Name: 변조 및 줄기 세포를 제공 하는 전기 전도성 비 계 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: 배우세요 전도성 고분자 지지체에 줄기 세포를 배양하고 전기 자극을 가한 후 최소 침습 기법으로 생체 내 이식하는 방법을. 이 기술은 뇌졸중 회복 연구와 세포 치료에 활용됩니다.

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QRT-PCR 기계의 사용에 감사 박사 Kati Andreasson (부의 신경과 및 신경 과학, 스탠포드 대학) 하 고. 일은 스탠포드 학부의 학장의 박사 친목 (사운드) 국립 연구소의 건강 보조금 K08NS098876 (P.M.G.)을 지원 했다.

모든 줄기 세포 및 동물 절차 및 실험실 동물 관리 (SCRO 616 및 APLAC 31909)에 스탠포드 대학의 행정 패널에 의해 스탠포드의 줄기 세포 연구 감독 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. 이토 유리 에칭
<ol><li>인듐 주석 산화물 (ITO) 준비-유리의 전도성 저쪽 마스킹 에이전트를 배치 하 여 커버 유리 슬라이드. 참고: 대부분의 상용 투명 테이프는 마스킹 요원으로 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>블레이드를 사용 하 여 초과 마스크를 제거, 최종 이토 디자인만 원하는 모양 떠나는 유리에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>질소 산의 5% (v/v) 및 에칭 솔루션을 준비 하는 증기 두건 안쪽 유리 비 커에 HCl의 45% (v/v) 결합 한다.<ol>
<li>핫 플레이트와 온도계를 사용 하 여 솔루션을 에칭의 온도 70 ° c.에 유지 되도록</li>
	</ol>
</li>
	<li>에칭 솔루션에는 70 ° C에 도달 하면, 2 분 초과 이토 레이어를 제거를 위한 솔루션으로 마스크-이토 유리 슬라이드를 놓습니다. 참고: 테이프 마스킹 산 성 솔루션에 노출에서 이토 레이어를 보호합니다.</li>
	<li>솔루션에서 슬라이드를 제거 하 고 이온된 (DI) H2o.로 그것을 씻어합니다</li>
	<li>조심 스럽게 제거 나머지 이토 그대로 되도록 멀티 미터를 사용 하 여 마스크와 측정 저항. 원하는 에칭된 면의 해독 약 0 Ω 이어야 한다.</li>
</ol>2입니다. Pyrrole 솔루션의 준비
<ol><li>1000 mL 유리병에 디 H2o.의 600 mL에 70 g 나트륨 dodecylbenzenesulfonate (NaDBS)의 해산</li>
	<li>일단는 NaDBS 해산 솔루션에 0.2 M pyrrole의와 디 H2O의 386 mL 14 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>커버 알루미늄 호 일로 솔루션 및 4 ° c.에 저장</li>
</ol>3. 전기 Polypyrrole 이토 유리에의
<ol><li>따뜻한 실내 온도에 pyrrole 솔루션 NaDBS redissolved 완전히 때까지. 참고:이 약 15 ~ 20 분 정도 걸립니다.</li>
	<li>Pyrrole 솔루션의 25 mL 비 커에 붓으십시오.</li>
	<li>멀티 미터를 에칭된 이토 유리를 연결 하 고 슬라이드 pyrrole 솔루션에 잠수함.<ol>
<li>0 Ω 저항 측면 플래티넘 메쉬 참조 전극으로 직면 하 고 있는지 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PPy의 멀티 미터 (전류 3 mA/cm2 에서 4 시간에 대 한)를 사용 하 여 ITO 표면에 전기 도금을 시작 하는 전류를 적용 합니다.</li>
	<li>멀티 미터 및 세척 전기-PPy 디 H2O 잔여 계면 활성 제를 제거 하에서 ITO 유리를 제거 합니다.</li>
	<li>부드럽게 면도날을 사용 하 여 이토 유리에서 전기 PPy 플레이트를 분리 합니다.<ol>
<li>실 온에서 PPy 접시를 저장.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다.입니다 (PDMS)의 준비
