Name: 분리와 인간 성인 그리고 태아 심장 표본에서 파생 하는 기본 Epicardial 세포의 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 학습하세요 인간 성인 및 태아 심장에서 상피심세포유래세포를 분리하고 배양하는 방법을. 이 기술은 심장 발달 및 질환에서 상피-중간엽 전이를 연구하여 임상 적용 가능성을 높입니다.

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이 연구는 네덜란드 조직에 대 한 과학적 연구 (NWO) (아래 016.146.079) 및 LUMC 연구 친교 AMS, 및 LUMC Bontius Stichting (MJG) 둘 다에 의해 지원 됩니다.

인간의 조직 표본으로 모든 실험 라이덴 대학 메디컬 센터의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 고 헬싱키의 선언에. 모든 단계는 캐비닛 셀 문화 흐름에 멸 균 장비와 함께 수행 됩니다.
1입니다. 준비
<ol><li>Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM 낮은 포도 당) 및 매체 199 (M199) 1:1 비율로 혼합 하 여 EPDC 매체를 준비 합니다. 10% 열 비활성화 소 태아 혈 청 (FBS, 열 56 ° C에서 25 분 비활성화) 추가 100 U/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스 보충. 사전에 EPDC 매체는 37 ° C 물 욕조에 따뜻한.</li>
	<li>미리 따뜻하게 트립 신 0.25%/EDTA (1:1) 37 ° C 물 목욕에서.</li>
	<li>젤라틴과 웰 스 코트. 각 우물에 0.1% 젤라틴/PBS를 추가 하 고 37 ° c.에 적어도 15 분 동안 접시를 품 어 필요한 셀 문화 접시에 대 한 지침 표 1에 요약 되어 있습니다. 조심 스럽게 셀을 도금 하기 전에 모든 액체를 제거.</li>
	<li>재고 솔루션 10 m SB431542 m (SB), 희석 DMSO (주의)를 준비 합니다. -20 ° c.에서 그들을 저장 고 원뿔 바닥 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 튜브, Eppendorf 관 처럼 50 µ L aliquots 참고 SB aliquots는 한 번만 해빙 될 수 있습니다.</li>
</ol>2. 검색 및 성인 및 태아 심장 표본 저장
<ol><li>수술 시 제거 시 직접 인간 성인 auricles 15 mL 50 mL 튜브에 저장 10 %FBS, 100 U/mL 페니실린, 4 ° c.에 100 mg/mL 스 포함 된 높은 포도 당 DMEM 샘플은 일반적으로 3-5 cm 크기에서 및 최대 저장 될 수 있다 해 부 후 48 h.</li>
	<li>격리 후 24 h까지 4 ° C에서 EPDC 매체에서 선택 낙태 자료에서 얻은 태아 마음을 저장 합니다. 이 프로토콜에 대 한 샘플을 사용 하 여 12 월 22 일 주 사이 임신 나이. 참고 전체 심 혼은 epicardium의 격리에 대 한 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>3입니다. 절연 Epicardial 계층의
<ol><li>층 류 캐비닛에 PBS 가진 100 m m 세포-배양 접시를 준비 하 고 뚜껑에 PBS의 별도 작은 물방울 (~ 200 µ L)를 배치 합니다. 5 mL 미리 데워 진된 EPDC 매체에 15 mL 튜브를 채우십시오.</li>
	<li>장소 세포 배양 접시에 조직 PBS 가득합니다. 조직 절차 동안 자주 습 하 게 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 그것을 벗 하 여 가능한 조직 샘플에서 epicardial 계층의 제거는 stereomicroscope를 사용 하 여. 참고:로 매우 얇고, 투명 한 레이어는 밀접 하 게 심장 (그림 1A)의 바깥쪽에 준수는 epicardium은 인식할 수 있습니다. 이 격리를 방해 합니다 때문 epicardial 지방 조직 및 혈관으로 오염을 방지 하려고 합니다.</li>
