변조 및 줄기 세포를 제공 하는 전기 전도성 비 계

이 절차의 전반적인 목표는 전도성 고분자 골격에서 줄기세포의 체외 전기 자극을 위한 플랫폼을 만들고 후속 생체 내 이식을 수행하는 것입니다. 이 방법은 줄기세포를 조절할 수 있는 수단을 제공함으로써 뇌졸중 연구 및 줄기세포 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 가장 큰 장점은 줄기세포를 in vitro에 최적화하고 이후에 이식할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 뇌졸중 회복에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 새로운 세포 전달 방법으로 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 사용자는 세포 챔버 조립에 필요한 정밀도와 두개골 절제술과 관련된 기술로 인해 어려움을 겪을 것입니다. 준비 과정에서 2.5 x 12.5cm 금속판과 흐름 밸브를 오토클레이브합니다.

다음으로, 챔버 슬라이드를 템플릿으로 사용하여 PDMS 두 조각을 자릅니다. 한 조각은 챔버 주변의 윤곽을 그리는 역할을 합니다. 두 번째 조각에서 챔버 슬라이드 내부에서 인접한 두 조각을 잘라냅니다.

두 조각 모두 직사각형이어야 하며 챔버 슬라이드와 일치해야 합니다. 이제 재료를 겹쳐 놓습니다. 금속판부터 시작하여 절단되지 않은 PDMS, 수직 방향의 폴리피롤 플레이트, 컷아웃이 있는 PDMS, 마지막으로 셀 챔버로 시작합니다.

레이어를 조심스럽게 정렬하고 장치를 함께 고정합니다. 다음으로, 두 개의 금속 와이어를 절단하여 장치에서 인큐베이터 외부까지 연장합니다. 60cm 길이는 일반적으로 충분히 깁니다.

다음으로, 은색 페이스트를 사용하여 챔버 외부에서 튀어나온 폴리피롤 플레이트의 각 끝에 와이어를 부착합니다. 은 페이스트가 경화되면 에폭시를 사용하여 연결을 강화하고 밀봉합니다. 이제 멀티미터를 사용하여 어셈블리 전체의 저항을 기록합니다.

적용된 필드는 각 챔버에서 동일해야 합니다. 다음으로, 세포를 어셈블리에 플레이트하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 전기적으로 자극합니다. 세포를 이식하기 전에 어셈블리에서 와이어를 제거하십시오.

그런 다음 셀 챔버의 클램프를 풀고 전도성 골격에서 PDMS를 분리합니다. 이제 골격을 이식할 준비가 되었습니다. 수술 하루 전, 대상 동물에게 암피실린을 식수에 넣어 먹인다.

수술 당일, 이소플루란으로 쥐를 마취하고 발가락 꼬집기로 마취를 확인합니다. 이제 쥐의 눈에 인공 눈물을 발라 촉촉하게 유지한다. 두개골을 면도한 후 동물을 덮고 멸균 수술을 준비합니다.

보호복을 착용하고 멸균된 도구의 포장을 풀고 두피를 소독하십시오. 두개골 절제술의 경우 왼쪽 피질 위에 경막까지 구멍을 뚫습니다. 개구부를 임플란트 크기인 1 x 3mm보다 약간 크게 만듭니다.

그런 다음 경막을 열고 초박형 수술 바늘을 사용하여 뇌에서 경막을 제거합니다. TC-culture 인큐베이터에서 리그를 제거하고 리그를 비활성화합니다. 다음으로, 시험관 내 시스템의 전도성 골격을 쥐 피질에 조심스럽게 이식합니다.

그런 다음 Surgicel로 임플란트를 덮어 고정하거나 피부가 닫히는 동안 임플란트가 움직일 수 있습니다. 이제 4-0 실크 봉합사를 사용하여 상처를 봉합합니다. 봉합이 완료된 후 쥐에게 부프레노르핀 SR을 피하주사합니다. 그런 다음 쥐가 의식을 되찾을 때까지 회복 케이지에 넣습니다.

수술 후 절차는 텍스트 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다. 인간 신경 전구 세포를 전기 자극에 노출시킨 다음 세포 생존율 분석으로 염색했습니다. 녹색은 살아있는 세포를 나타냅니다.

세포는 분명히 전기 자극에서 살아남을 수 있었습니다. 뇌졸중 회복에 중요한 신경전구세포에서 방출된 인자는 정량적 RTPCR을 사용하여 총 RNA 1마이크로그램에서 평가되었습니다. 델타 델타 사이클 임계값 방법을 사용하여 결과를 정규화한 후 전기 자극에 대한 노출이 BDNF 및 THBS1 발현을 상향 조절했음을 밝힙니다.

이 절차를 시청한 후에는 전기 전도성 줄기세포를 위한 세포 배양 시스템을 만드는 방법과 이러한 줄기세포를 쥐 모델에 이식하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일단 마스터하면 제대로 수행되면 45분 안에 절차를 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 적절한 마취를 보장하기 위해 적절한 호흡 패턴과 막 색깔을 위해 항상 동물을 모니터링하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

쥐와 줄기 세포를 다루는 것은 위험할 수 있으므로 항상 적절한 PPE를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.