<ol><li>주걱과 무게 접시 사용 하, 경화제의 2 세대와 기본 에이전트의 18 g을 혼합 하 고 두 10 cm x 8 cm 유리 금형에 혼합물을 부 어.</li>
	<li>15-20 분 동안 진공 챔버를 사용 하 여 금형에서 거품을 제거 합니다.</li>
	<li>3 h 70 ° C 오븐에 금형을 놓습니다.</li>
	<li>일단 냉각, 금형에서는 PDMS를 제거 하려면 평평한 주걱을 사용 합니다.</li>
</ol>5. 시험관에 전기 자극 챔버의 제조
<ol><li>압력솥 (WxL, 2.5 c m x 12.5 c m) 금속 접시와 흐름 1 시간 동안 120 ° C에서 밸브.</li>
	<li>템플릿으로 챔버 슬라이드를 사용 하 여, PDMS의 두 조각을 잘라. 참고: PDMS의 한 조각 셀 챔버 내에서 두 개의 인접 한 사각형의 배 기판 가진 셀 챔버의 경계 역할을 합니다. 다른 PDMS 조각 챔버의 경계에 대 한 개요입니다.<ol>
<li>잘라 안쪽에 밖으로 셀을 정사각형 모양 실과 셀 챔버의 모양을 일치. PDMS의 두 조각의 전반적인 모양은 직사각형 이며 챔버 슬라이드의 일치를 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>맨 아래에서 다음과 같은 자료를 레이어: (1) 금속 격판덮개, (2) (단편), 없이 PDMS (3) PPy 플레이트 (PDMS에 수직), (단편)와 (4) PDMS 및 (5) 셀 챔버.</li>
	<li>일단 완벽 하 게 정렬 기구를 함께 클램프.</li>
	<li>금속 와이어의 두 60 cm 조각 잘라내어 실버 붙여넣기를 사용 하 여 챔버의 외부에서 돌출 PPy 플레이트의 각 끝에 1 개의 철사를 연결. 전선은 충분히 인큐베이터의 외부에 장치에서 확장을 확인 합니다.</li>
	<li>일단은 풀 치료 강화와 에폭시와 와이어 연결 인감.<ol>
<li>적용된 분야는 각 챔버에 동일 다는 것을 확인 하는 멀티 미터를 사용 하 여 저항을 기록 합니다.</li>
		<li>이식, 제거 와이어; unclamp 셀 챔버 및 PDMS 그리고 그들 전도성 발판에서 별도. 이식 장비의 차원은 약 1 m m x 3 m m x 0.25 m m입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 인간의 신경 조상 세포 (hNPCs) PPy에 도금
<ol><li>2 시간 동안 UV 빛에서 조립된 챔버를 소독.<ol>
<li>1 시간 후 조립 회전 90 °를 실.</li>
	</ol>
</li>
	<li>살 균 후 코트 코팅 기판의 800 µ L와 아래쪽 챔버의 PPy의 표면 하 고 1 시간에 5% CO2 에서 37 ° C에서 인큐베이터의 PPy 접시에 공고히 기판 허용.</li>
	<li>1 시간 후 챔버에서 상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 잘 당 DPBS Ca + Mg의 1 mL로 씻어. 참고:로이 코팅 기판의 분리로 인해 강제로 PPy의 표면 세척 하지 마십시오.</li>
	<li>신선한 셀 미디어를 사용 하 여 기계적으로 부드러운 pipetting으로 조직 배양 접시에서 챔버와 함께 사용 하기 위해 배양된 세포 분열. 참고: 셀 분리 시 90-100% 합칠 이어야 한다.</li>
	<li>HNPC 펠 릿 8000 x g에서 5 분간 원심 분리를 사용 하 여 수집.</li>
	<li>hemocytometer를 사용 하 고 100, 000 셀/c m2의 볼륨에서 셀 resuspend.</li>
	<li>각 챔버 잘 (100000 셀/cm2 미디어의 1 ml에서)으로 100000 세포를 플레이트.</li>
	<li>5%에서 37 ° C에서 인큐베이터 챔버 돌아가기 CO2.
</li>
</ol>7. 전기 자극의 hNPCs
<ol><li>챔버에 세포를 뿌리기 후에 1 일 파형 발생기를 사용 하 여 셀에 전기 자극을 적용.</li>
	<li>자극, 전에 잘 각 약 실에서 오래 된 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어의 800 µ L를 보충 합니다.</li>
	<li>미디어를 변경한 후 약 실 인큐베이터에 다시, 인큐베이터에서 철사 연장 놓고 파형 발생기에 첨부</li>
