Name: 곤충 Spermatocytes에 염색체의 micromanipulation (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: 배우세요 곤충 정자세포에서 염색체 미세조작 기법을 활용한 생세포 내 염색체 재배치 방법입니다. 이 비살상 기술은 방추체 검문소에서 장력의 역할을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 그녀의 귀중 한 토론에 대 한 제시카 홀을 감사합니다.

1. Micromanipulation에 대 한 기본 곤충 Spermatocyte 세포 배양의 준비
<ol><li>슬라이드 준비<ol>
<li>슬라이드의 중심에서 밖으로 잘라 20 m m 직경 원형 구멍 75 m m x 25 m m 유리 슬라이드를 가져옵니다. 참고:이 창 유리 유리 슬라이드 중심에 구멍의 크기를 한 시트에서 절단 했다.</li>
		<li>2 분 젠 버너 불꽃을 통해 25 m m x 25 m m #1.5 coverslip 실행 s.</li>
		<li>유리 슬라이드에 구멍의 가장자리 주위에 진공 그리즈</li>
		<li>그림 1과 같이 구멍에 coverslip 장소. 그것은 누르고 단단한 물개를 형성 하는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>유리 슬라이드를 플립 하 고 halocarbon 기름으로 잘 해 부를 입력 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>현미경에 대 한 spermatocyte 문화 준비 참고: 여기, 우리가 메뚜기 또는 귀뚜라미 셀을 사용 하 여 문화 준비 방법을 설명 합니다. 다른 절지동물의 testes 내용은 비슷한 방법을 사용 하 여 양식 수 있습니다.<ol>
<li>Subadult 남성 귀뚜라미 (메뚜기)를 가져옵니다. 감기-anesthetize에 약 2 분 동안 냉장고에서 살아있는 곤충을 놓습니다. 해가 위를 사용 하 여 신속 하 게 잘라 등 쪽 표면을 통해 직접 날개 싹 뒤에 복 부의 긴 축에 평행. 수동으로 외장 (그림 2)에서 잘라내기 통해 testes를 부드럽게 복 부를 짠 다.</li>
		<li>집게를 사용 하 여 고립된 고환을 잘 halocarbon 유를 포함 해 부에 배치 합니다.</li>
		<li>필요한 경우, 해 현미경 testes 볼. 잘 지적 집게, testes, 다루는 모든 지방 제거를 사용 하 여 작은 조각으로 그들을 분할 하 고 벌금 지적 집게를 사용 하 여 (그림 3A 와 3B) testes 헤어. Coverslip (그림 3C)의 표면에 기름에서 testes 내용을 확산.</li>
		<li>고환의 확산 부분은 눈 (그림 3C)에 거의 눈에 띄는 때까지 고환 내용을 확산. 추가 오일 로드 분리 웰 스를 사용 하 여 필요한 경우.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. micromanipulation
<ol><li>미세 바늘의 생산<ol>
<li>분 젠 버너의 불꽃에 (0.85 m m 외경, 내경 0.65 m m) 유리 튜브의 한쪽 끝을 배치 합니다. 150 °의 각도 형성 하 고 좁은 유리 튜브의 확장된 영역 생성 방식에 유리 튜브의 끝을 당겨. 각도에서 연장 하는 얇은 지역은 약 10 m m 긴 (그림 4A) 얇은 지역에서 튜브를 휴식.</li>
