Name: 간단한 Cytometry 결정 체 외에서 항 체 의존의 향상 뎅기열 바이러스 Zika 바이러스 미리 혈 청을 사용 하 여 분석 결과 기반으로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 학습하세요 체외에서 항체 의존적 감염 증폭을 분석하는 방법을 배우세요. Zika 바이러스 회복기 혈청이 뎅기 바이러스 감염을 증폭시키는 능력을 평가하는 고효율 프로토콜입니다.

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설명된 프로젝트 JJM에 건강 과학의 Uniformed 서비스 대학에서 기금에 의해 지원 되었다. 의견이 나 주장을 여기에 포함 된 저자의 개인 그들 고 수 해석으로 공식 또는 반영의 플레이 국방부, 건강 과학의 Uniformed 서비스 대학 또는 미국의 다른 기관 정부입니다.
WGV 모든 실험을 수행 하 고 분석 데이터; JJM 설계 하 고 감독 연구; WGW와 JJM 종이 썼다.

여기에 설명 된 프로토콜을 설명 하는 데 사용 하는 혈 청 샘플 평가 및 실험 동물 관리 인증 협회에서 지 내게 및 지역, 주에 대 한 신경 및 연방 정책 이었던 붉은 털 원숭이에서 가져온 국제 (AAALAC)-시설 인가. 모든 동물 실험 했다 검토 하 고 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회 샘플 공유 프로토콜 조직을 통해 인수 했다.
1. 주 1
참고: BSL-2 실험실에서 조직 문화에 사용 되는 살 균 층 류 biosafety 캐비닛에 아래 설명 된 모든 단계를 수행 합니다.
<ol><li>혈 청 샘플 실 온에서 해 동 하 고 무 균 튜브에 각 혈 청 샘플의 100 µ L를 전송. 열 물 목욕 또는 온도 조정 가능한 thermomixer 56 ° C에서 30 분 동안 비활성화. 1:1,000 찬 RPMI-10 (10% 태아 둔감 한 혈 청와 RPMI)를 사용 하 여 1: 1에서 배열 하는 혈 청 샘플의 10 연속 희석을 확인 합니다.</li>
	<li>살 균 96 잘 V-하단 플레이트의 각 음을 순차적으로 희석된 혈 청 샘플의 10 µ L를 전송 합니다. 고 하지 않고 혈 청 견본과 RPMI-10만 RVPs와 혈 청 샘플 없이 제어 웰 스, RVPs와 RPMI-10의 두 세트를 포함 합니다. 각 혈 청 샘플 및 triplicates RPMI-10 컨트롤을 설정 합니다.</li>
	<li>-80 ° C 냉동 및 해 동에서 뎅기열 1, 2, 3, 4 RVPs를 제거 37 ° C 물 목욕에서 그들. 해 동된 RVPs 얼음을 즉시 전송 합니다. 각 혈 청 샘플 약 170 µ L RVPs를 얻기 (각 혈 청 희석에 대 한 RVPs x 3 우물의 10 µ L (1:1, 1시 10분, 1: 100, 1:1, 000) 및 10 µ L 각 RVP와 RPMI-10 RVPs x 3 우물의 우물을 제어).</li>
	<li>각 잘 96 잘 V-바닥판 혈 청 샘플을 포함 하 고 RVPs (혈 청) 제어 웰 스와 RPMI-10 RVPs의 10 µ L 플라스틱 RVPs RPMI-10만 (아무 혈 청 샘플 및 아무 RVP) 우물을 추가 하지 마십시오. 위쪽 및 아래쪽 pipetting으로 철저 하 게 혼합 5-10 시간. 10 µ L 찬 추가 RPMI-10 대신 각 냉 RPMI-10 RVPs (아무 혈 청 샘플 및 아무 RVP) 제어 우물만.</li>
	<li>인큐베이터에 96-잘 V-바닥판을 전송 하 고 5% CO2의 37 ° C에서 1 시간 동안 접시를 품 어. 96-잘 V-바닥판 잠복기 동안 biosafety 70% 에탄올과 캐비닛의 표면을 청소 하 고 15 분 동안 자외선을 실행 합니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 K562 셀의 완전 confluent T75 플라스 크를 제거 하 고 잘 사용 하 여 살 균 5 mL 피펫으로 세포를 섞어 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 세포의 5 mL을 전송. 참고: K562 셀 RPMI-10에서 유지 되며 1 x 106/mL에서 subcultured.</li>
	<li>살 균 15 mL 원뿔 튜브에서 10 µ L 세포를 제거 하 여 세포의 수를 계산 하 고 10 µ L tryphan 블루 믹스. 15 mL 원뿔 튜브에 세포의 총 수를 결정 하는 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>15 mL 원뿔 세포 ~ 1200 x g에서 10 분간 원심, 상쾌한, 가만히 따르다와 미디어 (106 세포 /mL x 2.66)의 80, 000 셀/30 µ L의 농도에서 따뜻한 RPMI-10 셀 resuspend.</li>