	<li>1 시간에 100 Hz와 ±400 mV에서 구형 파 신호를 세포에 자극을 적용 합니다.</li>
	<li>자극 후 철사를 제거 하 고 또 하루 5% CO2와 37 ° C에서 설정 하는 인큐베이터에서 챔버를 품 어.</li>
	<li>세포 생존 능력 및 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 다음 제조 업체의 프로토콜을 포함 하 여 이후 생물 학적 분석을 수행 합니다.</li>
</ol>8. PPy 이식 Vivo에서
<ol><li>T 세포 결핍에 원심 중간 대뇌 동맥 (dMCA) 폐색 선 모델 수행 성인 남성 누드 쥐 (NIH RNU 230 ± 30 g)로2위에서 설명한. 이식 1 주일 게시물 dMCA 폐색을 수행 합니다.</li>
	<li>수술 전에 1 일 그들의 감 금 소 물에 쥐에 암 피 실린 (1 mg/mL)을 제공 합니다.</li>
	<li>Anesthetize 사용 하 여 유도 챔버 쥐 isoflurane 흡입을 통해 관리의 0.5-3 %mg / kg.</li>
	<li>발가락 핀치 반사 응답의 부족에 의해 쥐의 anesthetization를 확인 합니다.<ol>
<li>동물 마 취 동안 막, 호흡 패턴, 색상과 직장 온도 15 분 마다 모니터링을 계속 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>일단 anesthetization 확인, 건조를 방지 하기 위해 쥐의 눈에 인공 눈물을 적용 합니다.</li>
	<li>무 균 기술 멸 균 장갑, 그리고 메 마른 외과 용 드 레이프13를 사용 하 여이 절차 동안 유지 됩니다 확인 하십시오. 살 균 분야 내 메 마른 외과 기구를 유지.</li>
	<li>마 취는 쥐를 실행 하는 동안 왼쪽된 피 위에 craniectomy 드릴. 경질을 엽니다.<ol>
<li>수술 마이크로-얇은 바늘을 사용 하 여 뇌에서 dura mater를 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>쥐 피에 체 외에 시스템에서 전도성 건설 기계를 이식. 참고: 우리의 실험에 대 한 우리 생체 외에서 3 일 hNPC 도금 후에서 건설 기계에 이식합니다.<ol>
<li>중간 선 병 변 주로 반영 피 질에 플을 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>발판은 배치 후, 이식 피부 폐쇄 움직임을 방지 하기 위해 surgicel을 놓습니다.</li>
	<li>봉합 사 상처 고 쥐 buprenorphine SR stereotaxic 수술 및 dMCA 폐색과 관련 된 통증을 관리 하기 위해 1 mg/kg의 복용량에 피하 주입</li>
	<li>의식 회복 쥐 복구에 놓습니다.<ol>
<li>결코 방치 동물 그것은 의식 하는 동안.</li>
		<li>그것은 완전히 의식을 얻을 때까지 다른 동물을 배치 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>매일 몸 무게 감소, 감소 음식/물 섭취, 감소 손질/빗질 외 투, 자발적인 활동 감소/증가, 비정상적인 자세, 탈수/피부 tenting, 오목 눈, 숨기기, 자기 절제, 등 통증의 흔적에 대 한 동물을 모니터링 빠른 호흡, 오픈 짖 어 대 호흡, 경련, 떨림, 떨림과 발성 합니다.<ol>
<li>그들이 먹고, 마시고, 손질, 고 무게;를 얻고 나타날 때까지 동물을 매일 모니터링 그리고 체중 증가 후 다음 주간입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CO2 흡입 및 euthanization (으로 동물 정상적인 산소 공급 게시물 CO2 흡입으로 인해 부활 하지 것 이다)의 보조 확인을 통해 초기 euthanization 술 안 먹고 나타나는 어떤 동물에 발생 하 고 초기 수술; 후 무게를 얻고 고통을;에 나타납니다. 때문에 모터 피 질 적자를 예상 보다 더 큰 행동 테스트를 완료할 수 없습니다 나타납니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는이 작품을 선언 하 전혀 충돌의 관심이 없다.

