientific Publishers. (2002).</li>
<li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+the+worm%3A+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angew Chem Int Edit. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li>
<li>Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+for+mafr-1+in+reproduction+and+lipid+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis.</a> Cell Rep. 9 (6), 2180-2191 (2014).</li>
<li>Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omega-3+and-6+fatty+acids+allocate+somatic+and+germline+lipids+to+ensure+fitness+during+nutrient+and+oxidative+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans.</a> P Natl Acad Sci USA. 112 (50), 15378-15383 (2015).</li>
<li>Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKN-1+and+Nrf2+couples+proline+catabolism+with+lipid+metabolism+during+nutrient+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li>
<li>Saltiel, A. R., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+signalling+and+the+regulation+of+glucose+and+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism.</a> Nature. 414 (6865), 799-806 (2001).</li>
<li>Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+lipidome%3A+A+primer+for+lipid+analysis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).</li>
<li>Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+fat+storage+quantitation+in+nematode+Caenorhabditis+elegans+using+label+and+label-free+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods.</a> PloS One. 5 (9), e12810(2010).</li>
<li>Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+and+functional+study+of+lipid+metabolic+genes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Genomics. 14 (1), 164(2013).</li>
<li>Folick, A., Min, W., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+lipid+dynamics+using+Coherent+Anti-stokes+Raman+Scattering+%28CARS%29+and+Stimulated+Raman+Scattering+%28SRS%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy.</a> Curr Opin Genet Dev. 21 (5), 585-590 (2011).</li>
<li>Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+high+throughput+microscopic+assessment+of+fat+mass+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li>
<li>O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+major+fats+are+stored+in+vesicles+distinct+from+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles.</a> Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).</li>
</ol>

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

비만 및 대사 질환에서 상승 선 충 C. 세포와 조직에 지방 축적 조절 메커니즘 연구에 적합 한 모델을 만든다. 최근의 증거는 지질 수준에 변화는 인슐린 신호8, 호르몬 수용 체2, 생식 출력5의 정품 인증에서에서 배열 하는 세포질 과정에 대 한 상관을 제안 합니다. 레이블 없는 현미경 검사 법 및 크로마토그래피 방법, 나 일 빨강 및 오일에 비해 붉은 O 되며 벌레에 중립 지질을 지속적으로 얼룩에 사용 하는 상대적으로 저렴 한 염료 reproducibly10,,1213. 두 번째는 hypodermis, 소장, 생식 선 등 조직 중 지질 분포의 평가 용이 하 게 하는 동안 첫 번째 총 지질 수준의 정량화에 대 한 수 있습...

