Name: Chloropicrin 및 수소 불 화물 유발 각 막 상피 세포 상해에 대 한 높은 처리량 SiRNA 심사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 20 s
Description: 배우세요 각막 상피 세포에서 독성 물질 손상에 대한 고처리량 siRNA 스크리닝 방법을. 수소 불화물 및 Chloropicrin 유발 세포 반응 경로를 규명하여 안구 독성 연구와 치료 전략 개발에 기여합니다.

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이 연구로는 국립 연구소의 건강 중화 프로그램 부처간 계약 # AOD13015-001 지원 되었다. 우리는 그들의 노력과 전문 비디오 제작에 대 한 스테파니 Froberg 피터 허스트를 감사 하 고 싶습니다.

<ol><li>Randleman, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRandleman%2C+B+%22Drugs%2C+Diseases+and+Procedures%22">Drugs, Diseases and Procedures</a>. Hampton, R. , Medscape. (2011).</li>
<li>Fish, R., Davidson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+ocular+thermal+and+chemical+injuries%2C+including+amniotic+membrane+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+treatment+strategies+for+hydrofluoric+acid+burns%3A+current+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects.</a> Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).</li>
<li>Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+toxicology%3A+tools+to+advance+the+future+of+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing.</a> Frontiers in Genetics. 5, 110(2014).</li>
<li>North, M., Vulpe, C. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3100848/">Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).</li>
<li>McManus, M. T., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+mammals+by+small+interfering+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in mammals by small interfering RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).</li>
<li>Bassik, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+mammalian+genetic+interaction+map+reveals+pathways+underlying+ricin+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility.</a> Cell. 152 (4), 909-922 (2013).</li>
<li>Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+high-throughput+screen+identifies+proteins+necessary+for+the+AHR-dependent+induction+of+CYP1A1+by+2%2C3%2C7%2C8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).</li>
<li>Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCox%2C+JA+%22Chemical+Terrorism+Risk+Assessment%3B+CSAC+12-006%22">Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006</a>. , U.S. Department of Homeland Security, Science and Technology Directorate, Chemical Security Analysis Center. Aberdeen Proving Ground, MD. (2012).</li>
<li>Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/267200748_Cell-Based_Assays_in_High-Throughput_Screening_for_Drug_Discovery">Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery.</a> International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).</li>
<li>Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+convenient+fluorometric+method+to+study+sulfur+mustard-induced+apoptosis+in+human+epidermal+keratinocytes+monolayer+microplate+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture.</a> Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).</li>
<li>Ruff, A. L., Dillman, J. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfur+mustard+induced+cytokine+production+and+cell+death%3A+investigating+the+potential+roles+of+the+p38%2C+p53%2C+and+NF-kappaB+signaling+pathways+with+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Molecular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).</li>
<li>Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+human+epidermal+keratinocytes+in+culture+as+a+model+for+studying+the+biochemical+mechanisms+of+sulfur+mustard+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity.</a> Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Toxnet%22">Toxnet</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://toxnet.nlm.nih.gov/">https://toxnet.nlm.nih.gov/</a> (2016).</li>
<li>Bancroft, W. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBancroft%2C+WD+%22The+Medical+Department+of+the+United+States+Army+in+the+World+War%22">The Medical Department of the United States Army in the World War</a>. 14, Otis Historical Archives, National Museum of Health and Medicine. (1926).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Chloropicrin+Risk+Characterization+Document%22">Chloropicrin Risk Characterization Document</a>. , California Environmental Protection Agency. (2012).</li>
<li>Aigueperse, J., et al. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14356007.a11_307">Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry</a>. , Wiley-VCH. (2000).</li>
<li>Sotozono, C. <a target="_blank" href="https://journals.lww.com/corneajrnl/Abstract/2000/11003/Second_Injury_in_the_Cornea__The_Role_of.4.aspx">Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair.</a> Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+and+Recommendations+for+Dharmacon+siRNA+Libraries%22">Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf">http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf</a> (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Lipofectamine+RNAiMAX+Reagent%22">Lipofectamine RNAiMAX Reagent</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf
">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf
</a> (2017).</li>
<li>Denizot, F., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorimetric+assay+for+cell+growth+and+survival.+Modifications+to+the+tetrazolium+dye+procedure+giving+improved+sensitivity+and+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.</a> Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22IL-8+%28human%29+AlphaLISA+Detection+Kit%2C+5%2C000+Assay+Points%22">IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points</a>. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3">http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3</a> (2016).</li>