증거를 성장 소설 뇌졸중 치료로 줄기 세포의 약속을 입증 했다. 이 약속은 적어도 40 진행 중이거나 완료 된 임상 시험을 머리 맡에 줄기 세포 치료제를 사전 중요 한 노력에 결과 있다. 선 병 급성 모욕 후 과정이 없다 신경 복구를 방지 하기 때문에 줄기 세포 치료 라는 독특한 신경 장애를 제공 합니다. 줄기 세포 강화 된 뇌졸중 복구의 정확한 기계 장치는 불분명 남아 있습니다. 신생, synaptogenesis, 및 시 냅 스 리 모델링 모두 중요 한 것을 보여줘 왔다. BDNF 등 THBS-1 시 냅 스 형성에 대 한 중요 한 분자는 제거 하는 경우 뇌졸중 복구 장애인된6,19입니다. hNPCs 수많은 동물 모델20,21에서 뇌졸중 후 기능적 복구를 개선 했습니다. 메커니즘은 hNPCs의 효과가 남아 완전히 이해 하...

스트로크는 세계에서 사망의 두 번째 주요 원인이 이며 미국에서 죽음의 다섯 번째 주요 원인. 이러한 높은 사망률에도 불구 하 고 뇌졸중 복구에 대 한 치료는 현재 가능한 의료 옵션 현재 사용할 수 있는1와 도전 남아 있습니다. 현재 다루고 있는 유일한 40 줄기 세포를 활용 하는 허 혈 성 뇌졸중의 임상 시험 300 개에 대 한 있다. 이전 연구 결과 줄기 세포 치료 선 수리2,3에 유익한 영향을 미칠 것으로 나타났습니다. 두뇌 파생 된 neurotrophic 요인 (BDNF) 등 thrombospondin-1 (THBS-1) 이식된 인간의 신경 조상 세포 (hNPCs)에서 발표 Paracrine 요인의 증가와 관련 된 메커니즘을 통해 향상 된 기능 복구를 나타났습니다. 시 냅 스 형성, angiogenesis, 수지상 분기 및 새로운 axonal 계획 뿐 아니라 면역 시스템4,,56변조. 그러나, 줄기 세포의 최적의 전송 방법 애매 남아 있습니다.
뇌에 성공적인 줄기 세포 배달 도전 남아 있습니다. 현재, 주사 가능한 히드로 및 고분자 스 캐 폴딩 시스템 줄기 세포 제공 도입 되었습니다. 이러한 전달 방법 이식 시 줄기 세포를 보호 뿐만 아니라 호스트의 염증 반응과 hypoxic 조건7,,89 를 포함 하 여 가혹한 포스트 치기 환경에서 보호를 제공 , 그러나 10., 가장 일반적으로 사용 되는 재료는 불활성,11셀 연속 변조 (즉, 전기 자극)의 사용을 제한 하. 전기 자극 차별화, 이온 채널 밀도, 그리고 줄기 세포12neurite 결과 영향을 미치는 큐입니다. 불활성 고분자에 비해 전도성 고분자는 전기 자극 및 줄기 세포2의 조작에 대 한 현재 수 있도록 수행할 수 있습니다. 그러나,는 전기 자극 neurotrophic 요인 릴리스 (즉, BDNF와 THBS-1)를 변조 하는 정확한 메커니즘은 아직 완전히 탐험.
이 프로토콜에서 우리는 전도성 고분자 비 계, polypyrrole (PPy), 체 외에 전기 자극에 대 한 수 있도록 구성 된 셀 문화 시스템을 구성 하는 단계를 설명 합니다. 셀 문화 체계를 조작 하는 방식으로 인해 줄기 세포 시드 비 계 요정 경색 피 질에의 후속 주입이 가능 하다. 이 시스템에 대 한 우리 전기 전제 발판에 줄기 세포 이식 전에 짧은 시간 동안. 전기 자극에 따라 셀을 들고 전도성 고분자 발판 성공적으로 intracranially 최소 침 습 방법을 사용 하 여 이식 합니다.