지질은 생활 필수품입니다. 그들은 세포 막의 필수 구성 요소, 보조 메신저 역할 및 신호 변환기, 그리고 에너지 저장에 중요 한 기능을가지고. 지질 대사 dysregulated 때, 그것은 공중 보건 우려9누르고 비만 타입 II 당뇨병 같은 질병에 이른다. 꼬마 선 충 (C. 선 충)은 상대적으로 짧은 수명 주기, 투명 한 몸, 알려진된 세포 계보와 완전히 시퀀스 된 게놈을가지고 있기 때문에 지질 대사를 공부 하는 우수한 모델 유기 체. 주로 남녀 추 니, C. 선 충 연구자를 인상 isogenic 동물의 많은 짧은 수행할 높은 처리량 앞으로 유전 스크린 다양 한 대사 유전자 및 통로4공부 기간에 있습니다. 이 이렇게 인간, 쥐, 쥐 및 초파리 중 273 선 충 C. 지질 물질 대사 유전자에서 보존의 높은 학위를 공개 했다. 또한, C. 선 충 에서 300 지질 유전자 변화 증후군11에 비관련 질병에 연결 된 인간의 orthologues가 있다. 전통적으로, C. 선 충 에 지질 저장의 검사는 주로 지질 축적에 대 한 강력한 정보를 제공 하는 염료 분류 분석 실험에 의존 했다. 덜 일반적인 조직에 걸쳐 지질 지역화 및 지질 풍부에서 측정 된 차이의 설명 이다. 그러나, 최근 작품은 지질 분포 지질 축적6만큼 중요 있을 수 있습니다 밝혔다.
최근에, 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석 (HPLC-석사), 가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS), 같은 통합 연구 시작 하 고 일관 된 안티-스톡 스 라만 산란 (자동차) 현미경 주소로 얼룩-기반 접근 직접 지질 추출, 특정 지질 분수, 및 지질 예금, 각각10,11의 내용을 분석 하 여 단점 또한, 자동차 현미경 나 일 빨강 수 있습니다만 중요 한 얼룩 리드 오프 대상 자동 형광 세포10의 얼룩에 사용을 위해 통 염료로 사용 하는 경우 지방 축적에 대 한 프록시 역할을 계시 했다. 그러나, 필요한 기술적 전문성과 비용 이러한 크로마토그래피와 관련 된 그리고 현미경 검사 법 방법 활용 그들의 많은 연구 질문에 대 한 점. 이 문서에서 우리는 흥분 시키는 중립 지질 예금 C. 선 충 나 일 빨강을 사용 하 여 얼룩 하 고 기름 빨간 O 지질 풍부 전체 동물에서 및 특정 조직에 구별을 편리 하 고 안정적인 방법 토론.
나 일 빨강, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, benzophenoxazone 염료를 쉽게 다양 한 유기 용 매에 녹이 고 주로 물에 용 해 되지 않습니다 이다. 그것은 우수한 lysochrome 염료 사용 트리 글리세라이드 등 중립 지질 얼룩 또는 콜레스테롤 에스테 르는 강한 색상을 보유 하 고 있습니다. 때문에 지질에 잘 solubilizes, 무시할 상호 주위 조직, 않으며 덜에 보다 용 매에 용 해 지질입니다. 그것은 450-500 및 520 nm, 각각1의 여기 및 방출 맥시 마. 개별 지질 시체를 소장 및 다른 조직에 걸쳐 관찰 중 하나에 클러스터 또는 동물의 유전자 형 또는 실험적인 치료에 따라 균등 하 게 분산 수 있습니다 녹색 형광에 대 한 일 레드 스테인드 C. 선 충 을 볼 때 7.
기름 빨간 O lysochrome, 트리 글리세라이드 및 단백질 얼룩을 사용 하는 지 용 성 염료 이다. 그것은 그것의 화학 구조 포함 3 개의 향기로운 반지에 연결 된 두 개의 아조 그룹 때문에 아조 염료 이라고 합니다. 그것은 어느 지질에서 높게 녹는 렌더링 이온화, 어렵다입니다. 얼룩 색은 빨간색 이며 그것의 빛을 흡수 최대 518 nm 3. C. 선 충 기름 빨간 O 쇼 다른 조직6중 지질 분포의 질적 평가 용이 하 게 동물의 투명 한 바디에 눈에 띄는 빨간 지질 방울 스테인드.

<table><tbody><tr><td>Imager.M2m 현미경</td><td>Zeiss</td><td>형</td><td>광 현미경</td></tr><tr><td>ERC5s 카메라</td><td>Axiocam</td><td>해당 없음</td><td>컬러</td></tr><tr><td>MRm 카메라</td><td>Axiocam</td><td>해당 없음</td><td>형광 지원</td></tr><tr><td>나일 레드</td><td>Thermo Fisher</td><td>N1142</td><td>지질 염색</td></tr><tr><td>오일 레드 O</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12989</td><td>지질 염색</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td>DNA 염색</td></tr><tr><td>이소 프로필 알코올</td><td>BDH</td><td>BDH1133-1LP</td><td>고착 용액</td></tr><tr><td>0.2 &마이크로; m seterile 주사기 필터</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>셀룰로오스 아세테이트 필터</td></tr><tr><td>원심분리기 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5428000015</td><td>원심분리기</td></tr><tr><td>셰이커 로티세리</td><td>연구소 퀘이크</td><td>400110Q</td><td>셰이커</td></tr><tr><td>튜브 로테이터</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td>로테이터</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7758-11-4</td><td>NGM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>NGM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>7786-30-3</td><td>NGM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10035-04-8</td><td>NGM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>NGM</td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-88-5</td><td>NGM</td></tr><tr><td>펩톤</td><td>BD 생명과학</td><td>211677</td><td>NGM</td></tr><tr><td>한천</td><td>Teknova</td><td>L9110</td><td>NGM</td></tr><tr><td>LB 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3147</td><td>박테리아 성장</td></tr></tbody></table>