		<li>microforge을 사용 하 여 (파월27 에 따라 주문 품 또는 상업적으로 사용 가능한 참조 테이블의 자료), 끝에 유리를 녹기 뜨거운 백 금 철사에 유리 바늘의 끝을 터치. 형태는 바늘과 microforge (그림 4B)의 백 금 철사 사이 약 45 ° 각도. 와이어, ≤1.5 유리 바늘의 끝에 m m의 얇은 끝을 형성 하는 열을 종료 하는 동안 뜨거운 철사에서 유리를 당겨. 참고: 팁 직경 측정 하기 어려운 것 이지만 끝이이 길이 micromanipulation에 대 한 적절 한 될 것입니다 확고 하지만 유연한 바늘을 생산할 가능성이. 또는, micropipette 끌어당기는 사람 (는 실험 작업에 대 한 적절 하 게 확고 하지만 유연한 미세 바늘을 생산 하는 다른 당기 조리법을 테스트 해야 합니다) 적절 한 팁 직경 유리 튜브를 만드는 데 사용 될 수 있습니다. 바늘 위에서 설명한 방법에 따라 만든 조작 바늘에 비슷한 모양의 홀더에 배치 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>위치는 micromanipulator<ol>
<li>거꾸로, 단계 대조 현미경의 스테이지 준비 슬라이드를 놓습니다. 분할 셀을 찾아서 보기의 필드에 센터. 가능한 가장 낮은 확대를 사용 하 여 셀에 초점. 참고: 우리는 16 X 단계 대조 목적 사용.</li>
		<li>장소에는 micromanipulator에 바늘 홀더 미세 바늘.</li>
		<li>바늘의 팁 (그림 5B) 빛에 의해 조명 되도록 수동으로 현미경의 빛 경로에 microneedle를 놓습니다.</li>
		<li>초점 현미경 셀 거짓말 평면 위에 여러 초점 비행기.</li>
		<li>사용 하 여 조이스틱 컨트롤러 낮은 감도에서 여러 번 여 X 축과 y 축의에 바늘의 그림자를 찾아 미세 바늘 위치를 변경할. 계속 팁의 위치 표시 될 때까지 위치를 조정 합니다. 바늘 팁은 초점에까지 z 축 따라 바늘의 위치를 조정 합니다.</li>
		<li>셀, refocus 다음 셀이 단지 초점 그리고 보이지 않는 되도록 셀 평면 위의 현미경 초점. 그것의 팁이 초점면에 초점에 바늘의 위치를 재조정.</li>
		<li>필요에 따라 현미경의 배율을 조정 합니다. 참고: 우리는 micromanipulation에 대 한 100 X 1.4 수 가늠 구멍 (NA) 단계 대조 목적을 사용.</li>
		<li>높은 배율 목표를 사용 하 여 셀에 초점을 맞추고, 후 다시 초점을 셀 평면 위의 현미경 세포는 단지 초점 그리고 보이지 않는 있도록. 팁 초점이 고 셀 거짓말 평면 위에 초점면에서 높은 감도 설정을 사용 하 여, 바늘의 위치 조정.</li>
		<li>그래서 그들은 보기의 필드의 중앙에 남아 그들의 위치를 조정 하는 셀에 촛점. 바늘은 이제는 micromanipulation에 대 한 준비.</li>
	</ol>
</li>
	<li>염색체의 micromanipulation<ol>
<li>높은 확대에 좋은 위치에 관해서는 동일한 감도 설정을 사용 하는 미세 바늘을 제어 하 고 셀 내부를 염색체를 밀어 조이스틱을 사용 합니다. 셀의 평면 위에 바늘 팁을 유지.</li>
		<li>당겨 또는 염색체 이동, 셀의 위쪽에 염색체에 초점. 참고: 이러한 염색체는 쉽게 조작 조작 염색체 가까이 coverslip 게 바늘 coverslip 셀 파열 및 실험 끝에 갈아 버릴 가능성이 있습니다.</li>
		<li>초점, 및 다음 이동 x에서 조이스틱 바늘 팁에 바늘 팁을가지고 조이스틱에 z 축 조정 및 Y. 조작 하 고 repositi 조작 수 있도록 원하는 방향으로 밀어 염색체에 직접 바늘의 팁을 배치 염색체.</li>
		<li>염색체 누르면 얼마나 멀리에 따라 염색체에 긴장을 적용 하거나 스핀 들에서 염색체 분리에 충분 한 긴장을 적용 합니다. 염색체는 스핀 들에서 제거 되 면 장소 어디서 나 셀 내에.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

