간단한 Cytometry 결정 체 외에서 항 체 의존의 향상 뎅기열 바이러스 Zika 바이러스 미리 혈 청을 사용 하 여 분석 결과 기반으로

이 절차의 전반적인 목표는 지카 바이러스에 감염된 붉은털 원숭이에서 채취한 혈청의 능력을 측정하여 체외에서 뎅기열 바이러스 감염의 항체 의존성 강화를 매개하는 것입니다. 이 방법은 지카 바이러스 유도 교차 반응 항체에 의한 뎅기열 감염의 항체 의존성 향상과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 트로퍼가 높고 간단하며 수행하기 쉽다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 신흥 감염병 대학원생인 William Valiant입니다. 먼저 혈청 샘플을 실온에서 해동합니다. 해동되면 각 혈청 샘플 100마이크로리터를 멸균 튜브에 옮기고 섭씨 56도에서 30분 동안 가열하고 활성화합니다.

다음으로, 저온 RPMI 10에서 1:1에서 1:1,000까지 혈청 샘플을 10배 연속 희석합니다. 그런 다음 10마이크로리터의 희석된 각 혈청 샘플을 멸균 96웰 V-바닥 플레이트의 웰로 옮깁니다. 다음으로, 뎅기열 1, 2, 3, 4개의 프로포터 바이러스 입자를 섭씨 37도의 수조에서 해동하여 혈청 샘플당 각 RVP당 약 170마이크로리터의 부피를 확보합니다.

해동되면 즉시 RVP 튜브를 얼음으로 옮깁니다. 그런 다음 10마이크로리터의 RVP를 혈청 샘플 희석액이 들어 있는 웰에 피펫으로 주입하여 혈청이 없는 대조군 웰에 넣습니다. 5-10회 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합합니다.

96웰 V-바닥 플레이트를 인큐베이터로 옮기고 5%의 이산화탄소가 있는 상태에서 섭씨 37도에서 한 시간 동안 배양합니다. 96웰 V-바닥 플레이트가 배양하는 동안 생물 안전 캐비닛 표면을 70% 에탄올로 청소하고 자외선을 15분 동안 실행합니다. 그런 다음 인큐베이터에서 K562 세포의 완전히 합류하는 T-75 플라스크를 제거합니다.

멸균 5mm 피펫을 사용하여 세포를 잘 혼합하고 5ml를 멸균 15mm 원추형 튜브에 옮깁니다. 다음으로, 튜브에서 10마이크로리터의 세포를 제거하고 10마이크로리터의 트리판 블루와 혼합한 다음 혈구계에 로드합니다. 셀을 세고 총 셀 수를 계산합니다.

10분 동안 1200배 G로 세포를 원심분리한 후, 상등액을 디캔팅하고 배지 30마이크로리터당 80,000개 세포의 농도로 따뜻한 RPMI 10에서 세포를 다시 현탁시킵니다. 인큐베이터에서 96웰 V-바닥 플레이트를 제거한 후 30마이크로리터의 K562 셀을 96웰 V-바닥 플레이트의 각 벽으로 옮깁니다. 그리고 5회에서 10회 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합하십시오.

그런 다음 플레이트를 1시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 배양 후 플레이트를 1200회 G로 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 플레이트를 10% 표백제가 들어 있는 용기에 거꾸로 뒤집어 웰에서 매체를 디캔팅합니다.

그런 다음 125마이크로리터의 따뜻한 RPMI 10에 다시 현탁시키고 이전과 같이 원심분리하여 각 벽의 세포를 세척합니다. 마지막 세척을 디캔팅한 후 각 웰에 따뜻한 RPMI 10 100마이크로리터를 추가합니다. 피펫과 위아래로 섞고 48%의 이산화탄소가 있는 상태에서 섭씨 37도에서 5시간 동안 플레이트를 배양합니다.

이틀 후, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰의 내용물을 혼합하고 96웰 U-바닥 플레이트로 옮깁니다. 96웰 V-바닥 플레이트의 각 웰을 100마이크로리터의 1% 파라포름알데히드 및 PBS로 헹구고 나머지 셀과 PBS를 96웰 U-바닥 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다.

멀티채널 피펫을 사용하여 철저히 혼합합니다. 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 인큐베이터에 30분 동안 그대로 두어 세포를 고정합니다. 염색되지 않은 K562 세포를 실행하여 GFP 형광에 대한 에틸-원 채널을 사용하여 측면 및 전방 산란 설정을 보정하여 유세포 분석기를 준비합니다.

그런 다음 각 샘플에서 30,000개에서 50,000개의 세포를 획득합니다. 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 전방 산란 면적 대 전방 산란 면적을 기준으로 첫 번째 게이트를 설정하여 단일 세포를 포함하고 자가형광 듀블릿을 분석에서 제외합니다. 각 조건에 대한 GFP 양성 세포의 평균 백분율을 계산한 다음 각 혈청 희석에 대한 감염 배율 향상을 계산합니다.

y축의 그래프 접힘 향상과 x축의 희석을 비교하고 ANOVA를 사용하여 통계 분석을 수행한 후 다중 비교를 위한 Tukey의 사후 테스트를 수행합니다. 뎅기열 바이러스를 사용하는 대표적인 동물의 데이터, 하나의 리포터 바이러스 입자가 여기에 나와 있습니다. 무혈청 대조군 샘플에 대한 GFP 양성 세포의 비율은 0.253%, 희석되지 않은 혈청 샘플은 2.58%GFP 양성이었습니다.

GFP 양성 세포의 비율은 1-10 개의 혈청 희석에서 12.8 %의 최고치에 도달했으며, 1-100 개의 희석에서 0.735 %, 1-1,000 개의 희석에서 0.022 %에 이어졌습니다. 뎅기열 감염의 항체 의존성 강화는 4가지 뎅기 바이러스 혈청 유형에 대해 검사되었습니다. 이 데이터는 감염 후 16주에 채취한 혈청이 1에서 10까지의 희석으로 모든 뎅기열 바이러스 혈청 유형에 의한 K562 세포의 감염을 유의하게 향상시켰다는 것을 보여줍니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 48시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 30분의 최종 고정 단계가 완료된 후 1-2시간 이내에 데이터를 수집해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 감염된 혈청으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 PPE 및 BSL2 수준 관행과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.