<li>Araki-Sasaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Ruff, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+mouse+model+for+sulfur+mustard-induced+ocular+injury+and+long-term+clinical+analysis+of+injury+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cutaneous+and+Ocular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22GeneTitan+MC+Instrument+North+America%2FJapan+%28110V%29%22">GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V)</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372</a> (2018).</li>
<li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pair+of+new+statistical+parameters+for+quality+control+in+RNA+interference+high-throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays.</a> Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).</li>
<li>He, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Sodium+Fluoride+on+the+Proliferation+and+Gene+Differential+Expression+in+Human+RPMI8226+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Trace+Element+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells.</a> Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).</li>
<li>Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+gene+networks+involved+in+sodium+fluoride-elicited+cell+death+accompanying+endoplasmic+reticulum+stress+in+oral+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).</li>
<li>Pesonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloropicrin-induced+toxic+responses+in+human+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells.</a> Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).</li>
<li>Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilhelm%2C+SN+%22Fumigants%3A+Environmental+Fate%2C+Exposure%2C+and+Analysis%22">Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis</a>. Seiber, J. N., et al. 652, American Chemical Society. Ch. 8 (1997).</li>
<li>Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+effects+of+fluoride+ions+on+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annales+Academiae+Medicae+Stetinensis%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity.</a> Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).</li>
<li>Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+neutralizes+fluoride+bioavailability+in+a+lethal+model+of+fluoride+poisoning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicology%3A+Clinical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning.</a> Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).</li>
<li>Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloropicrin%3A+reactions+with+biological+thiols+and+metabolism+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice.</a> Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).</li>
<li>Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloropicrin+dechlorination+in+relation+to+toxic+action%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Molecular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).</li>
<li>Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1421657/">Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4.</a> Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).</li>
<li>van der Poll, T., Lowry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+interleukin+8+production+by+human+whole+blood+is+enhanced+by+epinephrine+and+inhibited+by+hydrocortisone%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone.</a> Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).</li>
<li>Solomon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+inhibition+of+interleukin-1+in+the+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).</li>
<li>Mishra, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+oxidative+stress-induced+epigenetic+modifications+in+pancreatic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells.</a> International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).</li>
<li>Stockholm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+phenotypic+heterogeneity+in+a+clonal+cell+population+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro.</a> PLoS One. 2 (4), e394(2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ATCC+Animal+Cell+Culture+Guide%22">ATCC Animal Cell Culture Guide</a>. , American Type Culture Collection. Manassas, VA. (2014).</li>
<li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li>
<li>Mpindi, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+normalization+methods+on+high-throughput+screening+data+with+high+hit+rates+and+drug+testing+with+dose-response+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data.</a> Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).</li>
<li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illustration+of+SSMD%2C+z+score%2C+SSMD%2A%2C+z%2A+score%2C+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.
면책 조항:이 문서에 표현 들 저자와 군대의 부, 국방부, 또는 미국 정부의 공식 정책 반영 하지 않습니다. 이 연구는 NIH/NIAID 사이의 USAMRICD, 부처간의 합의 의해 지원 되었고 일부 대학원 연구 참여 프로그램에는 미국 육군 의료 연구 연구소의 화학 방어에 약속에 의해 오크에 의해 관리 릿지 연구소 과학 미국 에너지 부와 USAMRMC 사이의 부처간 합의 통해 교육에 대 한.

본 모델의 HF와 CP 부상 연구에 대 한 심사는 높은 처리량 각 막 상피 세포의 개발에 우리의 방법 및 결과 설명 우리. 우리는 또한 HF 부상에 대 한 기본 siRNA 화면에서 결과 제시. TIC 상해 연구를 위한 HTS 모델의 개발에 많은 도전을 했다. 우리가 셀 문화 모델에 HF, HFA 또는 CP의 연구와 관련 된 문학에서 찾을 수 있는 방법은 작은 도움의 이었다. 불 소 이온에 대부분 생체 외에서 연구 구강 세포를 포함 하 고 (대 한 몇 가지 예제 참조28,29) 나트륨 불 화물와 HF 또는 HFA를 활용. 체 외에 노출에 기관지 상피 세포의 CP 일부 방법론 Pesonen 그 외 여러분 에 의해 게시 되었습니다. 30. 궁극적으로, 우리 도전과 변수가이 유독 필요한 HTS 개발에서 연구에 관련 된의 대다수와 HF, HFA...