지질 풍부 및 평가의 지질 분포 나 일 빨강, 기름 빨간 o 얼룩으로 꼬마 선 충 의 정량화

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

꼬마 선 충 은 지질 대사 및 에너지 항상성 공부 하는 뛰어난 모델 유기 체입니다. 그것의 지질 유전자의 많은 인간에서 보존 하 고 대사 증후군 또는 다른 질병와 관련. 이 유기 체에서 지질 축적의 시험 통 염료 또는 레이블 자유로운 방법에 의해 밖으로 수행할 수 있습니다. 통 얼룩 나 일 빨강 좋아하고 기름 빨간 O 양적 지질 수준을 측정 하 고 질적 관찰 지질 분포, 조직에 걸쳐 각각 저렴 하 고 신뢰할 수 있는 방법이 있습니다. 또한, 이러한 얼룩 다양 한 지질 물질 대사 유전자 및 통로의 높은 처리량 검열을 허용 한다. 또한, 그들의 소수 성 자연 지질 용 해도 용이 하 게, 주변 조직와 상호 작용을 감소 및 용 매로 분리를 방지. 이 메서드는 일반적인 지질 콘텐츠 검사에 효과적, 비록 그들은 화학 성분 및 지질 예금의 다양성에 대 한 자세한 정보를 제공 하지 않습니다. 이러한 목적으로, GC-MS와 자동차 현미경 같은 레이블 없는 메서드는 더 나은 적합, 불구 하 고 그들의 비용.

SKN-1은 bZip, cytoprotective 전사 요소는 포유류 NRF2와 상 동을 공유 하 고 지방산 산화를 중재에 표시 되었습니다. 그들의 식단에 포도 당 농도 따라 웜 constitutively 활성화 skn 1 대립 유전자와 다른 지질 수준 나 일 빨강7물 때를 표시 합니다. 그림 1A -C 표시 활성화 skn-1 동물 지질 수준을 증가 하는 조건에 노출 됩니다. NR 형광 FITC/GFP 채널을 사용 하 여 캡처한 소장, 따라 유명 하지만 머리, 꼬리, 창 자 루멘에 주차. 지질 수준 증가, 개별 NR 스테인드 입자는 더 분별, 어렵다는 낮은 노출 시간을 할 거 수 있습니다. 이 방법은 양적 프록시 형광 강도 사용 하 여 지질 축적에 대 한, 비록 지방 매장 되지 않은 세포 구조의 난다 얼룩 구별에 ...

나 일 빨강 고정된 꼬마 선 충 의 얼룩 조직 중 지질 분포의 질적 평가 용이 하 게 기름 빨간 O 얼룩 동안 중립 지질 예금, 양적 측정 하기 위한 방법입니다.