연습으로, 세포에서 염색체를 이동 하는 것은 제 2의 천 될 수 있다. 충분히 뻣 뻣 한 그리고 충분히 얇은 밀고 바늘은 어려운 "의 요령" 조작, 하지만이 기능 또한 연습으로 온다. 그래서 괜 찮 그들은 변형 halocarbon 기름에 이동할 때 바늘 셀에 염색체를 추진 하는 데 유용 되지 않습니다. 그래서 바늘 그들의 팁을 볼 수 있습니다으로 염색체의 폭의 1/3로 (또는 더 큰)는 세포를 죽 일 가능성이 매우 무딘. 염색체를 충분히 괜 찮 아 요 하지만 셀 죽으로 너무 무딘 프로토콜의 중요 한 단계는 바늘의 창조.
성공에는 일반적으로 건강 한 유기 체는 spermatocyte 준비를 만들기 위해 사용 하 고 셀의 위쪽 표면 근처 염색체는 micromanipulation에 대 한 결과. 종종 셀의 coverslip 표면 근처 염색체를 조작 하는 시도 coverslip로 micromanipulation 바늘을 연 삭 및 실험 종료 따라서 puncturing 셀, 결과. 셀이 구...

Micromanipulation은 염색체 congression, 스핀 들 검사점 및 anaphase 염색체 운동에 대 한 메커니즘의 일부를 공개 했다. 가장 이른 간행물 micromanipulation 실험의 결과 설명 하는 로버트 챔버1했다. 챔버는 여러 종류의 다른 세포의 세포질을 연결 된 유리 바늘 기계 micromanipulator를 사용. 불행 하 게도, 염색체와 살아있는 세포에 많은 다른 세포 구성 성분의 시각화를 허용 하는 대비 방법을 사용할 수 없었습니다, 당시 챔버 실험 재배치 같은 세포 구성 성분의 효과 표시 하지 수 있으므로. 초기 micromanipulations 염색체 위치를 변경 하는 이러한 조작 anaphase 메뚜기 neuroblasts2에서에서 염색체 팔의 위치를 변경할 수 보여주는 anaphase 셀에 스핀 들 midzone 청소 챔버 장치 사용 . 니와 그의 공동 작업자 최초로 염색체의 미세 micromanipulations 수행 염색체3스트레칭, 스핀 들에서 그들을 분리 하 고 재교육3,4, 안정화를 유도 한 염색체5,,67, 긴장을 적용 anaphase8,9스핀 들에 의해 생산 하는 힘을 측정 하 여 malorientation. 니 클 랩 다른 작업 세포질과 립 또한 조작된10 수와 micromanipulation11centrosomes의 위치를 변경할 수는 나타났다. Micromanipulation은 염색체와 다른 세포질 구성 요소 이동 단지 유용 하지 않습니다. Micromanipulation 바늘 demembranated 셀12 mitotic 스핀 들을 통해 청결 하 게 자를 수 있다 또는 핵 봉투13해산 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 인접 한 셀 micromanipulation14,15융합 될 수 있다.
이러한 다양 한 할 수 있는 재미 있는 실험의 micromanipulation를 사용 하 여, 그것은 첫눈에 놀라운 micromanipulation 실험 거의 염색체 생물학에 의해 수행 되었습니다. 이 결핍에 대 한 이유 중 하나입니다 척추 조직에서 파생 되 고 염색체 움직임을 공부에 대 한 일반적으로 사용 되는 mitotically 분할 배양된 세포 micromanipulate 매우 어렵다. 이 조직 배양 세포는 일반적으로 바늘 "방해가 된다"는 micromanipulation의 그리고 염색체 중 하나는 바늘에 의해 도달할 수 없는 또는 바늘 세포 파열 및 죽음으로 이어지는 셀 grinds 대뇌 피 질의 골격을 있다. 우리, 그리고 micromanipulation를 사용 하 여 다른 경험 arthropod 셀 micromanipulation 의무가 있을을 발견 했다. Arthropod spermatocytes halocarbon 기름의 층에서 쉽게 확산 하 고 세포 분열 중 세포 막 내부는 훨씬 강력한 대뇌 피 질의 골격을가지고 있는 것 같습니다. 