Toxicant 유도 눈 부상 화학 빠르게 상당한 조직 손상을 입힐 잠재력을가지고 있기 때문에 진정한 눈 비상 이다. 불행 하 게도, 아니 특정 치료제가이 부상 치료 존재에 toxicant 유발 각 막 부상에 대 한 치료 일반적으로 지원만 있습니다. 현재 치료 전략 일반적인 주로 같은 윤활제, 항생제, 국 소 치료 요법을 포함 하 고 cycloplegics 뒤에 소염제 (예를 들어, 스테로이드) 한 번 각 막1 epithelialized 다시 있다 ,2. 최고의 현재 치료 치료 옵션을 사용할에 불구 하 고 장기적인 예 후는 일반적으로 진보적인 각 막 흐려 및 neovascularization2,3가난.
동물 모델 화학 독성을 조사 하 고 상해의 메커니즘을 이해를 전통적으로 사용 되어 왔습니다. 그러나, 동물 연구는 시간이 소모 되 고 비싸다. 노력을 줄이기 위해 동물 실험도 있다. 예를 들어 유럽 연합에 도달 법안 (EC 1907/2006)를 동물 실험을 줄이기 위한 규정 있다. 규정 회사 동물 테스트 및 동물에 제안 된 테스트를 수행 하기 전에 유럽 화학 제품 기관에서 승인을 얻는 피하기 위하여 데이터 공유 요구 사항이 포함 됩니다. 규정에 따라 동물 실험 최후의 수단 이어야 한다. 또한 단계적으로 동물에서 화장품의 테스트 유럽 화장품 규정 (EC 1223/2009)이 있다. 동물 연구를 실시 하는 경우 그들이 3Rs의 원칙에 의해 인도 된다 (구체화, 감소, 및 교체), 더 자비 롭 동물 연구를 수행, 사용, 동물의 수를 감소 및 비 동물 대안을 사용 하 여 프레임 워크를 제공 하는 가능한 경우. 이러한 이유로 독물학 분야는 독성의 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다 하 고 높은 처리량4에서 행 해질 수 있다 생체 외에서 분석을 채택 하고자 결정 했다. 이것은 기능 독극물 접근 어디 유독 전적으로 그들의 화학에 의해 보다는 오히려 그들의 기능에 의해 정의 됩니다. 단계는 또한, 기능 toxicogenomics 추구 특정 유전자 유독5의 효과에서 재생 역할을 이해 하. SiRNA 기술을 응용, 유독에 분자와 세포질 응답에 유전자 기능을 조사 하기 위해 화면 높은 처리량에 수행할 수 있습니다. siRNA는 19-25의 뉴클레오티드 긴 포스트 transcriptional 유전자 입을 통로 모든 포유류 세포6에 활용 하는 두 배 좌초 된 RNA 분자. 이 종합적으로 만들어지고 특정 유전자를 대상으로 설계 된. 셀에 도입 하는 경우는 siRNA 처리 되 고 한 가닥, 가이드 물가 RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC)에 로드 됩니다. siRNA는 mRNA 분자에 상호 보완적인 영역에 RISC 지시 하 고 있는 RISC 저하는 mRNA. 특정 유전자의 표정 감소 결과. 특정 유전자의 표현의 결과 감소는 toxicant에 세포질 응답에 그 유전자의 기능을 확인 toxicant 노출된 셀에 다음 공부 수 있습니다. 이러한 접근은 더욱 CYP1A17,8의 a h R-종속 유도 리 민감성의 메커니즘 이해 하 사용 되었습니다.