	<li>인큐베이터 (단계 1.6)에서 96 잘 V-바닥판을 제거, 96-잘 V-하단 플레이트의 각 잘 K562 셀 30 µ L 전송 및 아래로 pipetting으로 철저 하 게 혼합 5-10 시간. 인큐베이터에 96-잘 V-바닥판을 전송 하 고 5% CO2의 37 ° C에서 1 시간에 대 한 접시를 품 어.</li>
	<li>1 시간 배양 후 5 분 동안 인큐베이터와 ~ 1200 x g에서 원심 분리기에서 96 잘 V-바닥판을 제거 합니다. 원심, 후 거꾸로 10% 표 백제를 포함 하는 컨테이너에 접시를 켜서 우물에서 미디어를 가만히 따르다.</li>
	<li>따뜻한 RPMI-10의 125 µ L에서 resuspending에 의해 각 잘에서 셀을 세척 하 고 피 펫, 철저 하 게 믹스 10% 표 백제를 포함 하는 컨테이너에 거꾸로 접시 여 ~ 1200 x g 5 분 Decant 미디어에서 격판덮개 원심. 이 세척 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
	<li>세척, 후 RPMI-10 각, 믹스를 위아래로 피펫으로, 따뜻한 100 µ L을 추가 하 고 5% CO2의 37 ° C에서 48 h에 대 한 접시를 품 어.</li>
</ol>2. 주 3
<ol><li>96-잘 V-바닥판 포함 하는 셀의와 미디어/잘 인큐베이터에서 100 µ L을 제거 하 고 biosafety 캐비닛으로 이동. 멀티 채널 피 펫, 믹스를 사용 하 여 각각의 내용을 잘 셀을 전송 하 고 96 잘 U 아래 미디어 접시 또는에 미리 5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브 표시.</li>
	<li>1%의 100 µ L 96 잘 V-하단 플레이트에 각 잘 린스 Paraformaldehyde (PFA) 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 및 단계 2.1에서에서 96 잘 U-바닥판 또는 레이블된 5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 각각 웰 스 전송 최종 수익률 x 1 0.5%의 농도 PFA/잘 또는 튜브. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 철저 하 게 믹스, 알루미늄 호 일, 플레이트 커버와 셀을 해결 하기 위해 30 분 동안 인큐베이터에 앉아 보자.</li>
	<li>교류 cytometer 준비 (예를 들어 테이블의 자료 를 참조) 흠 없는 K562 셀 측면과 앞으로 분산형 형광 설정 함께 보정을 실행 하 여. 필요한 유일한 형광 채널은 FL1, GFP는 유일한 형광 세포에서 방출. 취득 ~ 30, 000-50000 각 샘플에서 세포. 참고: 단일 형광을 읽을 수 있는 모든 교류 cytometer로 셀 RVPs 감염 것입니다만, GFP의 존재 때문에 녹색 형광을 방출 하 고 다른 형광 채널 필요 데이터를 위해 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 데이터 분석
<ol><li>
어떤 흐름 cytometry 분석 소프트웨어를 사용 하 여 교류 cytometer에서 수집한 데이터를 분석 (재료의 표 참조).
	<ol>
<li>첫 번째 문 집합 기반으로 FSC-A (앞으로 분산형-지역) vs FSC-H (앞으로 분산형-높이) 단일 세포를 포함 분석12자동 형광 남자를 제외 하. 다음, SSC에 기반 내의 문이 셀 게이트 (사이드 분산형-지역) vs FSC-A 모든 autofluorescent 파편을 제외 하.</li>
		<li>GFP의 표현 SSC A 대 대 한 SSC A vs FSC-A 문이 세포 분석 GFP-. GFP + 셀 주위는 게이트를 설정 하 여 GFP + 혈 청 및 제어 샘플의 각 희석에 대 한 셀의 비율을 결정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 triplicate 우물에 GFP + 셀의 총 비율을 분할 하 여 각 혈 청 샘플 희석 및 제어 우물 GFP + 셀의 평균 비율을 결정 합니다.</li>
	<li>감염의 배 향상 GFP + 셀 GFP + RVPs (혈 청 샘플) 제어 웰 스와 RPMI-10에서 셀의 평균 비율을 나눈 각 희석에 대 한 혈 청 샘플의 평균 비율을 나누어 계산 합니다.</li>
	<li>희석 (x 축), 대 배 향상 (y 축) 그래프와 Tukey의 다중 비교에 대 한 게시물-특별 테스트 뒤 ANOVA를 사용 하 여 통계 분석을 수행.</li>
</ol>