	<li>뚜껑에 PBS의 물방울에 epicardial 조직의 조각을 수집 합니다.</li>
	<li>(그림 1B), 메스를 사용 하 여 또는 작은 집게의 날카로운 팁을 사용 하 여 작은 조각 (0.5 m m3)으로 epicardial 조직을 잘라. 조각을 P1, 전달할 수 있어야 합니다 참고 000 피펫으로 팁 (단계 3.6).</li>
	<li>1 mL의 트립 신 epicardial 조직에 추가 하 고 조각 및 p1, 000 피펫으로 팁 트립 신 수집. 조직 1.5 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 (그림 1C)로 전송 합니다.</li>
	<li>~ 60 rpm에서 떨고 있는 동안 10 분 동안 37 ° C 물 욕조에 튜브를 품 어.</li>
	<li>물 탕에서 튜브를 제거 하 고 70% 에탄올 튜브의 외부를 청소.</li>
	<li>(그림 1D) 관의 바닥에 침 몰 하 고 신중 하 게 상쾌한 비활성화는 트립 신을 5 mL EPDC 매체를 포함 하는 15 mL 튜브에 epicardial 셀을 포함 하는 조직을 허용.</li>
	<li>1 mL의 트립 신와 원뿔 원심 분리기 튜브에 남아 있는 조직을 보충 하 고 부드럽게 위아래로 pipetting으로 혼합.</li>
	<li>3.7 3.10 단계를 두 번 반복 합니다. 마지막 단계에서 트립 신 보육의 30 분의 총 후 전송는 상쾌한 고 나머지 epicardial 조직 EPDC 매체를 포함 하는 관으로.</li>
	<li>모든 세포는 EPDC 매체에 수집 되는 경우 부드럽게 통과 정지 10 mL 주사기 19-게이지 바늘으로 세포 (그림 1E) 기계적으로 해리를 새로운 15 mL 튜브에. 참고: 방해 지 고 바늘을 방지 하기 위해 바늘을 통해 솔루션을 전달 하기 전에 아래로 pipetting으로 현 탁 액을 균질 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>더 세포 분열, 21-게이지 바늘 3.12 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>100 µ m 셀 거르는 50 mL 튜브 위에 놓고 10 mL 피 펫을 사용 하 여 모든 나머지 덩어리 (그림 1 층)을 제거 하는 여과기에 epicardial 셀을 포함 하는 매체를 전송 합니다.</li>
	<li>5 mL EPDC 매체는 여과기에 pipetting 여 잔여 세포를 수집 여과기를 세척.</li>
	<li>피펫으로 세포 현 탁 액 15 mL 튜브에 50 mL 튜브에서. 이후 셀 튜브의 바닥에 침 몰, pipetting 전에 솔루션 부드럽게 흔들어. 참고:이 단계는 필요 하지, 하는 동안 작은 튜브 원심 분리 후 펠 릿의 시각화를 에이즈.</li>
	<li>실내 온도 (그림 1G)에 5 분 동안 200 x g에서 원심.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 필요한 양의 EPDC 매체 (표 1)에 셀 펠 릿 (그림 1 H) resuspend. 참고: 태아 EPDCs 직접 ALK5 키 니 아 제 억제 물 (EPDC + SB)의 10 µ M를 포함 하는 EPDC 매체를 사용 합니다. 성인 세포 첫 대목 중 SB 없이 도금 될 수 있다.</li>
	<li>세포 현 탁 액에 젤라틴 코팅 배양 배지 (그림 1I) 접시 우물의 크기는 epicardial 조직 샘플 (표 1)의 크기에 따라 달라 집니다. 참고 낮은 confluency 응급의 발생을 유발 한다.</li>
	<li>37 ° c, 5% CO2 문화 접시에 연결할 셀 수 있도록 적어도 48 h에 대 한 인큐베이터에 셀을 놓습니다.</li>
</ol>4입니다. EPDCs의 문화
<ol><li>EPDC + SB 매체 매 3 일 보충.</li>
	<li>적어도 3 일 마다 현미경을 사용 하 여 셀을 검사 합니다. 셀 도달 하면 confluency, 즉, 문화 접시 셀으로 완전히 덮여 때, 통로 표면 비율 1: 2에에서 셀. Note confluency 도달 ~ 5-10 일을 걸릴 수 있습니다.<ol>