화학 테러 위험 평가 (CTRA) 목록 및 독성 산업용 화학 물질 (TIC) 목록 선택 화학 물질의 독성과 테러, 전쟁, 또는 산업 재해 이벤트9중 출시 될 가능성에 따라 항목별로 나 누이고 있다. 우리는 siRNA 높은 처리량 검열 (HTS) toxicogenomic 접근 테러 사건에서 사용의 높은 위험에 확인 된 CTRA 목록 이용과의 연구에 적용 하 고 있다. 화학 생물;에 있는 불리 한 효과 이해 하고자 하는 전통적인 독물학 그러나, 우리는 더 욕망의 치료제 및 치료 접근을 가능 하 게, 개발을 알리는 목적으로 상해의 메커니즘을 이해 하는 분자 치료 개발에 대 한 대상으로 지정할 수 있는 발견. 몇 가지 방법으로이 노력 유사한 높은 처리량 siRNA 심사 및 약 발견 과정10에서 셀 기반 분석의 사용을 고려할 수 있습니다. 주요 차이점은 우리의 접근 방식에 다소 가능성이 크다 toxicant 노출의 치료에 대 한 높은 치료 가치와 단일 대상 될 것 이다 반면 그 약물 발견 일반적으로 치료 발견에 대 한 단 수 목표를 추구 될 것 이다. 우리 예상 어떤 효과적인 치료 패러다임 toxicant 노출에 대 한 높은 치료 가치를 달성 하는 다각적인 접근 방식이 필요로 하 고 toxicogenomic 데이터 극히 효과적인 치료 패러다임을 알릴 수 있습니다.
벤치탑 자동화 실험실 제약 또는 생명 공학 산업 밖에 서 높은 처리량 방법론을 제공합니다. 우리 연구소에서 생체 외에서 연구 역사적으로 낮은 처리량11,,1213전통적인 분석 되었습니다. 지난 몇 년 동안, 우리의 실험실 벤치탑 높은 처리량 siRNA 심사를 수행 하기 위해 로봇의 사용에 전환 했다. 여기, 우리가 현재 눈 셀 모델의 세련미와 체 외에서 의 개발 수소 불 화물 (HF)와 chloropicrin (CP) 높은 처리량 siRNA 심사 적합에 대 한 노출 방법. 우리의 목표는 이러한 유독 응답에 세포질 상해를 조절 하는 분자를 식별 하는. 우리는 선택 하는 siRNA 도서관의 목표는 G 단백질 결합 된 수용 체, 단백질 kinases, 프로 테아 제, 가수분해, 이온 채널, 그리고 다른 잠재적으로 druggable 대상 포함 됩니다. HF와 CP 선정 됐다 연구에 대 한 상호 CTRA 목록 에이전트 산업 사고의 ToxNet 보고서를 통해 증기 노출9,14눈 상해의 가장 중대 한 모험을 선물 하는 그를 찾을 수 있습니다. WWI15에 최 루 가스 CP (Cl3CNO2화학식, CAS 번호 76-06-2) 원래 사용 했다. 현재16nematicide, 살 균 제, 살충제는 농업 fumigant 및 기능으로 사용 됩니다. 수소 불 화물 (HF)는 정유 및 화학 fluorination 유기 화합물17의 알을 포함 하 여 프로세스에서 사용 됩니다. HF (화학식 HF, CAS 번호 62778-11-4)는 가스 이지만 수성 형태로 소산 (HFA, CAS 번호 7664-39-3). 따라서, 우리가 우리의 셀 HFA를 사용 하 여 선출 노출 모델. SV40 큰 T 항 원 SV40 HCEC 연구에 대 한 선정 되었다 인간 각 막 상피 세포 선 불후. 세포질 상해에 관련 된 목표 세포 죽음과 선 동적인 응답에 반영 해야 하기 때문에 세포 생존 능력 및 염증 성 마커 IL-8 끝점으로 선정 됐다. 특히, 대상 toxicant 노출에서 보호 역할을 한다면, 세포 죽음 또는 염증 성 cytokine 생산 증가 한다 때 대상 식 siRNA에 의해 저해. 반대로 부정적인 역할을 하는 대상에 대 한 사실 것입니다. 또한, 만성 염증 후 노출, 및 세포 죽음 통로 있는 내정간섭에 임상 결과2,18이 향상 시킬 수 있습니다 각 막 병 리에 역할을 나타납니다.