<ol><li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+exposure+to+zika+virus+significantly+enhances+peak+dengue-2+viremia+in+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques.</a> Sci Rep. 7 (1), 10498(2017).</li>
<li>Stettler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity%2C+cross-reactivity%2C+and+function+of+antibodies+elicited+by+Zika+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection.</a> Science. 353 (6301), 823-826 (2016).</li>
<li>Mattia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+reporter+virus+particles+for+measuring+neutralizing+antibodies+against+each+of+the+four+dengue+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes.</a> PLoS One. 6 (11), e27252(2011).</li>
<li>Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via,, F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subclass+specificity+of+the+Fc+receptor+for+human+IgG+on+K562%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562.</a> Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).</li>
<li>Klein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+K562+cell+line%2C+derived+from+a+patient+with+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia.</a> Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).</li>
<li>Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+growth+in+human+monocytes+as+a+risk+factor+for+dengue+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever.</a> Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).</li>
<li>Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgG+Fc+receptor+II+mediates+antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection.</a> J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).</li>
<li>Wang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+antibodies+to+dengue+enhanced+for+FcgammaRIIIA+binding+determine+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity.</a> Science. 355 (6323), 395-398 (2017).</li>
<li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li>
<li>Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus-induced+antibody+response+enhances+dengue+virus+serotype+2+replication+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro.</a> J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).</li>
<li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).</li>
<li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+Cell+responses+during+secondary+dengue+virus+infection+are+dominated+by+highly+cross-reactive%2C+memory-derived+plasmablasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts.</a> J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

DENV 및 ZIKV 같은 Flaviviruses 상 동13,14서로와 cross-react 항 체를 생성 하는 그들의 둘 다 구조와 비 구조 단백질의 중요 한 증거를 공유 합니다. 이러한 cross-reactive 항 체 응답을 향상 시키기 위해 표시 되었습니다 감염의 vivo에서 그리고 생체 외에서 분리 serotype 또는 다른 관련 flaviviruses1,2. 교차 감염을 강화 하기 위하여 잠재적인 질병의 관리에 대 한 고도 백신 개발에 대 한 중요 한 의미를 갖는다.
전통 문화를 기반으로 분석 혈 청의 존재 감염 라이브 DENV로 감염 되는 비 허용 셀을 사용 합니다. 감염의 표준 패 분석 실험11...