<table><tbody><tr><td>FGF-Basic</td><td>Invitrogen</td><td>CTP0261</td><td>작업 매체용 20ng/mL</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>cb40234a</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>LIF 단백질, Recom. Hum. (10 &micro; g/mL)</td><td>EMD Millipore</td><td>LIF1010</td><td>10ng/mL 작업 매체용</td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 3.9kg</td><td>Fisherbrand</td><td>NC0162601</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Fisherbrand</td><td>SA56-4</td><td></td></tr><tr><td>질산 농축액(인증) ACS, Fisher Chemical</td><td>Fisherbrand</td><td>SA95</td><td></td></tr><tr><td>ITO Glass</td><td>Delta Technologies</td><td>CG-40IN-0115</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데실벤젠설포네이</td>트 <td>Sigma</td><td>289957-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Pyrrole</td><td>Sigma</td><td>131709-500ML</td><td>빛과 실온으로부터 pyrrole 용액을 보호하십시오</td></tr><tr><td>8 웰 유리 슬라이드 챔버</td><td>Thermo Sci Nuc&nbsp;</td><td>125658</td><td>세포실을 분리하고 멸균된 상태로 보관하십시오</td></tr><tr><td>. 평면 브래킷, 3"x1"</td><td>McMaster-Carr&nbsp;</td><td>1030A4</td><td></td></tr><tr><td>TWO PART SILVER PAINT 14G</td><td>전자 현미경 과학&nbsp;</td><td>1264214</td> 플라스틱 플레이트 DPBS, 1x<td>에 두 부분(1:1)을 Ca</td></tr><tr><td>와 Mg, 페놀 레드</td><td>제네시스 없음&nbsp;</td><td>25-508C</td><td></td></tr><tr><td>AB2 ArunA 신경 세포 배양 미디어 키트</td><td>Aruna Biomedical&nbsp;</td><td>ABNS7013.2</td><td></td></tr><tr><td>hNP1 인간 신경 전구체 확장 키트</td><td>Aruna Biomedical&nbsp;</td><td>&nbsp; hNP7013.1</td><td></td></tr><tr><td>비접촉 플로우 조절 밸브, 니켈 도금 황동, 3/32"에서 5/8" 튜브 OD</td><td>McMaster-Carr&nbsp;</td><td>5330K22</td><td></td></tr><tr><td>멀티미터</td><td>Keysight&nbsp;</td><td>E3641A</td><td></td></tr><tr><td>웨이브폼 발생기</td><td>Keysight</td><td>33210A-10MHz</td><td></td></tr><tr><td>Pt 메시</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>298107-425MG</td><td>참조 전극, 치수, 1x1 cm</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 생존력/세포 독성 키트, 포유류 세포용</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hs02718934_s1 바트1</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hs00962908_m1 GAPDH</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td></td><td></td>Hs02758991_g1</tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder (250)</td><td>Qiagen</td><td>79656</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set (50)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 &micro; L rxns</td><td>BIORAD</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>4369510</tr><tr><td>7-8 주 령, 수컷, RNU 쥐</td><td>NCI-Frederick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 Ethicon 실크 봉합</td>사 <td>eSutures.com</td><td>683G</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>V-1 탁상용 실험실 동물 마취 시스템</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Surgicel Original Absorbable Hemostat</td><td>Ethicon</td><td>1952</td><td></td></tr><tr><td>실험실 표준 입체 기기, 쥐</td><td>도둑질</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional&nbsp; Safeskin 보라색 니트릴 멸균 검사 장갑</td><td>Fisherbrand</td><td>19-063-130</td><td></td></tr><tr><td>멸균 드레이프</td><td>메드라인</td><td>DYNJSD1092</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Shandon 스테인리스 스틸 메스 블레이드 핸들, 20-25번 블레이드 보유</td><td>Fisherbrand</td><td>53-34</td><td></td></tr><tr><td>Walter Stern 메스 블레이드 시리즈 300</td><td>Fisherbrand</td><td>17-654-456</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex 실시간 PCR 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484642</td><td></td></tr><tr><td>Frazier Micro Dissecting</td><td>Hook Harvard Apparatus</td><td>52-2706</td><td></td></tr></tbody></table>