<table><tbody><tr><td>Bravo 리퀴드 핸드링 플랫폼</td><td>, 애질런트 또는 동급</td><td>G5409A,</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 플레이트 셰이커</td><td>, 애질런트 또는 동급</td><td>옵션: 159</td><td></td></tr>, <tr><td>Bravo 96LT 일회용 팁 헤드</td><td>, 애질런트 또는 동급</td><td>옵션: 178</td>, <td>96채널 대형 팁 피펫팅 헤드 장치</td></tr>, <tr><td>Bravo 96ST 일회용 팁 헤드</td><td>, 애질런트 또는 동급</td><td>옵션: 177</td>, <td>96채널 소형 팁 피펫팅 헤드 유닛</td></tr><tr><td>Bravo 384ST 일회용 팁 헤드</td><td>Agilent 또는 동급</td><td>옵션 179</td><td>384 채널 소형 팁 피펫팅 헤드 유닛</td></tr><tr><td>Bravo 96 250 &mu; L 멸균 장벽 팁</td><td>Agilent 또는 동급</td><td>19477-022</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 384 30 &mu; L 멸균 장벽 팁</td><td>Agilent 또는 동급</td><td>19133-212</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 384 70 &mu; L 멸균 장벽 팁</td><td>Agilent 또는 동급</td><td>19133-212</td><td></td></tr><tr><td>EnSpire 멀티모드 플레이트 리더</td><td>Perkin Elmer 또는 동등</td><td>2300-0000</td><td>AlphaLISA 분석 검출기 고출력 레이저 여기</td></tr><tr><td>IL-8 (인간) AlphaLISA 검출 키트&nbsp;</td><td>Perkin Elmer 또는 동급</td>의 <td>AL224F</td>, <td>비세척 비드 기반 분석,</td></tr><tr><td>ProxiPlate-384 Plus, 흰색, 384-얕은 웰 마이크로플레이트</td>, <td>Perkin Elmer 또는</td><td>동급의 6008359</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine, RNAiMAX</td><td>, Invitrogen 또는 동급</td>의 <td>13778500</td>, <td>Transfection 시약</td></tr>, <tr><td>Opti-MEM, 1, Reduced Serum Medium</td><td>Invitrogen 또는 동급</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco 또는 동급</td>의 <td>12605010</td><td>세포 박리 용액</td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom</td><td>Essen Instruments 또는 동급</td>의 <td>ESSEN BIOSCI 4473</td><td>인큐베이터 탑재 자동 현미경</td></tr><tr><td>Chloropicrin</td><td>Trinity Manufacturing 또는 동급의</td><td>N/A</td><td>급성 독성 및 자극성</td></tr><tr><td>DMEM-F12 세포 배양 배지</td><td>Invitrogen 또는</td><td>동등한 11330-057</td><td>HEPES 함유</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Invitrogen 또는 이와 동등한</td><td>1891471</td><td></td></tr><tr><td>Human epidermal growth factor(세포 배양 등급)</td><td>Invitrogen 또는 이와 동등한</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 인슐린(세포 배양 등급)</td><td>Invitrogen 또는 동등한</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution(세포 배양 등급)</td><td>Invitrogen 또는 이와 동등한</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone (세포 배양 등급)</td> <td>시그마 또는 동등한</td><td>H0888-10G</td><td></td></tr><tr><td>포도당&nbsp; (세포 배양 등급)</td><td>시그마 또는 동급</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp; (세포 배양 등급)</td><td>Sigma 또는 동급</td>, <td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td>, <td>Dharmacon 또는 동급</td>, <td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>티아졸릴, 블루, 테트라졸륨 브로마이드</td><td>, Sigma 또는 동급</td>, <td>M5655</td><td>MTT 