지질 풍부 및 평가의 지질 분포 나 일 빨강, 기름 빨간 O 얼룩으로 꼬마 선 충 의 정량화

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

이러한 염색 방법의 전반적인 목표는 세포 내 지질 풍부도를 정량화하고 서로 다른 조직 간의 지질 분포를 평가하는 것입니다. 이 방법은 지질이 유전적으로 및 생화학적으로 어떻게 조절되는지, 그리고 어떤 질병이 지질 항상성을 조절하는지와 같은 지질 대사의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수행하는 것이 비교적 간단하고 저렴하다는 것입니다.나일 레드 지질 염색을 수행하기 위해 후기 로그 OP50 E.coli를 파종한 선충 성장 배지 또는 NGM에 플레이트를 만들고 섭씨 20도에서 초기 L4 단계까지 기생충을 성장시킵니다. 1mm의 PBST 용액으로 웜을 세척하고 웜 현탁액을 1.5ml 마이크로퓨지 튜브로 옮깁니다. 560배 중력에서 1분 동안 벌레를 원심분리합니다.그런 다음 상층액을 제거하고 현탁액에서 대장균이 제거될 때까지 PBST 세척을 반복합니다. 다음으로, 웜 펠릿에 100마이크로리터의 40% 이소프로판올 또는 ORO 염색의 경우 60%를 추가하고 샘플을 실온에서 3분 동안 배양합니다. 이소프로판올의 첨가는 염색 전에 기생충의 적절한 투과화에 중요합니다.560배 중력에서 1분 동안 벌레를 원심분리하고 벌레 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거합니다. 원심분리 단계에서 빛 노출을 최소화하는 것이 중요합니다. 이제 어둠 속에서 이전에 준비된 NR 작업 용액 600마이크로리터를 각 샘플에 추가합니다.튜브를 세 번 뒤집고 벌레와 용액을 완전히 섞습니다. 그런 다음 실온의 어두운 곳에서 2시간 동안 샘플을 배양합니다. 배양 후 벌레를 원심 분리하고 상층액을 제거합니다.그런 다음 600마이크로리터의 PBST를 추가하고 어두운 곳에서 30분 동안 샘플을 배양하여 과도한 NR 염색을 제거합니다. 이전과 같이 샘플을 다시 회전시킨 후 약 50마이크로리터의 상등액을 제외한 모든 것을 제거하고 나머지 용액에 웜 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 이미징을 위한 슬라이드를 준비하려면 5마이크로리터의 웜 현탁액을 현미경 슬라이드에 피펫팅하고 기포가 갇히지 않도록 커버슬립을 조심스럽게 적용합니다.FITC GFP 채널을 사용하여 NR 염색된 지렁이를 이미지화하고 다양한 노출 시간을 시도하여 지렁이를 5배 배율로 이미지화하여 시야당 여러 동물을 캡처합니다. 그런 다음 개별 웜을 더 잘 정량화하기 위해 10배 배율로 전환합니다. 이미지를 정량화하려면 현미경 사진을 ImageJ에 업로드하십시오.이미지 풀다운 메뉴에서 밝기, 이미지 데크의 대비를 조정하고 적용을 클릭하여 변경 사항을 모든 이미지에 전파합니다. 폴리곤 선택 도구를 사용하여 이미징된 각 웜을 묘사하고 분석 풀다운 메뉴에서 측정 기능을 사용하여 NR에서 방출되는 형광 강도를 검증합니다. 각 이미지에 대해 5개의 배경 위치를 측정하고 평균 배경 형광 강도를 계산합니다. 각 샘플에 600마이크로리터의 Oil Red O 또는 ORO 작업 용액을 추가하고 튜브를 세 번 뒤집어 웜과 ORO를 잘 혼합합니다.샘플을 30RPM으로 회전하고 2시간 동안 실온합니다. 