<li>매체와 함께, 예를 들면, 유리 피펫으로 피펫으로 또는 포부 시스템을 사용 하 여 발음</li>
		<li>세포를 PBS를 추가 하 여 셀을 신중 하 게 씻어. 부드럽게 접시 소용돌이 PBS 발음.</li>
		<li>접시에 트립 신을 추가 합니다. 부드럽게 회전 하는 트립 신으로 모든 세포를 커버 하 고 37 ° c.에 1 분 동안 접시를 품 어 접시 참고: 사용 가능한 작은 트립 신으로 (표시: 6의 당 200 µ L 잘 플레이트)</li>
		<li>접시 접시의 아래쪽에서 세포를 기계적으로 분리를 누릅니다. 현미경을 사용 하 여 시각적으로 세포 분리가 확인. 그렇지 않으면, 추가 분에 대 한 셀 문화 접시를 품 어.</li>
		<li>셀에 EPDC + SB 매체의 필요한 볼륨을 추가 하 고 아래로, pipetting으로 resuspend 새로운 젤라틴 코팅 문화 접시에 세포 현 탁 액을 전송. 참고: 일반적으로, 세포 수에 보관 통과 8까지 조약돌 형태학.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5입니다. EPDCs 구급 대의 유도
<ol><li>세계로 유도 하 trypsin 및 전송 새로운 젤라틴을 셀 4에 설명 된 대로 EPDC + SB 매체에서 표면 비율 1:2 웰 스를 코팅 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 적어도 24 h에 대 한 품 어 세포 분열.</li>
	<li>확인 경우 confluency은 50-70% 그리고 EPDCs 조약돌 형태학입니다. 참고: Confluency 응급을 EPDCs의 능력을 영향을 줍니다.</li>
	<li>세포에서 매체를 발음 하 고 신중 하 게 PBS와 세포 세척 (단계 4.2.1-참조 4.2.2).</li>
	<li>1 ng/mL TGFβ3 EPDC 매체에와 세포를 자극 하 고 37 ° c, 5% CO2 5 일 동안 인큐베이터에 넣어. 참고는 자극, 동안 포함 하는 TGFβ3 EPDC 매체 필요가 없습니다 보충 되어야 합니다.</li>
	<li>셀을 매일 모니터링 합니다. 5 일 후 응급 수술 하는 셀은 스핀 들 모양의 형태 (그림 2A)에 의해 인식 됩니다.</li>
	<li>문화 스핀 들-모양 EPDCs EPDC 매체에 SB 또는 TGFβ의 추가 없이 4에서 설명 하는 방법. 일반적으로, 스핀 들-모양 EPDCs는 통로 20까지 양식 수 있습니다.</li>
	<li>Immunofluorescent 얼룩과 응급 발생 확인 F-말라 스트레스 섬유 (그림 2B)의 형성을 검출 하기 위하여 엽 마커 αSMA 또는 Vimentin 또는 phalloidin에 의해 항 체를 사용 하 여 또는 qRT-PCR를 사용 하 여 응급 관련 유전자 ( 에 대 한 예를 들어, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Cadherin, MMP3, 달팽이, 민 달팽이) (그림 2C 와 표 2).</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리는 상세한 프로토콜을 및 문화 기본 epicardial 세포 인간 성인 그리고 태아 심 혼에서 파생 된 설명 합니다. 이러한 세포의 광범위 한 특성은 이전에 게시17이었다. 우리는 두 세포 유형 상피 조약돌 모양의 셀 때 ALK5 키 니 아 제 억제 물 SB431542와 교양으로 유지할 수 있습니다 나타났습니다. 응급 개발 및 후 부상 응답 epicardial 활성화에 vivo에서 의 중요 한 부분 이다. 응급 수 공부 될이 메서드를 사용 하 여 TGFβ의 추가 의하여. 중요 한 것은, 이전 관찰 SB 제거 성인 EPDCs는만 자극17시 응급 수술 하는 동안 태아 EPDCs 빠르게 자발적인 응급을 받아야 합니다. 태아 EPDCs에서이 과정을 공부 하 고 최적의 성인 epicardium 손상 후 활성화 하는 방법을 이해에 도움이 수 있습니다.
제시 방법은 수술 하는 동안 ...