따라서, arthropod testes meiotically 분할 세포 (spermatocytes)의 좋은 소스를 제공 하 고 (spermatogonia) micromanipulation 위한 쉽게 접근할 수 있는 염색체를 가진 세포 mitotically 분할. 바늘 적 세포 막; 침투 계시는 조작 하는 동안 고정 메뚜기 spermatocyte의 직렬 구분 바늘 (니 클 R.B., 개인 커뮤니케이션) 주위 세포 막 변형. 곤충과 거미 taxa의 수에서 spermatocytes 되었습니다 micromanipulated 성공적으로, 메뚜기, 등 기도 mantids, 과일 파리, 크레인 파리, 귀뚜라미, spittlebugs, 나 방, 검은 부 거미, 지하실 거미, 천체 길 쌈 거미 3,7,17,18,19,20,,2122. 곤충에서 교양, mitotically 분할 셀 micromanipulated 될 수 있습니다. 예를 들어 기본 문화에 메뚜기 neuroblasts에서 염색체 염색체 micromanipulated2,23쉽게 될 수 있는 있다. 우리 용의자 사용 가능한 교양 라인 초파리 에서 파생 된 다른 곤충 또한 micromanipulatable, 있을 것입니다 비록 우리가 이러한 세포와 기법을 테스트 하지 않았습니다. 우리는 어떻게 메뚜기와 귀뚜라미에서 셀 분할 수 준비는 micromanipulation에 대 한 표시 됩니다. 귀뚜라미 들 언제 든 지 올해의 대부분의 애완 동물 상점에서 얻을 수 있습니다. 메뚜기는 연구원 실험실 식민지에 권한이 않으면 종 사용 (Melanoplus sanguinipes)는 쉽게 평평 하 게 셀, 그리고 긴, 쉬운 조작 염색체만 여름에 쉽게 얻을 수 있습니다.
또 다른 이유 왜 micromanipulation 실험 생물학의 작은 소수에 의해 수행 되었습니다 micromanipulators 염색체를 잘 이동 하는 시장에서 거의 사용할 수입니다. 우리는 진동, 드리프트, 또는 조이스틱 움직임와 바늘 움직임 사이의 지연 없이 바늘 움직임을 제어 하는 조이스틱 제어 압 전 micromanipulator 하지만 조작자의 다른 유형 또한 성공적으로 염색체를 밀 수 있다 발견 주변 셀에. 하지만 그들은 오래 된 기술을 사용 하 여 설계한 엘리스와 Begg25,26 micromanipulators 염색체의 micromanipulation에 이상적입니다. 압 전 micromanipulators 현재 사용할 수 있으며 일반적으로 전기 생리학;에 사용 그러나,이 micromanipulators 일반적으로 조이스틱을 제어 하지 않습니다. 조이스틱 제어는 성공적인 micromanipulation에 필요한 부드러운 움직임을 키 고 그래서 사용자 정의 조이스틱 염색체 micromanipulation 위해 일 하는 현재 사용할 수 있는 압 전 micromanipulators을 건설 한다. 최고의 작품은 조이스틱 제어 압 전 micromanipulators 직접 위치 제어를, 조이스틱의 움직임이 바늘 움직임에 직접 변환 하는 있다.
새롭게 설계 된 압 전 micromanipulator 쉽게 대체 될 수 있습니다 상용 부품 및 일부 작은 3 차원 인쇄 구성 요소를 생성할 수 있습니다 그리고 염색체 micromanipulation24를 위해 잘 작동 합니다. micromanipulator 조정 가능한 감도, 수동 거친 위치 및 진동, 드리프트, 또는 지연 바늘 운동, 그리고 바늘의 직접 위치 제어에 있다. 과학자 들은 micromanipulator 지침 사용할 수 온라인24를 사용 하 여 구성할 수 있습니다. 아래 기본 spermatocyte 세포 배양 준비 및 micromanipulating 메서드는 그 문화에 있는 세포 내에서 염색체.