560배 중력에서 1분 동안 샘플을 원심분리하고 100마이크로리터를 제외한 모든 상층액을 흡인합니다. 그런 다음 600마이크로리터의 PBST를 사용하여 샘플을 재현탁하고 튜브를 30RPM으로 30분 동안 회전시켜 과도한 ORO 염색을 제거합니다.장 세포에서 동물의 생식계 위치를 더 잘 구별하려면 ORO 작업 용액 1ml당 1마이크로리터의 DAPI를 추가하여 핵을 염색합니다. 그런 다음 이미징을 위한 슬라이드를 준비하려면 웜과 남아 있는 상층액을 재현탁하고 용액을 잘 혼합합니다. 현미경 슬라이드에 5마이크로리터의 웜 현탁액을 놓고 기포가 형성되지 않도록 커버슬립을 조심스럽게 적용합니다.ORO 염색된 벌레를 이미지화하려면 5배 배율의 컬러 카메라를 사용하여 한 시야에 여러 벌레를 이미지화합니다. 그런 다음 개별 벌레를 더 잘 검사하기 위해 10배 배율로 전환하십시오. 마지막으로, 이미지를 ImageJ에 업로드하고 텍스트 프로토콜에 따라 이미지 데크를 만든 후 동물의 신체 전체 또는 특정 조직에 축적된 지질에 따라 이미지를 분류합니다.SKN-1은 포유류 Nrf2와 상동성을 공유하며 지방산 산화를 매개하는 것으로 나타났습니다. 이 그림은 지질 수치를 증가시키는 조건에 노출된 활성화된 SKN-1 동물을 보여줍니다. 이 이미지에서 볼 수 있듯이 FITC GFP 채널을 사용하여 캡처한 NR 형광은 장을 따라 두드러지지만 머리, 꼬리 및 장 내강에서는 더 어둡습니다.연령에 따른 체세포 지방 고갈 또는 ASDF의 유무에 따라 기생충을 분류하는 것은 쉽지만 중간 지방 감소가 있는 동물을 식별하는 것은 어려울 수 있습니다. 반투명 영역이 거의 없고 몸 전체에 밝은 붉은색으로 얼룩이 지는 비 ASDF 동물과 비교했을 때, ASDF 기생충은 장 세포에서 눈에 띄는 지방 고갈을 보입니다. ASDF가 발병하는 과정에 있는 동물은 종종 대부분의 지방 손실이 결국 발생하는 반투명 반점을 보입니다.더욱이, ASDF 기생충은 여전히 머리와 꼬리 부위에 밝은 붉은색 염색을 특징으로 할 수 있는데, 이는 표현형이 완전한 체세포 지방 손실에 의해 정의되지 않고 노화되지 않은 동물에 비해 광범위한 지방 고갈에 의해 정의되기 때문입니다. 이 기술을 마스터하면 3시간 안에 완료할 수 있으며 제대로 수행되면 이미징 시간을 더할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 염색하기 30분 이내에 기생충을 씻고 투과화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 CARS 현미경 검사와 같은 다른 방법을 수행하여 각 기술이 식별하는 지질 종의 유형을 비교하고 특정 유형의 질문에 더 적합한 방법을 결정할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 Nile Red 및 Oil Red O 염색을 사용한 후 ImageJ 현미경 사진 분석을 사용하여 지질을 정량화하고 지렁이의 지질 분포를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 나일레드 염료를 사용하여 고정된 전체 벌레의 지질을 염색하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 지질 방울의 코어에 있는 중성 지질을 구체적으로 보려면 염색된 예쁜꼬마선충의 녹색 방출 스펙트럼을 이미지화합니다.