Epicardium, 봉투는 마음 임을 심장 개발 및 수리 (Smits 외 에 검토에 대 한 중요 한 중요성의 단일 셀 상피 층 1).는 epicardium proepicardial 기관, 개발의 기초에 있는 작은 구조에서에서 발생 하는 발달. 마우스, 그리고 4 주 후 임신 인간에서 발달 하루 E9.5, 셀 시작이 콜리플라워 구조에서 마이그레이션할 개발 심근2를 커버. 단일 상피 세포 층이 형성 되 면 epicardial 셀의 일부 엽 전환 (응급) 상피를 겪 습. 응급, 중 셀 셀 셀 유착 등 상피의 특성을 잃게 되 고 그들에 게 개발 심근으로 마이그레이션할 수 있는 능력을 주는 엽 형을 얻을. 비록 후자는 두 셀 형성된 epicardial 파생된 셀 (EPDCs) 섬유 아 세포, 평활 근 세포, 그리고 잠재적으로 cardiomyocytes와 내 피 세포3를 포함 하 여 여러 심장 세포 유형으로 분화 할 수 있다 토론 (Smits 외 에 검토에 따라 인구 남아 4). 또한,는 epicardium 규제의 성장과 vascularization5,6,,78심근에 교육적 paracrine 신호를 제공 한다. 여러 학문은 장애인된 epicardial 형성 발달 결함 심장 근육9,10, 맥 관 구조11및 전도 시스템12, 필수 강조에 리드 설명 했다 심장의 형성에 epicardium의 기여 금.
성인 심장에는 epicardium 휴면 레이어로 있으면, 비록 그것은 허 혈13시 다시 활성화 된다. Epicardial 다시 활성화 후 상해의 몇몇이 프로세스 심장 개발을 위한 확산 및 응급14, 이기는 하지만 설명 덜 효율적으로. 흥미롭게도, 비록 정확한 메커니즘은 완전히 이해 되지 않습니다, 복구 epicardial 기여와 함께, 예를 들어, Thymosin β415 처리에 의해 향상 시킬 수 있습니다 또는 mRNA VEGF A16, ameliorated 심장에 결과 수정 심근 경색 후 함수입니다. epicardium 따라서 부상된 심장의 내 생 수리를 강화 하는 재미 있는 셀 소스를 여겨진다.
심장 개발의 메커니즘은 덜 효율적인 방식 상해, 동안 자주 지는. Epicardial 활성 검색 확인 하 고 태아 및 성인 epicardium의 전체 용량을 비교할 수 있습니다 우리가 최고입니다. 또한, 치료 관점에서, 동물 실험, 뿐만 아니라 우리 인간의 epicardium의 응답에 관한 지식을 확장 중요 하다. 여기, 우리는 인간 성인 그리고 태아 epicardial 파생된 셀 (EPDCs)는 상피 세포 같은 형태학에 문화를 격리 하 고 구급 대를 유도 하는 방법을 설명 합니다. 이 모델을 우리는 탐구 하 고 성인과 태아 epicardial 셀 동작 비교 목표로 합니다.
이 프로토콜의 주요 장점은 철저 하 게 공부 하지는 인간의 epicardial 물자의 사용 이다. 중요 한 것은, 설명된 절연 및 세포 문화 프로토콜 두 태아 및 성인 자갈 EPDCs, 이러한 두 셀 소스 사이 직접적인 비교를 사용 하면 파생 단일 유니폼 방법의 제공 한다. 또한, 이후는 epicardium 격리 된 위치에 따라, 그것은 셀 실제로 epicardially 파생된17는 보장 된다.
인간의 EPDC 격리 방법을 이전 설립 되었습니다,이 주로 심장 또는 epicardial 조직의 조각 셀 문화 접시18,19에 도금는 파생물 프로토콜에 의존. 이 방법은 그로 인하여 세포는 부분적으로 마이그레이션하려면, 그들의 상피 표현 형을 잃고 그리고 자발적인 응급 수술 하는 경향이 더 위해 특별히 선택 합니다. 현재 프로토콜에서은 epicardium 상피 상태로 유지 하기 위해 고립 된 EPDCs를 허용 하는 단일 셀 솔루션으로 먼저 처리 됩니다. 이 메서드는 따라서 epicardial 응급 연구 단단한 체 외에 모델을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>둘베코' s 변형 된 독수리' s 미디엄 + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>미디엄 199&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 세럼&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0.25%</td> <td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G sodium salt</td><td>Roth</td><td>HP48</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin sulphate</td><td>Roth</td><td>HP66</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 1:250 from bovine pancreas</td><td>Serva</td><td>37289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>돼지 껍질의 젤라틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>배양 플레이트 6 웰</td><td>Greiner 바이오 온</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>배양 플레이트 12 웰</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>배양 플레이트 24 웰</td><td>Greiner 바이오 원</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드 (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102931</td><td></td></tr><tr><td>100-1000&마이크로; L 필터링된 피펫 팁</td><td>Corning</td><td>4809</td><td></td></tr><tr><td>10-ml 피펫</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>5-ml 피펫</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시 100/20 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010056</td><td>또는 집에서 만든</td></tr><tr><td>멸균 Eppendorf 튜브 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>0030120086</tr><tr><td>15ml 원심분리기 튜브</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원심분리기 튜브</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>10mL 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>305959</td><td></td></tr><tr><td>바늘 19 게이지</td><td>Becton Dickinson</td><td>301700</td><td></td></tr><tr><td>바늘 21 게이지</td><td>Becton Dickinson</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>EASY스트레이너 Cell Sieves, 100 & micro; m</td><td>Greiner 바이오 원</td><td>542000</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta; 3&nbsp;</td><td>R& D 시스템</td><td>243-B3</td><td></td></tr><tr><td>단클론 안티 액틴, &알파;-평활근</td><td>시그마</td><td>A2547&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31570</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments </td></tr><tr><td>Pipet P1,000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Pipet 컨트롤러</td><td>Integra</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>도립광 현미경</td><td>Olympus</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>GFL</td><td>1083</td><td></td></tr></tbody></table>

