초파리 애벌레 동작 Optogenetic 후 각 신경의 자극에 대 한 응답 추적

이 방법론의 전반적인 목표는 후각 뉴런의 광유전학적 자극에 대한 반응으로 초파리 유충의 탐색 행동을 분석하는 것입니다. 이 방법은 후각 회로 기능을 포괄적으로 해부할 수 있게 하고 후각 회로 기능이 행동 반응으로 어떻게 변환되는지에 대한 연구를 보완합니다. 이 기술의 주요 장점은 개별 후각 뉴런을 활성화하기 위해 전통적인 냄새 구배 대신 빛을 사용하여 특이성과 시간 제어입니다.

실험을 시작하려면 조명이 부족한 행동 경기장을 만드십시오. 89 x 61 x 66cm 크기의 상자를 3mm 두께의 검은색 플렉시글라스 아크릴 시트로 만듭니다. 행동실의 탁자 위에 상자를 놓습니다.

다음으로, IR Longpass 830 나노미터 필터와 8mm F1.4 C 마운트 렌즈가 장착된 흑백 USB 3.0 CCD 카메라를 블랙박스 천장 중앙에 장착합니다. 탁자에 두 개의 적외선 LED 스트립을 놓아 어두운 경기장의 유충을 비춥니다. 그런 다음 22cm x 22cm 정사각형 알루미늄 판을 가져와 LED 플랫폼을 구축합니다.

플레이트 중앙에서 금속 절단기를 사용하여 CCD 카메라 주위에 들어갈 만큼 충분히 큰 구멍을 자릅니다. 금속판을 빨간색 LED 스트립 조명으로 덮습니다. LED 조명 스트립 와이어를 직렬로 납땜하고 스트립 와이어를 Raspberry Pi 2B 마이크로프로세서에 의해 제어되는 광커플러 릴레이에 공급합니다.

그런 다음 CCD 카메라 주위에 LED 플랫폼을 장착합니다. 그런 다음 광 커플러 릴레이를 LED 스트립에 연결하기 전에 Raspberry Pi 프로세서에 Ubuntu MATE Raspbian Jessie Linux 기반 운영 체제를 설치하고 구성합니다. LED 스트립과 광커플러에 전원을 공급하기 위한 전원 공급 장치를 연결합니다.

행동 영역에서 CCD 카메라 주변의 다양한 지점에 균일한 방사 조도가 있는지 확인합니다. 분광계의 도움으로 경기장 표면의 절대 방사 조도를 확인하고 경기장 표면 전체에 걸쳐 미터당 약 1.3와트의 제곱으로 결정합니다. 표준 플라이 사료에 먹인 파리를 섭씨 25도, 상대 습도 50-60%에서 12시간, 12시간 명/암 주기로 유지합니다.

CsChrimson을 한 쌍의 ORN으로 표현하려면 UAS-IVS-CsChrimson 라인의 처녀 암컷을 ORX-GAL4 라인의 수컷으로 교차시킵니다. 교배된 수컷과 암컷 파리가 48시간 동안 짝짓기를 하고 알을 낳도록 한 후, 성충을 새 유리병으로 옮깁니다. 계란이 들어 있는 식품 바이알의 표면에 증류수에 용해된 89밀리몰 자당에 디메틸 설폭사이드 또는 DMSO에 용해된 400마이크로몰의 모든 트랜스 레망날(ATR)을 포함하는 혼합물 400마이크로리터를 추가합니다.

계란이 들어 있는 식품 바이알에 ATR을 넣으면 어둠 속에서 바이알을 추가로 72시간 동안 배양합니다. 배양 후, 고밀도 15% 자당 용액을 사용하여 파리 먹이 표면에서 세 번째 인스타 유충을 추출합니다. P1000 마이크로 피펫을 사용하여 자당 용액 표면에 떠 있는 유충을 1, 000밀리리터 유리 비커로 분리합니다.

유리 비커에 800ml의 신선한 증류수를 교환하여 유충을 네 번 씻습니다. 최종 세척 후 유충을 10분 동안 쉬게 한 후 행동 분석을 실시합니다. 거동 분석을 위해 행동실에서 일정한 온도와 습도를 유지하십시오.

22cm x 22cm 정사각형 페트리 접시에 녹은 1.5% 아가로스 150ml를 부어 유충 크롤링 배지를 준비합니다. 아가로스를 굳히고 페트리 접시에서 1-2시간 동안 식힌 후 행동 분석에 사용하십시오. 아가로스가 굳은 후, 준비된 세 번째 인스타 유충 중 20마리 이하를 페트리 접시의 중앙으로 옮기고 페트리 접시를 뚜껑으로 덮습니다.

CCD 카메라 아래의 행동 경기장에 페트리 접시를 놓습니다. 850나노미터 적외선 LED 광원을 켜서 비디오에서 유충을 시각화합니다. CCD 카메라를 시작하여 애벌레의 움직임을 기록합니다.

마지막으로 데이터 처리 및 분석으로 이동합니다. CsChrimson을 발현하는 ORN 7a가 빛에 의해 자극되었을 때, 대조 동물에 비해 실행 길이가 현저히 감소했습니다. 반대로, CsChrimson을 발현하는 ORN 42a가 빛에 의해 자극되었을 때, 대조 동물에 비해 실행 길이가 유의하게 증가하였다.

우리는 ORN 42a의 경우 광 자극의 다양한 시간적 패턴이 다른 행동 반응을 이끌어낸다는 것을 발견했습니다. 우리는 1차 후각 수용체 뉴런에 대해 이 방법을 입증했지만, 우리의 방법은 또한 투영 뉴런 및 국소 뉴런과 같은 다운스트림 뉴런이 애벌레 행동에 미치는 영향을 측정하는 것과 같은 다양한 미래 응용 분야를 허용합니다. 우리는 이 기술이 유충의 후각 회로 기능을 포괄적으로 해부할 수 있는 길을 열 것으로 기대합니다.