C. elegans의 나일 레드 염색: 고정 동물에서 지질 방울을 시각화하는 방법

이 동영상은 조류 세포의 중성 지질을 나일강 염료로 염색하여 검출하고 정량화하는 프로토콜을 보여줍니다.

Nile Red Staining: 조류에서 세포 내 중성 지질을 검출하고 정량화하는 기술

우리는 공부에 대한 강력한 생화학 및 미세 방법을...

에서 지방 질량의 생화학 및 높은 처리량 미세 평가<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

나일 레드 염색 절차를 사용하여 조류 세포의 중성 지질 함량을 결정하기위한 간단한 프로토콜을 설명한다. 이 시간을 절약 할 수있는 기술은 기존의 중량 측정 기반 지질 정량 프로토콜에 대한 대안을 제공합니다. 그것은 모니터링 생물 공정 성능의 특정 애플리케이션을 위해 설계되었다.

형광을 사용하여 조류 세포에서 중성 지질을 측정하기위한 간단하고 빠른 프로토콜

여기에 제시된 보디피 493/503, 지질 방울 특이적 형광 염료를 사용하여 드로소필라 유충에서 에노세포의 해종 및 지질 방울 염색에 대한 상세한 방법이 제시되어 있다.

초파리 유충에 있는 Oenocytes의 해부 그리고 지질 물방울 염색

자극라만 산란 (SRS) 현미경 검사법은 특정 화학 적 moieties의 선택적, 라벨없는 이미징을 허용하고 효과적으로 생체 내에서 지질 분자를 이미지하기 위해 사용되었습니다. 여기에서, 우리는 SRS 현미경 검사법의 원리에 대한 간략한 소개를 제공하고 Caenorhabditis elegans에있는 지질 저장에 그것의 사용을 위한 방법을 기술합니다.

자극라만 산란 현미경 검사를 사용하여 Caenorhabditis elegans의 지질 저장 역학의 라벨 프리 이미징

본 프로토콜은 Caenorhabditis elegans에 대한 액체 및 온플레이트 배양에서 지질 보충 방법을 설명하고 벌크 또는 소수의 웜 및 웜 조직으로부터의 종단 연구 및 유전자 전사 분석과 결합합니다.

Caenorhabditis elegans의 수명 및 유전자 전사 분석을위한 지질 보충

여기에서 우리는 간 조직의 지질 액적 특성 분석을 위해 최적화된 BODIPY 493/503 형광 기반 프로토콜을 입증합니다. 직교 투영 및 3D 재구성의 사용을 통해 형광단은 미세소포와 대소포성 지방증 사이의 성공적인 구별을 가능하게 하고 간 지방증 평가를 위한 고전적인 조직학적 프로토콜에 대한 보완적인 접근 방식을 나타낼 수 있습니다.

간 지방증 평가를 위한 3D 재구성을 통한 형광 염색 지질 방울 분석

눈의 망막 색소 상피층에 영향을 미치는 퇴행성 안구 질환은 단일 유전자 및 다유전자 기원을 가지고 있습니다. 여러 질병 모델과 소프트웨어 응용 프로그램인 LipidUNet이 질병의 메커니즘과 잠재적인 치료 개입을 연구하기 위해 개발되었습니다.

LipidUNet-iPSC 유래 망막 색소 상피를 이용한 지질 침전물의 특성화 및 정량화의 기계 학습 기반 방법

지방파지(Lipophagy)는 지질 방울의 분해를 포함하는 선택적 형태의 자가포식입니다. 이 과정의 기능 장애는 암 발병과 관련이 있습니다. 그러나 정확한 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 이 프로토콜은 자가포식, 지질 대사 및 암 진행 간의 상호 작용을 더 잘 이해하기 위한 정량적 이미징 접근 방식을 설명합니다.

Lipophagy를 통한 지질 방울 이화작용의 조절 탐구

여기에서는 ImageJ와 같은 이미지 분석 소프트웨어에서 후속 사용을 위해 광시야 현미경 이미지에서 개별 웜의 자동 분할을 위해 개발한 딥 러닝 시스템인 SegElegans를 효과적으로 활용하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 온라인과 오프라인 모두에서 시스템을 사용할 수 있는 방법을 제공합니다.

SegElegans를 사용한 C. elegans 형광 이미지의 자동 분석

학습하세요 Caenorhabditis elegans에서 Nile red 및 oil red O 염색을 이용한 지질 정량화 및 조직별 분포 평가 방법입니다. 이 기술은 지질 대사 조절 메커니즘 연구에 필수적입니다.

지질 풍부 및 평가의 지질 분포 나 일 빨강, 기름 빨간 O 얼룩으로 꼬마 선 충 의 정량화

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