변조 및 줄기 세포를 제공 하는 전기 전도성 비 계

Electrically Conductive Scaffold to Modulate and Deliver Stem Cells

줄기 세포 치료 치료, 흥미 진 진한 선으로 등장은 하지만 최적의 전달 방법 불분명 남아. 뇌졸중 모델에서 줄기 세포를 전달 하기 위해 수십 년 동안 microinjection의 기술을 사용 하는 동안이 기술은 주입 전에 줄기 세포를 조작 하는 능력의 부족에 의해 제한 됩니다. 이 문서는 전기 전도성 폴리머 비를 사용 하 여 줄기 세포 배달에 대 한 하는 방법을 자세히 설명 합니다. 전도성 고분자 비 계를 사용 하 여 줄기 세포의 전기 자극 세포 생존, 염증 반응, 및 시 냅 스 리 모델링에 관련 된 줄기 세포의 유전자를 변경 합니다. 전기 거치기 후 발판에 줄기 세포는 원심 중간 대뇌 동맥 폐색 쥐 모델에서 intracranially 이식 수 있습니다. 이 프로토콜 전도성 고분자 비 계를 통해 줄기 세포를 조작 하는 강력한 기법을 설명 하 고 추가 줄기 세포 기반 치료를 개발 하는 새로운 도구를 만듭니다.

그림 1 에 표시 된 회로도 hNPCs 및 잠재적인 다운스트림 응용 프로그램의 전기 자극의 전체 워크플로 나타냅니다. 줄기 세포 치료에서 현재 한계 줄기 세포 염증, 허 혈 성 조건 등 거친 후 이식 환경에 노출 되는 것 이다.입니다. 이러한 어려운 조건을 가능성이 그들의 치료 효능14,15제한합니다. 이 환경에서 hNPCs를 보호 하기 위해 전도성 비 계를 사용 하 여 전기 늘어진 통해 hNPCs 치료 혜택을 증가 수 있습니다. 이 줄기 세포 전달 기술에서는 첫 번째 단계는 전기 접근2,16를 사용 하 여 전도성 비 계의 개발 이다. 우리 건설 기계 생체 적합성을 특징 하 고 hNPCs와 전기 늘어진 특성에 ...

