헬리컬 펩 티 드를 통해 사진 유도 Thiol-ene 또는 yne Hydrothiolation Thioether/비닐 황 화물-곁에 건설

이러한 방법은 우수한 작용기 내성과 우수한 수율을 갖는 티오-엔(thio-ene) 또는 티오-인(thio-yne) 클릭 화학을 사용하기 때문에 티오에테르 테더링된 고리형 펩타이드의 생성을 단순화합니다. 이 기술의 주요 장점은 티오에테르 테더가 펩타이드 합성 변형 후 안정적인 펩타이드의 화학적 공간을 크게 확장하는 무추적 변형 부위를 제공한다는 것입니다. 절차를 시작하려면 50mg의 Rink Amide MBHA 수지로 채워진 컬럼을 3방향 스톱콕을 통해 벤치탑 진공 매니폴드와 질소 또는 아르곤 가스 라인 모두에 부착합니다.

수지 베드에 1-2 밀리리터의 디클로로 메탄을 첨가하고 10 분 동안 불활성 가스 기포의 흐름으로 혼합물을 부드럽게 교반하여 수지를 팽창시킵니다. 완료되면 고무 피펫 전구로 수지를 배수합니다. 그런 다음 1-2ml의 N-말단 Fmoc 탈보호 용액을 수지에 추가합니다.

불활성 가스로 10 분 동안 거품을 일으켜 혼합물을 부드럽게 교반 한 다음 고무 피펫 전구로 수지를 배출합니다. 같은 방법으로 1-2ml의 DMF로 컬럼을 세척한 다음 1-2ml의 DCM으로 세척합니다. 보호 해제 시퀀스를 한 번 반복합니다.

다음으로, 0.125 밀리몰의 Fmoc-protected 아미노산과 50.5 밀리그램의 HCTU를 0.5 밀리리터의 DMF와 함께 폴리프로필렌 용기에 넣습니다. 혼합물을 1분 동안 흔들어 고형물을 녹입니다. 그런 다음 43.5마이크로리터의 DIPEA를 넣고 용기를 1분 더 흔들어 0.25몰 활성 아미노산 용액을 얻습니다.

이 용액을 세척된 수지에 첨가하고 혼합물을 통해 불활성 가스를 1-2시간 동안 거품을 일으킵니다. 그 후, 결합된 아미노산 잔여물을 탈보호하고 세척하십시오. 선형 펩타이드를 형성하기 위해 이러한 방식으로 아미노산을 펩타이드 사슬에 계속 결합합니다.

고체상 펩타이드 합성을 사용하여 mono-S-five 잔기에서 3개의 단위로 분리된 트리틸 보호 시스테인 잔기를 포함하는 선형 펩타이드를 지지하는 수지를 제조합니다. 1-2 밀리리터의 트리틸 탈보호용액을 50 밀리그램의 펩타이드 함유 수지에 첨가합니다. 혼합물을 통해 질소 가스를 10분 동안 거품을 냅니다.

탈액을 배출하고 DCM의 1-2밀리리터 부분으로 수지를 세 번 세척합니다. 시스테인을 완전히 보호하기 위해 용액이 더 이상 노란색으로 나타나지 않을 때까지 보호 해제 절차를 6회 반복하십시오. 시스테인의 Trt 그룹의 완전한 탈보호는 다음 광반응 단계에서 매우 중요합니다.

DMF와 DCM을 1-2 밀리리터 부분으로 차례로 수지를 세척합니다. 그런 다음 수지를 1-2밀리리터의 메탄올에 2분 동안 담가 수지를 수축시킵니다. 메탄올을 배출하고 수지를 질소 가스로 5 분 동안 건조시킵니다.

건조 수지를 계량 종이를 통해 10ml의 둥근 바닥 플라스크로 옮깁니다. 2ml의 질소 분출 DMF에 수지를 현탁시킵니다. 그런 다음 MMP 5.6mg과 MAP 38mg을 광개시제로 추가합니다.

플라스크에 교반 막대를 놓고 플라스크에 고무 격막을 씌웁니다. 질소 가스로 플라스크 대기를 세 번 퍼지하여 총 퍼지 시간은 약 5분입니다. UVA 램프, 불활성 질소 가스 주입구 및 교반 플레이트가 장착된 광반응기에 반응 플라스크를 고정합니다.

혼합물을 교반하기 시작하고 광반응기를 닫습니다. 아르곤으로 광반응기를 10분 동안 퍼지합니다. 그런 다음 아르곤 유량을 분당 1리터로 설정하고 실온에서 1시간 동안 UVA 광선을 혼합하여 조사합니다.