감염의 항 체 의존 향상 (ADE) 그것에 의하여 부분적으로 cross-reactive 항 체 응답 바이러스의 serotype에 의해 유도 된 향상 증가 바이러스 성 복제 및 니 바이러스의 다른 serotype의 과정 이다. 에이드는 뎅기열 바이러스 (DENV) 감염 4 주요 serotypes는 유행에서 광범위 하 게 문서화 되었습니다. 환자의 하위 집합에서 ADE 뎅 그 열 출혈 성 열 (DHF)와 연결 됩니다. 우리는 최근에 Zika 바이러스 (ZIKV) 감염 에이드의 DENV 체 외 발생 가능성이 DENV 니 vivo에서1 의 향상에 기여 하는 DENV cross-reactive 항 체 응답의 상당히 높은 수준의 유도 나타났습니다. , 2. 항 체 의존 향상 분석 실험은 관련 바이러스 2 차 감염을 강화 flavivirus 감염의 병 인에 중요 한 통찰력을 제공 하 고 알려주는 항 체의 능력을 평가 하는 유용한 도구는 백신의 개발입니다.
분석 결과 설명 여기 감염을 일반적으로 허용 하지 않은 K562 셀 함께 DENV RVPs를 사용 합니다. RVPs는 구조적으로 그대로 복제 무능 한 DENV 바이러스 성 입자를 복제3의 단일 라운드 후 표현 되는 하위 게놈 녹색 형광 단백질 (GFP) replicon 인코딩. 이와 같이, RVPs에 감염 되는 세포 형광 녹색 및 cytometry 또는 현미경을 사용 하 여 쉽게 감지가 가능. 이 분석 결과에서 사용 하는 RVPs 상용 소스 로부터 얻은 했다. 그러나 그들은,, 수 다른 바이러스에 대 한 생성 하 고이 원고에서 설명 하는 분석에 사용. 한편, K562 세포는 FcγIII 수용 체 표현 하는 백혈병 세포 선 항 체의 Fc 지역에 바인딩할 하 고 하위 중화 항 체4,5의 농도 존재 감염 될 있습니다.
에이드 분석 심한 뎅기열 및 생체 외에서 ADE의 메커니즘을 나타내는 위험 요인 조사 연구에서 광범위 하 게 사용 된6,,78. 여기에 설명 된 에이드 분석 결과 신속 하 고 쉽게 사용할 수 RVPs를 사용 하 여 체 외에서 감염을 강화 하 고 flow cytometry, 현재 사용 중 하나 필요로 하는 다른 분석에 비해 플 라크 형성의 결정에 대 한 혈 청의 용량을 확인 Vero 세포 또는 항 체의 얼룩에 (pfu) 단위 세포6,7,,89,10,11, 둘 다 시간이 소요 되며 노동 감염 집중.

<table><tbody><tr><td>DENV 1-4 RVP</td><td>통합 분자</td><td>RVP-501</td><td></td></tr><tr><td>K562 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE lifesceinces</td><td>SH 30910.03</td><td>RPMI-10</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>MP 생체 의학</td><td>1670049</td><td>100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10</td></tr><tr><td>HEPES</td>RPMI-10 MEM 비필수 아미노산 용액의 <td>Cellegro</td><td>25-060-Cl</td><td>0.025M</td></tr><tr><td>(100배;)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>1x in RPMI-10</td></tr><tr><td>나트륨 피루브산</td><td>Cellegro</td><td>25-000-Cl</td><td>1mM in RPMI-10</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25005CI&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>멸균 V-바닥 플레이트</td><td>Thomas Scientific</td><td>333-8001-01V</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 폴리프로필렌 5ml FACS 튜브</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>비멸균 U-바닥 플레이트</td><td>Falcon</td><td>Ref 353910</td> FACS 튜브 5mL, 멸균, 혈청학적 피펫<td>에 대한 고처리량 대안</td></tr><tr><td></td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>200uL 멸균 피펫 팁</td><td>Denville</td><td>P3020 CPS</td><td></td></tr><tr><td>20uL 멸균 피펫 팁</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>50-200uL 멀티채널 피펫</td><td>Denville</td><td>P3975-8-B</td><td></td></tr><tr><td>5-50uL 멀티채널 피펫</td><td>Denville</td><td>P3975-9-B</td><td></td></tr><tr><td>20% 포마데하이드</td><td>Tousimis</td><td>&nbsp;#1008B</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>ThermoFisher</td><td>TSCOL35</td><td></td></tr><tr><td>thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>2231000387</td><td>열 비활성화를 위한 수조의 대안</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>ThermoFisher</td><td>13-998-213</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>액체 표백제</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo 9.8</td><td>TreeStar, Inc.</td><td></td><td>유세포 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>BD FACSDiva 6.1.2</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II 유세포 분석기</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Bleach</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr></tbody></table>