분석 기질</td></tr>, <tr><td>siRNA 완충액</td><td>, Thermo 또는 동급</td><td>B002000</td><td></td></tr><tr><td>96웰 세포 배양 플레이트</td>, <td>Corning 또는 동급</td><td>CLS3595</td><td></td></tr><tr><td>T150 세포 배양 플라스크</td><td>Corning 또는 동급</td><td>CLS430825</td><td></td></tr><tr><td>BSL-2 세포 배양 후드</td><td>Nuaire 또는 동급</td><td>NU-540</td><td></td></tr><tr><td>300 mL 로봇 저장 탱크</td><td>Thermo 또는 동급</td><td>12-565-572&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96개의 배플 자동화 저장소</td><td>Thermo 또는 동급</td><td>1064-15-8</td><td></td></tr><tr><td>500mL 멸균 일회용 보관 병</td><td>Corning 또는 동급</td><td>CLS430282</td><td></td></tr><tr><td>Microplate 히트 씰러</td><td>Thermo 또는 동급</td><td>AB-1443A</td><td></td></tr><tr><td>Microplate 열 밀봉 호일</td><td>Thermo 또는 동급</td><td>AB-0475</td><td></td></tr><tr><td>Cardamonin</td><td>Tocris 또는 동등한</td><td>2509</td><td>항염증제, 양성 대조군으로 사용</td></tr><tr><td>SKF 86002&nbsp;</td><td>Tocris 또는 이에 상응하는</td><td>2008</td><td>항염증제, 양성 대조군으로 사용</td></tr><tr><td></td><td>DMSO 시그마 또는 동급</td>의 <td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>48% 불화 수소산</td><td>시그마 또는 동급</td><td>339261</td><td>부식성 및 급성 독성</td></tr><tr><td>1000 &mu; L 단일 채널 피펫터</td><td>Rainin 또는 동급</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L 단일 채널 피펫터</td><td>Rainin 또는 이에 상응하는</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; L 단일 채널 피펫터</td><td>Rainin 또는 이에 상응하는</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu; L 12채널 피펫터</td><td>Rainin 또는 동급</td><td>17014497</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L 12채널 피펫터</td><td>Rainin 또는 동급</td><td>17013810</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; L 12채널 피펫터</td><td>Rainin 또는 동급</td><td>17013808</td><td></td></tr><tr><td>피펫터 팁 1000 &mu; L</td><td>Rainin 또는 동급</td><td>의 17002920</td><td></td></tr><tr><td>피펫터 팁 200 &mu; L</td><td>Rainin 또는 동급</td><td>의 17014294</td><td></td></tr><tr><td>피펫터 팁 20 &mu; L</td><td>Rainin 또는 동급</td><td>17002928</td><td></td></tr><tr><td>화학 흄 후드</td><td>Jamestown Metal Products</td><td>MHCO_229</td><td></td></tr><tr><td>384웰 시료 보관 플레이트</td><td>Thermo 또는 동급</td><td>262261</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma 또는 동급</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 코니컬 튜브</td><td>Thermo 또는 동급</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫 50 mL</td><td>Corning 또는 동급</td><td>07-200-576</td><td></td></tr><tr><td>혈청학적 피펫 25mL</td><td>Corning 또는 동급</td><td>07-200-575</td><td></td></tr><tr><td>혈청학적 피펫 10mL</td><td>Corning 또는 동급</td><td>07-200-574</td><td></td></tr><tr><td>혈청학적 피펫 5mL</td><td>Corning 또는 동급</td><td>07-200-573</td><td></td></tr><tr><td>SV40-HCEC 불멸화 인간 각막 상피 세포</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>이러한 세포는 상업적으로 