이 프로토콜 설명 줄기 세포 생체 외에서 전기 자극 및 줄기 세포 시드 비 계를 사용 하 여 후속 vivo에서 이식에 대 한 비 전도성 고분자 계에서의 시드 수 있도록 셀 문화 시스템의 제조를 최소 침 습 기법입니다.

Stem cell therapy has emerged as an exciting stroke therapeutic, but the optimal delivery method remains unclear. While the technique of microinjection ...

이 절차의 전반적인 목표는 전도성 고분자 골격에서 줄기세포의 체외 전기 자극을 위한 플랫폼을 만들고 후속 생체 내 이식을 수행하는 것입니다. 이 방법은 줄기세포를 조절할 수 있는 수단을 제공함으로써 뇌졸중 연구 및 줄기세포 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 가장 큰 장점은 줄기세포를 in vitro에 최적화하고 이후에 이식할 수 있다는 것입니다.이 방법은 뇌졸중 회복에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 새로운 세포 전달 방법으로 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 사용자는 세포 챔버 조립에 필요한 정밀도와 두개골 절제술과 관련된 기술로 인해 어려움을 겪을 것입니다. 준비 과정에서 2.5 x 12.5cm 금속판과 흐름 밸브를 오토클레이브합니다.다음으로, 챔버 슬라이드를 템플릿으로 사용하여 PDMS 두 조각을 자릅니다. 한 조각은 챔버 주변의 윤곽을 그리는 역할을 합니다. 두 번째 조각에서 챔버 슬라이드 내부에서 인접한 두 조각을 잘라냅니다.두 조각 모두 직사각형이어야 하며 챔버 슬라이드와 일치해야 합니다. 이제 재료를 겹쳐 놓습니다. 금속판부터 시작하여 절단되지 않은 PDMS, 수직 방향의 폴리피롤 플레이트, 컷아웃이 있는 PDMS, 마지막으로 셀 챔버로 시작합니다.레이어를 조심스럽게 정렬하고 장치를 함께 고정합니다. 다음으로, 두 개의 금속 와이어를 절단하여 장치에서 인큐베이터 외부까지 연장합니다. 60cm 길이는 일반적으로 충분히 깁니다.다음으로, 은색 페이스트를 사용하여 챔버 외부에서 튀어나온 폴리피롤 플레이트의 각 끝에 와이어를 부착합니다. 은 페이스트가 경화되면 에폭시를 사용하여 연결을 강화하고 밀봉합니다. 이제 멀티미터를 사용하여 어셈블리 전체의 저항을 기록합니다.적용된 필드는 각 챔버에서 동일해야 합니다. 다음으로, 세포를 어셈블리에 플레이트하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 전기적으로 자극합니다. 세포를 이식하기 전에 어셈블리에서 와이어를 제거하십시오.그런 다음 셀 챔버의 클램프를 풀고 전도성 골격에서 PDMS를 분리합니다. 이제 골격을 이식할 준비가 되었습니다. 수술 하루 전, 대상 동물에게 암피실린을 식수에 넣어 먹인다.수술 당일, 이소플루란으로 쥐를 마취하고 발가락 꼬집기로 마취를 확인합니다. 이제 쥐의 눈에 인공 눈물을 발라 촉촉하게 유지한다. 두개골을 면도한 후 동물을 덮고 멸균 수술을 준비합니다.보호복을 착용하고 멸균된 도구의 포장을 풀고 두피를 소독하십시오. 두개골 절제술의 경우 왼쪽 피질 위에 경막까지 구멍을 뚫습니다. 개구부를 임플란트 크기인 1 x 3mm보다 약간 크게 만듭니다.그런 다음 경막을 열고 초박형 수술 바늘을 사용하여 뇌에서 경막을 제거합니다. TC-culture 인큐베이터에서 리그를 제거하고 리그를 비활성화합니다. 다음으로, 시험관 내 시스템의 전도성 골격을 쥐 피질에 조심스럽게 이식합니다.그런 다음 Surgicel로 임플란트를 덮어 고정하거나 피부가 닫히는 동안 임플란트가 움직일 수 있습니다. 이제 4-0 실크 봉합사를 사용하여 상처를 봉합합니다. 봉합이 완료된 후 쥐에게 부프레노르핀 SR을 피하주사합니다. 그런 다음 쥐가 의식을 되찾을 때까지 회복 케이지에 넣습니다.수술 후 절차는 텍스트 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다. 인간 신경 전구 세포를 전기 자극에 노출시킨 다음 세포 생존율 분석으로 염색했습니다. 녹색은 살아있는 세포를 나타냅니다.세포는 분명히 전기 자극에서 살아남을 수 있었습니다. 뇌졸중 회복에 중요한 신경전구세포에서 방출된 인자는 정량적 RTPCR을 사용하여 총 RNA 1마이크로그램에서 평가되었습니다. 델타 델타 사이클 임계값 방법을 사용하여 결과를 정규화한 후 전기 자극에 대한 노출이 BDNF 및 THBS1 발현을 상향 조절했음을 밝힙니다.이 절차를 시청한 후에는 전기 전도성 줄기세포를 위한 세포 배양 시스템을 만드는 방법과 이러한 줄기세포를 쥐 모델에 이식하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일단 마스터하면 제대로 수행되면 45분 안에 절차를 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 적절한 마취를 보장하기 위해 적절한 호흡 패턴과 막 색깔을 위해 항상 동물을 모니터링하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.쥐와 줄기 세포를 다루는 것은 위험할 수 있으므로 항상 적절한 PPE를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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뼈 재생을위한 인적 Perivascular 줄기 세포의 이용