간단한 cytometry 결정 체 외에서 항 체 의존의 향상 뎅기열 바이러스 zika 바이러스 미리 혈 청을 사용 하 여 분석 결과 기반으로

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

감염의 항 체 의존 향상 뎅기열 바이러스 성 병 인에 중요 한 역할을 보여줘 왔다. 허용 되지 않는 세포에 감염을 강화 하기 위하여 항 체 또는 혈 청의 용량을 측정 하는 전통적인 분석 패 분석 실험에 의해 다음 미디어에 바이러스 출력을 사용 하 여 감염을 계량에 의존 했습니다. 더 최근에, 이러한 분석 붙일 레이블된 항 체를 사용 하 여 셀 라인에서 뎅기열 바이러스 (DENV) 감염을 검사 있다. 이러한 두 방법 모두 이러한 기술의 광범위 한 사용을 제한 하는 제한 사항이 있습니다. 여기, 우리가 설명 하는 간단한 체 외에서 분석 결과 사용 하 여 뎅기열 바이러스 기자 바이러스 성 입자 (RVPs) 녹색 형광 성 단백질 및 항 체 의존 향상 (ADE) 붉은 털에서 얻은 혈 청을 사용 하 여 DENV 감염의 검사 K562 셀을 나타내는 원숭이 Zika 바이러스 (ZIKV) 감염 후 16 주. 이 기술은 신뢰할 수 있는, 포함 하는 셀의 최소한의 조작, 라이브 복제 유능한 바이러스의 사용을 포함 하지 않습니다 이며 cytometry 사용 하 여 양적 판독을 얻으려면 높은 처리량 형태로 수행할 수 있습니다. 또한이 분석 결과 항 체 의존 향상 (ADE) 황열병 바이러스 (YFV), 일본 말 뇌염 바이러스 (JEEV), 웨스트 나 일 바이러스 (WNV) RVPs를 사용할 수 있는 등 다른 flavivirus 감염의 검사에 쉽게 적응 될 수 있다. 분석 결과 설정의 용이성, 데이터를 분석 하 고 결과 해석 하면 높은 대부분의 실험실 설정 의무가 있습니다.

4 붉은 털 원숭이 ZIKV 감염 후 수집 된 16 주 및 DENV-1을 향상 시키기 위해 그들의 잠재력에 대 한 테스트에서 세라, K562 셀에 2, 3, 4 감염. 동물 감염 후 7 일에 의해 탐지의 제한 된 수준에 거부 하는 감염 후 3 일 ~ 105 부 ZIKV 플라즈마의 RNA/mL의 x 1의 피크 니를 했다. 아니 니 16 주 후 감염에서 플라즈마에서 발견 되었다. 그리고, RVP 분석 결과 수행 위의 프로토콜에 설명 된 대로, 수집 된 데이터 분석 했다.
GFP + 셀을 식별 하는 데 사용 하는 제어 전략은 그림 1에 표시 됩니다. 초기 게이트 autofluorescent 남자를 제외 하 고 금감위 A vs FSC-헤에 따라 단일 셀 포함 설정 다음 플롯 표시; 단일 셀에서에서 ...