<table><tbody><tr><td>VWR 마이크로 커버 유리</td><td>VWR</td><td>48366 249</td><td>25 mm x 25 mm, no 1.5</td></tr><tr><td>Dow Corning 고진공 그리스</td><td>VWR</td><td>AA44224-KT</td><td></td></tr><tr><td>KEL-F 오일 #10</td><td>Ohio Valley Specialty Chemical</td><td>10189</td><td></td></tr><tr><td>미세해부 가위, 스테인리스강</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3271-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 fine foreceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>0.85 mm 외경, 0.65 mm 내경 Pyrex 유리관&nbsp;</td><td>Drummond Scientific</td><td>맞춤 주문 - 10X</td><td></td></tr><tr><td>또는 16X 저배율 대물렌즈 및 60X 또는 100X 고배율 대물렌즈가 있는 도립형 위상차 현미경</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로포지</td><td>맞춤형 또는 Narashige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>마이크로매니퓰레이터</td><td>맞춤형 제작 또는 맞춤형 피에조 제어 조이스틱 PCS-6300이 있는 Burleigh PCS-6000</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

곤충 spermatocytes에 염색체의 micromanipulation

Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes

염색체의 micromanipulation는 염색체 congression, 스핀 들 검사점 및 anaphase 염색체 운동에 대 한 메커니즘을 조명 하는 필수적인 방법 고 있다 염색체의 움직임을 제어 하는 무슨을 이해 하는 열쇠 셀 부 중. 숙련 된 생물학자는 micromanipulator 염색체는 세포 내에서 위치를 변경 하 고 아주 좋은 팁는 작은 유리 바늘을 사용 하 여 염색체를 힘을 적용 하는 스핀 들에서 염색체를 분리 사용할 수 있습니다. 섭 염색체 광학 트래핑 같은 다른 방법과 레이저의 다른 사용을 사용 하 여 만들 수 있습니다, 하는 동안 날짜, 아니 다른 메서드를 사용 하면 셀에 아무 손상도 거의 미크론의 수백에 10의 규모에 세포 구성 성분의 위치 .
선택과 적절 한 세포의 염색체, 메뚜기 및 귀뚜라미 spermatocyte 기본 문화권의 준비 라이브 셀 이미징 및 micromanipulation, 사용에 대 한 설명의 micromanipulation에 대 한 준비는 여기 설명합니다. 또한, 우리는 나누어 세포 내에서 염색체 위치를 그것에 붙어 있던 유리 바늘으로 세포, 그리고 조이스틱 제어 압 전 micromanipulator 사용 내 염색체 이동에 사용할 바늘의 건설을 보여줍니다. 샘플 결과 micromanipulator 기본 spermatocyte에 스핀 들에서 염색체를 분리 하 고 세포 내에서 해당 염색체 위치를 사용을 보여준다.

그림 6 micromanipulation의 가능한 사용의 몇 가지 예 2 인접 한 메뚜기 기본 spermatocytes의 샘플 micromanipulation를 보여 줍니다. 이 실험 수행 되었다 거꾸로, 단계 대조 현미경을 사용 하 여. 0:00 (시간 표시 있는 min:s) 이미지 조작 전에 두 셀을 보여 줍니다. 맨 아래 셀에 하나의 염색체 micromanipulation 바늘에 의해 적용 긴장 아래 표시 (0:05; 검은 화살표) 다음 스핀 들에서 완전히 분리 하 고 (0:10; 검은 화살표). 아래쪽 셀 (6시 25분; 노란색 화살표)에서 하나의 염색체 1 스핀 들 (7시 05분; 노란색 화살표) 해당 셀의 극을 향해 밀어 이며 (7시 10분; 노란색 영역) 주요 스핀 들 영역 외부 이동. 모두 조작된 염색체 (노란색과 검은색 화살표)이이 실험에서 새로운 스핀 들 첨부 파일의 형성을 방지 micromanipu...