HPLC로 반응을 모니터링합니다. 세척하고, 쪼개고, 완성되면 고리 펩티드를 순화하십시오. 감마선 치환 mono-S-five 잔류물을 포함하는 선형 펩타이드를 함유한 수지 50mg을 준비합니다.

DMF와 DCM으로 수지를 차례로 세척합니다. 수지를 메탄올로 수축시키고 질소 가스로 건조시킵니다. 그런 다음 10ml의 둥근 바닥 플라스크에 수지를 2ml의 질소 분사 DMF에 현탁시킵니다.

혼합물에 MMP 5.6mg, MAP 3.8mg, Fmoc 보호 시스테인 25.7mg을 추가합니다. 플라스크에 교반 막대를 추가하고 고무 격막으로 밀봉한 다음 질소 가스로 플라스크 분위기를 퍼지합니다. 그런 다음 불활성 질소 가스로 채워진 광반응기에 혼합물을 UVA 광선으로 조사하면서 실온에서 1-2시간 동안 교반합니다.

LC-MS로 반응을 모니터링합니다. 광반응이 완료되면 결합된 펩타이드를 세척하고 매크로락타민화 반응을 수행합니다. 그 후, 아미노산을 고리형 펩타이드에 다시 연결하여 원하는 구조를 형성합니다.

완료되면 펩타이드를 절단하고 정제합니다. 말단 티올이 있는 잔류물로부터 3개의 단위로 분리된 말단 알킨이 있는 잔류물을 포함하는 선형 펩타이드를 함유한 수지 50mg을 준비합니다. 수지에서 펩타이드를 분리하고 1ml의 차가운 디에틸 에테르로 침전시킵니다.

펩티드 혼합물을 12, 2 분 동안 000 시간 g에 원심 분리하십시오. 상층액을 부드럽게 디캔팅하고 차가운 디에틸 에테르 1ml를 더 첨가합니다. 세척을 두 번 더 반복한 다음 진공 상태에서 펩타이드 잔류물을 건조시킵니다.

둥근 바닥 플라스크에 50ml의 질소 sparged DMF에 잔류물을 용해시킵니다. 펩타이드 용액에 DMPA 3.2mg을 첨가하고 반응 혼합물을 통해 질소를 10분 동안 거품을 냅니다. 불활성 분위기는 용액 단계에서 효과적인 티오-인 광반응을 위해 엄격하게 필요합니다.

그렇지 않으면, 우리는 UV 조사 중에 황의 산화를 관찰했습니다. 그런 다음 실온에서 30분에서 1시간 동안 불활성 질소 가스로 채워진 광반응기에서 교반하지 않고 혼합물에 UVA 광을 조사합니다. 완료되면 고리형 펩타이드를 분리하고 정제합니다.

이 펩티드의 수지 고리화는 선형 펩티드와 동일한 분자량을 가진 티오에테르 테더링된 하나, 5개의 고리형 펩티드를 생성했습니다. 고리형 산물의 HPLC 머무름 시간은 선형 펩타이드의 체류 시간보다 2분 짧았습니다. 여러 다른 짧은 펩타이드의 수지 고리화에 대해서도 양호한 전환이 관찰되었습니다.

선형 펩티드는 광유도 티올-이네 하이드로티올화를 통해 펩타이드 스테이플링을 수행할 수 있는 능력에 대해 스크리닝되었습니다. 2 c의 낮은 수율은 20 구성원 매크로 사이클로 수축하는 동안 N 말단에서 thiyl radical을 포획하기위한 구조적 선호에 기인합니다. 펩타이드 1 a와 1 b는 모두 8원 황화비닐 가교를 가진 2개의 이성질체를 생성했습니다.

제품 펩티드 2 개의 a-A 및 2 개의 ab는 뚜렷한 체류 시간을 가졌으며 서로 다른 조사 시간에 다른 비율로 생성되었습니다. 양성자 NMR 분광법은 2 개의 a-A가 황화 비닐의 E-이성질체이고 2 개의 ab가 Z-이성질체임을 나타냈다. Z-이성질체는 펩타이드 2 d, 2 e 및 2 f를 형성 할 때 주요 제품이었으며, 이는 7 원 황화 비닐 가교 결합을 형성하는 동안 구조적 선호에 기인합니다.

원형 이색성 분광법은 모든 형태의 펩타이드 2 a 및 2 b에 대한 무작위 코일과 펩타이드 2 d에 대한 나선형 구조를 보여주었습니다. 우리는 광유도 티오-엔 및 티오-인 클릭 화학을 사용하여 티오에테르 및 황화비닐 테더 펩타이드의 구성을 위한 일련의 화학 프로토콜을 개발했습니다. 우리는 이것이 연구 커뮤니티에 도움이 될 것이라고 믿습니다.