분리와 인간 성인 그리고 태아 심장 표본에서 파생 하는 기본 epicardial 세포의 문화

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Epicardium, 심근, 취재는 상피 세포 층 필수적인 역할 심장 개발 과정 뿐만 아니라 있다 복구 응답 심장의 허 혈 성 손상 후. 활성화 되 면, epicardial 세포 재생 심근 세포를 제공 하 엽 전환 (응급) 상피로 알려진 프로세스를 받 다. 또한,는 epicardium 필수 paracrine 요인의 분 비를 통해 기여 한다. 감사 하기 위해 완벽 하 게는 epicardium의 재생 잠재력, 인간 세포 모델이 필요 합니다. 여기 우리 소설 셀 문화 모델 인간 성인 그리고 태아 심장 조직에서 파생 하는 기본 epicardial 파생된 셀 (EPDCs)을 개설 한다. EPDCs를 분리 하는 epicardium 심장 표본의 외부에서 해 부 이며 단일 세포 현 탁 액으로 처리. 다음으로, EPDCs 도금 고가 5 키 억제제 그들의 상피 표현 형을 유지 하기 위해 SB431542를 포함 하는 EPDC 매체에서 경작. 구급 대는 TGFβ와 자극에 의해 유발 됩니다. 이 방법을 수 있도록, 처음으로, 제어 환경에서 인간의 epicardial 응급 과정의 연구 심장 재생을 원조 할지도 모른다 EPDCs의 secretome에서 더 많은 통찰력을 얻고 촉진 한다. 또한,이 균일 한 접근 인간 성인 그리고 태아 epicardial 행동의 직접적인 비교에 대 한 수 있습니다.