우리는 Zika 바이러스 미리 혈 청 뎅기열 바이러스 기자 바이러스 성 입자를 사용 하 여 감염의 항 체 의존 향상을 측정 하기 위한 간단 하 고 쉬운 프로토콜을 설명 합니다.

간단한 Cytometry 결정 체 외에서 항 체 의존의 향상 뎅기열 바이러스 Zika 바이러스 미리 혈 청을 사용 하 여 분석 결과 기반으로

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

이 절차의 전반적인 목표는 지카 바이러스에 감염된 붉은털 원숭이에서 채취한 혈청의 능력을 측정하여 체외에서 뎅기열 바이러스 감염의 항체 의존성 강화를 매개하는 것입니다. 이 방법은 지카 바이러스 유도 교차 반응 항체에 의한 뎅기열 감염의 항체 의존성 향상과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 트로퍼가 높고 간단하며 수행하기 쉽다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 신흥 감염병 대학원생인 William Valiant입니다. 먼저 혈청 샘플을 실온에서 해동합니다. 해동되면 각 혈청 샘플 100마이크로리터를 멸균 튜브에 옮기고 섭씨 56도에서 30분 동안 가열하고 활성화합니다.다음으로, 저온 RPMI 10에서 1:1에서 1:1,000까지 혈청 샘플을 10배 연속 희석합니다. 그런 다음 10마이크로리터의 희석된 각 혈청 샘플을 멸균 96웰 V-바닥 플레이트의 웰로 옮깁니다. 다음으로, 뎅기열 1, 2, 3, 4개의 프로포터 바이러스 입자를 섭씨 37도의 수조에서 해동하여 혈청 샘플당 각 RVP당 약 170마이크로리터의 부피를 확보합니다.해동되면 즉시 RVP 튜브를 얼음으로 옮깁니다. 그런 다음 10마이크로리터의 RVP를 혈청 샘플 희석액이 들어 있는 웰에 피펫으로 주입하여 혈청이 없는 대조군 웰에 넣습니다. 5-10회 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합합니다.96웰 V-바닥 플레이트를 인큐베이터로 옮기고 5%의 이산화탄소가 있는 상태에서 섭씨 37도에서 한 시간 동안 배양합니다. 96웰 V-바닥 플레이트가 배양하는 동안 생물 안전 캐비닛 표면을 70% 에탄올로 청소하고 자외선을 15분 동안 실행합니다. 그런 다음 인큐베이터에서 K562 세포의 완전히 합류하는 T-75 플라스크를 제거합니다.멸균 5mm 피펫을 사용하여 세포를 잘 혼합하고 5ml를 멸균 15mm 원추형 튜브에 옮깁니다. 다음으로, 튜브에서 10마이크로리터의 세포를 제거하고 10마이크로리터의 트리판 블루와 혼합한 다음 혈구계에 로드합니다. 셀을 세고 총 셀 수를 계산합니다.10분 동안 1200배 G로 세포를 원심분리한 후, 상등액을 디캔팅하고 배지 30마이크로리터당 80,000개 세포의 농도로 따뜻한 RPMI 10에서 세포를 다시 현탁시킵니다. 인큐베이터에서 96웰 V-바닥 플레이트를 제거한 후 30마이크로리터의 K562 셀을 96웰 V-바닥 플레이트의 각 벽으로 옮깁니다. 그리고 5회에서 10회 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합하십시오.그런 다음 플레이트를 1시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 배양 후 플레이트를 1200회 G로 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 플레이트를 10% 표백제가 들어 있는 용기에 거꾸로 뒤집어 웰에서 매체를 디캔팅합니다.그런 다음 125마이크로리터의 따뜻한 RPMI 10에 다시 현탁시키고 이전과 같이 원심분리하여 각 벽의 세포를 세척합니다. 마지막 세척을 디캔팅한 후 각 웰에 따뜻한 RPMI 10 100마이크로리터를 추가합니다. 