이 프로토콜에서 선택과 그 세포 내에서 염색체 위치를 micromanipulation에 대 한 적절 한 셀의 준비와 압 전 micromanipulator의 사용을 설명 합니다.

곤충 Spermatocytes에 염색체의 micromanipulation

The micromanipulation of chromosomes has been an essential method for illuminating the mechanism for chromosome congression, the spindle checkpoint, and ...

이 방법은 스핀들 체크포인트를 만족시키는 데 긴장이 얼마나 중요한지, 미오증의 염색체 동작에서 스핀들 부착의 역할은 무엇입니까와 같은 세포 생물학의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 실험자가 살아있는 세포에서 장력을 적용하거나 염색체를 재배치할 수 있는 비치명적인 기술이라는 것입니다. 시작하려면 75~25mm 슬라이드를 중앙에서 20mm 직경의 원형 구멍으로 준비합니다.그런 다음 25 mm 25 mm 번호 1.5 커버 슬릿을 번젠 버너 불꽃을 통해 2 초 동안 실행합니다. 유리 슬라이드의 구멍 가장자리 주위에 진공 그리스를 적용합니다. 그런 다음 덮개를 구멍 위에 놓고 눌러 단단한 씰을 형성합니다.슬라이드를 뒤집어 할로카본 오일로 새로 생성된 해부를 잘 채웁니다. 일부 성인 남성 크리켓을 얻은 후, 바로 날개 싹 뒤에 복부의 긴 축에 평행 등쪽 표면을 통해 절단 해부 가위를 사용합니다. 그런 다음 복부를 부드럽게 짜서 외골격의 컷을 통해 고환을 밀어 냅니다.집게를 사용하여 격리된 고환을 해부에 잘 배치합니다. 해부 현미경에서 미세 한 포인팅 포셉을 사용하여 고환을 작은 조각으로 나누고 지방을 제거하십시오. 그런 다음, 커버 슬릿의 표면에 오일 아래에 고환의 내용을 확산.확산 부분이 육안으로 거의 보이지 않게 될 때까지 고환의 내용을 계속 퍼뜨라. 필요한 경우 추가 오일 하중 해부 우물을 사용할 수 있습니다. 첫째, 분젠 버너의 불꽃에 유리 튜브의 끝을 배치합니다.튜브의 끝을 잡고 150도 각도와 좁은 유리 튜브의 확장 영역을 만듭니다. 얇은 영역에서 튜브를 끊어 이전에 생성된 각도에서 연장되는 얇은 영역은 약 10밀리미터 길이입니다. 마이크로포지를 사용하여 유리 바늘의 끝을 녹여 마이크로포지의 바늘과 백금 와이어 사이에 45도 각도를 형성합니다.그런 다음 열을 끄면서 유리를 와이어에서 멀리 당깁니다. 이전에 준비된 슬라이드를 반전된 위상 대비 현미경의 단계에 놓습니다. 그런 다음, 분할 세포를 찾아 가능한 가장 낮은 배율을 사용하여 시야에서 그들을 중도한다.마이크로니들(microneedle)을 마이크로 조작기의 바늘 홀더에 넣습니다. 그런 다음 현미경의 광 경로에 마이크로 니들(microneedle)을 수동으로 배치합니다. 현미경을 포함 하는 평면 위에 여러 초점 평면을 집중.다음으로 조이스틱 컨트롤러를 사용하여 마이크로니들을 여러 번 재배치하여 x 및 y 축에서 바늘의

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Research

연구

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