여기, 우리는 인간 성인 그리고 태아 심장 조직 (그림 1)에서 EPDCs를 분리 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 (그림 1A) 심장의 외부에는 epicardium의 쉽게 접근할 수 있는 위치를 활용합니다. 해 부 WT1 + epicardium 기본 subepicardial 기질 및 심근 조직 손상 (그림 1J) 유지 하는 동안 제거 됩니다 보여 줍니다 후 심장 auricle의 얼룩. 광범위 한 특성 EPDCs 익스프레스 epicardial 마커, 예를 들어, 다른 심장 상주 세포 유형, 예를 들면, PECAM1, ISL1, CD34, 및 TNNT2의 ALDH1A2, TBX18, KRT8, KRT19 및 부족 식 시연 전에 수행 되었습니다. <sup class="...

epicardium 세포와 심근 벽에 성장 요소를 제공 하 여 개발 및 심장의 수리에 중요 한 역할을 하고있다. 여기, 우리는 연구와 그들의 발달 및 성인 특성의 비교 문화 인간의 기본 epicardial 셀 하는 방법을 설명 합니다.

분리와 인간 성인 그리고 태아 심장 표본에서 파생 하는 기본 Epicardial 세포의 문화

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

이 절차의 전반적인 목표는 심외막 세포 거동을 연구하기 위해 인간 표피 유래 세포를 분리하고 배양하는 것입니다. 이 방법은 심장 발달 및 질병 중에 심외막이 어떻게 활성화되는지와 같은 심장 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간 심장 조직 샘플에 적용할 수 있다는 것인데, 이는 결과를 임상 환경으로 변환하는 데 도움이 될 수 있습니다.당사의 프로토콜은 상피 유래 세포의 상피에서 중간엽으로의 전이에 대한 조사를 설명합니다. 그러나 인자의 증식 또는 분비를 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 먼저 층류 캐비닛 내부에 PBS가 있는 100mm 세포 배양 접시를 채웁니다.약 200마이크로리터의 PBS를 뚜껑에 넣은 다음 5ml의 예열된 EPDC 매체를 15ml 튜브에 넣습니다. 성인 인간의 심장에서 분리된 심장 조직을 접시에 넣습니다. 실체 현미경으로 집게를 사용하여 심외막층을 조심스럽게 제거합니다.다음으로, 뚜껑에 있는 심외막 조직 조각을 모으고 메스를 사용하여 0.5 세제곱 밀리미터 조각으로 자릅니다. 조직 조각에 트립신 1ml를 첨가합니다. P1000 피펫 팁을 사용하여 1.5ml 원추형 원심분리 튜브로 옮깁니다.그런 다음 섭씨 37도에서 10분 동안 수조 내에서 60RPM으로 계속 흔들면서 튜브를 배양합니다. 배양 후 70% 에탄올로 튜브를 세척하고 조직이 바닥에 가라앉도록 합니다. 다음으로, 심외막 세포를 포함하는 상등액을 5ml의 EPDC 배지가 있는 15ml 튜브로 조심스럽게 옮겨 트립신을 비활성화합니다.원심분리기 튜브의 남은 조직에 트립신 1ml를 넣고 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 트립신 배양 단계를 두 번 더 반복합니다. 최종 채취 후, 남은 심외막 조직을 세포 현탁액이 들어 있는 튜브로 옮깁니다.부드러운 피펫팅으로 세포 현탁액을 철저히 균질화한 다음 19게이지 바늘이 있는 10ml 주사기를 사용하여 현탁액의 세포를 기계적으로 해리하고 현탁액을 새로운 15ml 튜브로 옮깁니다. 세포를 추가로 해리하려면 21게이지 바늘이 있는 10ml 주사기를 통해 세포 현탁액을 통과시킵니다. 다음으로, 10ml 피펫을 사용하여 50ml 튜브 상단의 100마이크로미터 셀 스트레이너로 셀 현탁액을 옮깁니다.서스펜션이 스트레이너를 통과하여 남아 있는 모든 덩어리를 제거하도록 합니다. 스트레이너에 5ml의 EPDC 배지를 추가하여 잔류 세포를 수집합니다. 잠깐

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜에서는 전자 와트 심방 부정맥 쥐에 트리거에 기여 쥐와 인간의 마음에서 (또한 심장 멜라닌 세포라고도 함) 멜라닌 세포와 같은 세포의 새로운 인구를 확인했다.

마우스의 심장에서 차 멜라닌 세포와 같은 세포를 분리

기본 세포 배양은 특히 특정 발달 단계에서 유전자 변형 마우스 배아에서 세포의 특정 인구를 분석하기위한 유용한 기술이다. 여기서, 배아 심실는 해부와 해리, 항체가 결합 된 구슬 인식하고 자세한 분석을 위해 내피 세포를 분리한다.