피펫과 위아래로 섞고 48%의 이산화탄소가 있는 상태에서 섭씨 37도에서 5시간 동안 플레이트를 배양합니다.이틀 후, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰의 내용물을 혼합하고 96웰 U-바닥 플레이트로 옮깁니다. 96웰 V-바닥 플레이트의 각 웰을 100마이크로리터의 1% 파라포름알데히드 및 PBS로 헹구고 나머지 셀과 PBS를 96웰 U-바닥 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다.멀티채널 피펫을 사용하여 철저히 혼합합니다. 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 인큐베이터에 30분 동안 그대로 두어 세포를 고정합니다. 염색되지 않은 K562 세포를 실행하여 GFP 형광에 대한 에틸-원 채널을 사용하여 측면 및 전방 산란 설정을 보정하여 유세포 분석기를 준비합니다.그런 다음 각 샘플에서 30,000개에서 50,000개의 세포를 획득합니다. 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 전방 산란 면적 대 전방 산란 면적을 기준으로 첫 번째 게이트를 설정하여 단일 세포를 포함하고 자가형광 듀블릿을 분석에서 제외합니다. 각 조건에 대한 GFP 양성 세포의 평균 백분율을 계산한 다음 각 혈청 희석에 대한 감염 배율 향상을 계산합니다.y축의 그래프 접힘 향상과 x축의 희석을 비교하고 ANOVA를 사용하여 통계 분석을 수행한 후 다중 비교를 위한 Tukey의 사후 테스트를 수행합니다. 뎅기열 바이러스를 사용하는 대표적인 동물의 데이터, 하나의 리포터 바이러스 입자가 여기에 나와 있습니다. 무혈청 대조군 샘플에 대한 GFP 양성 세포의 비율은 0.253%, 희석되지 않은 혈청 샘플은 2.58%GFP 양성이었습니다.GFP 양성 세포의 비율은 1-10 개의 혈청 희석에서 12.8 %의 최고치에 도달했으며, 1-100 개의 희석에서 0.735 %, 1-1,000 개의 희석에서 0.022 %에 이어졌습니다. 뎅기열 감염의 항체 의존성 강화는 4가지 뎅기 바이러스 혈청 유형에 대해 검사되었습니다. 이 데이터는 감염 후 16주에 채취한 혈청이 1에서 10까지의 희석으로 모든 뎅기열 바이러스 혈청 유형에 의한 K562 세포의 감염을 유의하게 향상시켰다는 것을 보여줍니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 48시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 30분의 최종 고정 단계가 완료된 후 1-2시간 이내에 데이터를 수집해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 감염된 혈청으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 PPE 및 BSL2 수준 관행과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Source: Asad, S., et al. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates antibody-dependent enhancement of Zika virus infection in human primary macrophages, using dengue antibody–virus complexes to model how cross-reactive antibodies facilitate Fcγ receptor–mediated viral entry and replication for studying infection mechanisms and immune interactions.