이용 가능하지 않지만,</td></tr><tr><td>Sceptor Handheld Automated Cell Counter</td><td>Millipore 또는 GeneTitan</td><td></td> Multi-Channel (MC) Instrument Affymetrix 또는 동PHCC20060<td></td></tr><tr><td></td><td>급</td>의 <td>00-0372</td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix 24 및 96-array plates</td><td>Affymetrix 또는 동급의</td><td>901257; 901434</td><td></td></tr><tr><td>Draegger 논문에 인용된 연구자로부터 얻을 수 있습니다. tube HF</td><td>Draeger 또는 동급</td>의 <td>8103251</td><td></td></tr><tr><td>Draegger tube CP</td><td>Draeger 또는 동급</td><td>의 8103421</td><td></td></tr><tr><td>Draegger 펌프</td><td>Draeger 또는 동급</td>의 <td>6400000</td><td></td></tr><tr><td>Clear Plate seal,</td><td>Resesarch Products International 또는 동급</td><td>의</td> 202502 <td></td></tr><tr><td>시약 저장용기</td><td>VistaLab Technologies 또는 동급</td>의 <td>3054-1000</td><td></td></tr><tr><td>Xlfit</td><td>IDBS 또는 이에 상응하는</td><td>N/A</td><td>Excel 애드인으로 자동 곡선 피팅에 사용됨</td></tr></tbody></table>

chloropicrin 및 수소 불 화물 유발 각 막 상피 세포 상해에 대 한 높은 처리량 sirna 심사

High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury

Toxicant 유도 눈 부상 화학 빠르게 상당한 조직 손상을 입힐 잠재력을가지고 있기 때문에 진정한 눈 비상 이다. 아무 특정 치료제가이 부상 치료 존재 toxicant 유발 각 막 부상에 대 한 치료는 일반적으로 지원. 치료 및 노출에 대 한 관심에 치료제를 개발 하는 노력, 그것은이 상해의 분자 및 세포 메커니즘을 이해 하는 것이 중요 수. 있습니다 우리는 높은 처리량 작은 금지 RNA (siRNA) 심사의 활용 화학 각 막 상피 상해의 분자 메커니즘을 더 빠르게 명료를 도울 수 있는 중요 한 도구가 될 수 있습니다 제안 합니다. siRNA는 siRNA에 상 동을가지고 있는 19-25의 뉴클레오티드 긴 mRNA를 저하 하는 통로 입을 post-transcriptional 유전자를 활용 더블 좌초 RNA 분자는. 특정 유전자의 표현의 결과 감소는 toxicant에 세포질 응답에 그 유전자의 기능을 확인 toxicant 노출된 셀에 다음 공부 수 있습니다. 개발 및 체 외에 노출 모델 및 수소 불 화물 (HF) 및 chloropicrin (CP) 유도 눈 부상 (HTS)을 상영 하는 높은 처리량 방법의 유효성 검사는이 문서에 표시 됩니다. 하지만 우리는 이러한 두 가지 유독 선택, 우리의 방법 toxicant 노출 프로토콜에 사소한 수정 다른 유독의 연구에 적용 됩니다. SV40 큰 T 항 원 SV40 HCEC 연구에 대 한 선정 되었다 인간 각 막 상피 세포 선 불후. 세포 생존 능력 및 IL-8 생산 심사 프로토콜에서 끝점으로 선정 됐다. Toxicant 노출의 개발와 관련 된 몇 가지 과제 고 셀 문화 방법 HTS 연구에 대 한 적합 한 표시 됩니다. 이 유독 HTS 모델 설립 화학 눈 부상에 대 한 잠재적인 치료에 대 한 화면을 상해의 메커니즘을 이해 하기 더 연구에 대 한 수 있습니다.

노출 방법 개발
우리는 세련 하 고 HTS 연구에 사용 하기 위해 인간 각 막 상피 세포 선 SV40-HCEC의 적합성을 평가. SV40 HCEC SV 40 큰 T 항 원을 사용 하 여 불멸 하 게 했다 고 Dhanajay Pal23에서 선물 했다. 간결 하 게, 여기 제시 노출 방법론 개발에 탐구 하는 너무 많은 변수가 있었고 그래서, 우리가 생각 하는 연구 결과의 일부 샘플 더 광범위 하 게 적용 될 수 있습니다만 여러 이용과 제공 됩니다.
스파이크 또는 매체 교환에 의해 toxicant 노출
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높은 처리량 작은 금지 RNA 검사 화학 각 막 상피 상해의 분자 메커니즘을 더 빠르게 명료를 도울 수 있는 중요 한 도구입니다. 여기, 우리는 개발 및 노출 모델 및 각 막 상피 부상 수소 불 화물 그리고 chloropicrin 유도의 높은 처리량 검열 방법의 유효성 검사 제시.

Chloropicrin 및 수소 불 화물 유발 각 막 상피 세포 상해에 대 한 높은 처리량 SiRNA 심사

Toxicant-induced ocular injury is a true ocular emergency because chemicals have the potential to rapidly inflict significant tissue damage. Treatments ...