배아 심실 내피 세포의 분리

심장 질환의 세포 기준으로 현재의 지식은 주로 동물 모델에 대한 연구에 의존한다. 여기에서 우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 하나의 실행 가능한 심근을 얻기 위해 새로운 방법을 확인합니다. 인간 심실 근세포은 전기 생리학 연구와 약물 검사를 위해 사용될 수있다.

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

여기에서는 외성장 배양 분석으로 일차 마우스 심외막 세포를 분리하고 생체 외 심장 배양 시스템을 사용하여 표피 유래 세포(EPDC)의 기능적 이동을 평가하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 EMT(epicardial epithelial-to-mesenchymal transition) 및 운동성의 유전적 및 화학적 조절자를 식별하는 데 적합합니다.

심 외막 파생물 문화 분석 및<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 심 외막 유래 세포 마이그레이션 평가

외막은 심혈관 발달 및 재생에 필요한 다능성 심혈관 전구 세포와 부분비 인자의 필수 공급원입니다. 여기에서는 마우스 배아 심외막 세포를 배양하는 방법을 설명합니다.

마우스 배아 심장에서 심 외막 세포의 체외 배양에서

인간의 심장 조직 심근 재생에 적합 할 수있는 다 능성 혈관 주위 전구체 세포 집단을 항구. 주연 세포와 CD34 + CD146 - - 외막 세포, 인간 심근에서 여기에 설명 된 기술은 원시 혈관, 즉 CD34 + CD146와 연관된 두 능성 간질 세포 집단의 동시 분리 및 정제를 허용한다.

인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리

쥐 심장에서 다른 심장 세포 유형의 분리를 위해 몇 가지 프로토콜이 개발 및 기술되었습니다. 여기에는 실험 준비 비용을 줄이기 위해 단일 준비에서 고품질 주요 심장 세포 유형 (cardiomyocytes, endothelial cell, fibroblast)을 분리 할 수있는 최적화 된 프로토콜이 설명되어 있습니다.

성인 쥐 심장에서 고품질 Cardiomyocytes, 내피 세포 및 섬유 아세포의 동시 격리

이 연구의 목표는 성인 심장에서 심근세포를 재현하고 DNA 함량 및 핵형성을 측정하는 방법을 개발하는 것입니다.

면역 세포 화학 및 Ploidy 분석을 위한 고정된 심혼에서 심근세포의 격리

우리는 소화 완충제에서 순차적 조직 소화를 통해 쥐 심혼에서 내심 과 관상 관상 내피 세포의 격리를 위한 프로토콜을 제시하고, 재발하는 원심분리기 주기에서 세포 수집 및 반대로 쥐 CD31 마이크로비드를 사용하여 세포 정화.

쥐 심장의 심실 무료 벽에서 내심 내피 및 관상 내피 세포의 격리

제시는 진동기 절단 심근 조각에서 인간과 동물 심실 심근 세포의 격리를위한 프로토콜이다. 칼슘 내성 세포의 높은 수율 (최대 200 세포/mg) 조직의 소량에서 얻을 수 있습니다 (&amp;50 mg). 프로토콜은 감기 허혈에 노출된 심근에 최대 36시간 동안 적용됩니다.

진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포의 분리

단일 성인 마우스 심장의 심실과 심실 모두에서 심근세포 및 비근구의 동시 절연을 위한 방법이 설명된다. 이 프로토콜은 매우 실행 가능한 심장 심근세포 및 비 근구세포의 일관된 수율을 초래하고 페노티핑 및 체외 분석을 위한 최적의 세포 별 배양 조건을 자세히 설명합니다.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

학습하세요 인간 성인 및 태아 심장에서 상피심세포유래세포를 분리하고 배양하는 방법을. 이 기술은 심장 발달 및 질환에서 상피-중간엽 전이를 연구하여 임상 적용 가능성을 높입니다.

분리와 인간 성인 그리고 태아 심장 표본에서 파생 하는 기본 Epicardial 세포의 문화

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