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복잡한 조직의 고도로 조직화된 구조를 만들려면 여러 재료 및 세포 유형을 통합된 복합체로 조립해야 합니다.  이 조합 설계는 강력한 섬유질 기질 염기를 포함하는 두 가지 별개의 생물학적으로 파생된 물질과 새로운 혈관 형성을 향상시키기 위한 내피 세포와 장기 특이적 층상 세포 시트를 통합합니다.

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이 기사에서는 알려진 시딩 밀도와 비교하여 초기에 부착되는 세포의 수를 최대화하고 정량화하기 위해 표준 배양 웰 플레이트의 베이스를 덮지 않는 재료(이 경우 전기 방적사)에 인간 중간엽 줄기세포를 파종하기 위한 다양한 설정에 대해 설명합니다.

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여기 선물이 심장 생리학을 모방 하는 전기 및 기계적 자극을 사용 하 여 셀 인구를 교육 하기 위한 프로토콜. 이 전기 자극 치료 세포의 cardiomyogenic 잠재력을 강화 하 고 더 세포 치료, 질병 모델링 및 의약품 심사를 위한 유망한 전략 이다.

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여기 우리는 다양 한 유형의 전기 자극 및 osteogenic 차별화를 향상 시키기 위해 중간 엽 줄기 세포를 치료에 사용 하는 셀을 표시 하도록 셀 문화 챔버의 건설에 대 한 프로토콜을 제시.

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슈완 세포 표현형 사양을 평가하기 위한 튜블드 세포 외 세포 매트릭스 미세 환경의 준비

이 백서는 전기장(EF)에 노출된 섬유성 전도성 물질의 유한 원소 모델을 구축하기 위한 전략을 제시한다. 모델은 이러한 재료에서 시드된 세포가 스캐폴드의 구성 재료 특성, 구조 또는 방향을 변경하는 영향을 수신하고 평가하는 전기 입력을 추정하는 데 사용할 수 있습니다.

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배우세요 전도성 고분자 지지체에 줄기 세포를 배양하고 전기 자극을 가한 후 최소 침습 기법으로 생체 내 이식하는 방법을. 이 기술은 뇌졸중 회복 연구와 세포 치료에 활용됩니다.

변조 및 줄기 세포를 제공 하는 전기 전도성 비 계

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