Antibody-Dependent Enhancement of Zika Virus by Dengue Antibodies in Human Primary Macrophages

이 비디오는 지카 바이러스 회복기 혈청을 사용하여 뎅기열 바이러스 감염의 항체 의존성 향상(ADE)을 측정하는 분석을 보여줍니다. 이 분석은 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 뎅기열 리포터 바이러스 입자(RVP)를 사용합니다. 지카 바이러스에 대한 혈청 항체는 RVP와 교차 반응하여 복합체를 형성합니다. 결합된 항체는 Fc 수용체를 발현하는 세포의 RVP 흡수를 향상시키며, 이는 유세포 분석을 사용하여 검출됩니다.

바이러스 감염의 항체 의존성 증진을 조사하기 위한 In vitro assay

이 비디오는 인간 병원체인 지카 바이러스에 대한 항바이러스 활성이 있는 인터페론을 스크리닝하기 위한 체외 분석을 보여줍니다. 숙주 세포 내에서 지카 바이러스는 내재화 시 증식을 거쳐 주변 세포를 감염시키고 뚜렷한 영역 또는 바이러스 플라크를 생성합니다. 항바이러스제 역할을 하는 I형 인터페론은 바이러스 증식을 방해하여 숙주 세포 단층에서 바이러스 플라크의 형성을 방지합니다.

지카 바이러스 성장의 강력한 억제제로서 인터페론을 스크리닝하기 위한 체외 분석

지카 바이러스(ZIKV)는 신종 병원체로, 태아 발달 이상 및 소두증과 관련이 있습니다. 효과적인 감염성 세포 배양 시스템의 구축은 ZIKV 복제 연구와 백신 및 약물 개발에 매우 중요합니다. 본 연구에서는 ZIKV와 관련된 다양한 바이러스 분석을 설명하고 논의합니다.

Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과<em&gt; 체외</em인터페론의&gt; 예방 효과

바이러스 또는 세포외 소포체는 표면 항원을 인식하는 항체에 결합된 15nm 자성 나노입자로 면역포획되었습니다. 포획된 비리온 또는 소포는 다른 표면 항원에 대한 형광 항체로 표지되었습니다. 그 결과로 생성된 복합체는 높은 자기장에서 분리되고 형광에 트리거된 기존 유세포 분석기로 분석되었습니다.

비리의 항원 스펙트럼과 세포 외 소포를 분석하는 Virometry 흐름

현재 다중화 Zika, chikungunya, 뎅 그 열 바이러스 복잡 한 샘플 준비 및 비싼 장비를 요구 하 고 저 리소스 환경에서 사용 하기 어려운 검출 하는 진단. 우리는 감지 하 여 높은 감도와 특이성이이 바이러스를 차별화 대상 특정 가닥 displaceable 프로브 등온 증폭을 사용 하는 진단을 보여줍니다.

멀티플렉스 등온 증폭 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 감지 진단 플랫폼을 기반으로

Zika 바이러스 (ZIKV) 감염에 대 한 Ifnar1-/- murine 모델의 immunoprivileged 장기에 항 원 특정 T 세포 응답을 평가 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 보호의 셀룰러 메커니즘 및 immunopathogenesis ZIKV 백신의 조사에 대 한 중추적인 이며 또한 그들의 효능 평가 위한 귀중 한.

감염 된 Ifnar1/- 생쥐의 Immunoprivileged 장기에서 Zika 바이러스 관련 T 세포 응답의 평가

우리는, 사용 하 여 인간의 혈 청 기본 인간 세포 감염 부 량 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응에 의해 Zika 바이러스 감염에 뎅기열 바이러스에 대 한 기존의 면역의 효과 평가 하는 방법을 설명 합니다.

기본 인간 세포에서 Zika 바이러스의 항 체 의존 향상의 정량화

본 프로토콜은 베로 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포에서 지카 바이러스(ZIKV)의 증식과 24웰 및 96웰(고처리량) 형식의 세포 기반 비색 면역검출 방법을 사용한 ZIKV의 정량화에 대해 설명합니다.

바이러스 전파 및 세포 기반 비색 정량화

여기에서는 인간 세포에서 지카 바이러스 감염 및 복제를 실시간으로 연구하는 매우 쉽고 간단한 방법으로 세포 기반 전기 임피던스(CEI)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 또한, CEI 분석은 항 바이러스 화합물의 평가에 유용합니다.

지카 바이러스 억제제를 실시간으로 평가하기 위한 세포 기반 전기 임피던스 플랫폼

학습하세요 체외에서 항체 의존적 감염 증폭을 분석하는 방법을 배우세요. Zika 바이러스 회복기 혈청이 뎅기 바이러스 감염을 증폭시키는 능력을 평가하는 고효율 프로토콜입니다.

간단한 Cytometry 결정 체 외에서 항 체 의존의 향상 뎅기열 바이러스 Zika 바이러스 미리 혈 청을 사용 하 여 분석 결과 기반으로

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