이 비디오는 독성 물질 손상의 각막 상피 세포 모델에서 고처리량 siRNA 스크리닝 방법을 보여줍니다. 고처리량 siRNA 스크리닝은 독성 물질에 대한 세포 반응의 경로와 조절자를 규명하는 비용 효율적이고 시간 효율적인 방법이기 때문에 이 작업이 중요합니다. 이 연구는 각막이 독성 물질에 어떻게 반응하는지에 대한 이해를 높이는 데 도움이 될 수 있습니다.일회용 배지 병에 밀리리터당 0.5마이크로그램의 하이드로코르티손을 함유한 예열 배지에 각막 상피 세포의 현탁액을 준비합니다. 병을 소용돌이쳐 세포가 고르게 매달려 있도록 한 다음 자동 액체 처리기의 오비탈 셰이커 네스트에 있는 저장소에 붓습니다. 셀 도금 공정 중에 37도 보온 플레이트에 셀 현탁액을 유지하십시오.자동화된 액체 처리기를 사용하여 96웰 플레이트의 웰당 70마이크로리터의 배지에서 웰당 1,000개의 세포 밀도로 플레이트에 세포를 추가합니다. 연구할 모든 siRNA 라이브러리 플레이트에 대해 최소 14개의 96웰 플레이트에 세포를 파딩합니다. Seeding 프로세스 중에 분당 100 사이클로 오비탈 쉐이커를 지속적으로 실행하고 모든 단계에서 초당 50마이크로리터의 피펫팅 속도를 사용합니다.첫 번째 플레이트를 파종하기 전에 자동 액체 처리기를 사용하여 세포 현탁액을 혼합합니다. 140마이크로리터의 세포 현탁액을 흡입하고 70마이크로리터를 두 세포 배양 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 모든 플레이트에 세포가 파종될 때까지 혼합 및 분주를 반복합니다.필요에 따라 세포 현탁액 저장소를 다시 채웁니다. 플레이트를 파종한 후 액체 처리기에서 플레이트를 제거하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포 배양 인큐베이터로 옮깁니다.다음 날 아침 세포 배양 인큐베이터에 있는 자동 이미징 시스템을 사용하여 모든 플레이트의 세포 밀도를 평가합니다. 15%에서 22% 사이의 합류 지점이 아닌 내부 웰이 있는 플레이트는 연구에서 제외합니다. siRNA 웰당 4개의 피코몰과 트랜스펙션 시약의 웰당 0.3마이크로리터를 시딩한 후 24시간 후에 세포를 다음과 같이 형질주입합니다.공급업체로부터 플레이트당 80개의 siRNA target을 포함하고 1열과 12열은 비어 있도록 구성된 siRNA 라이브러리 플레이트를 구입합니다. 제조업체의 지침에 따라 siRNA 버퍼로 siRNA 라이브러리 플레이트를 재구성하여 siRNA의 각 웰에 대해 마이크로리터당 2피코몰의 최종 농도를 만듭니다. 모든 단계에 대해 자동화된 액체 처리기와 초당 25마이크로리터의 피펫팅 속도를 사용하여 모든 transfection을 수행합니다.사전 구성된 팁 상자를 사용하여 형질 주입될 웰만 처리합니다. 라이브러리 플레이트의 위쪽 절반을 사용하여 상판 세트라고 하는 6개의 복제 플레이트 세트를 트랜스펙션합니다."라이브러리 플레이트의 아래쪽 절반을 사용하여 바닥 플레이트 세트라고 하는 6개의 복제 플레이트로 구성된 다른 세트를 트랜스펙션합니다."함께 12개의 플레이트는 전체 플레이트 세트를 구성합니다. 그리고 각 셀 플레이트에는 동일한 컨트롤 세트가 포함되어 있습니다. 모든 상단 및 하단 플레이트 세트가 library siRNA로 transfection된 후 negative pool siRNA가 있는 모든 플레이트의 B2 - B6 웰을 transfection합니다.또한 negative pool siRNA를 가진 library siRNA를 수신하지 않는 다른 두 플레이트의 wells B2를 B6로 transfection합니다. 이는 노출되지 않은 컨트롤로 사용됩니다. transfection mix를 추가한 후 4시간 동안 cell culture incubator에서 모든 cell plate를 배양하고 매시간 가볍게 두드려 혼합합니다.자동화된 액체 처리기를 사용하여 예열된 매체로 플레이트를 두 번 세척하고 PBS에서 1-5개를 희석한 다음 잘 예열된 매체당 100마이크로리터로 다시 공급합니다. 모든 단계에 초당 50마이크로리터의 피펫팅 속도를 사용하십시오. 웰 C2 - C6을 비형질 주입된 대조군으로 사용합니다.B7 - B11 웰 및 C7 - C11 웰을 transfection되지 않은 상태로 유지하여 독성 물질 노출에 대한 약물 및 차량 제어로 사용합니다.transfection 후 24시간이 지나면 자동 액체 처리기를 사용하여 플레이트를 다시 공급합니다. 모든 단계에 초당 50마이크로리터의 피펫팅 속도를 사용하십시오.각 우물에서 100마이크로리터를 흡입하고 폐기물 저장소에 버립니다. 잘 예열된 H-Cort.medium 당 100 마이크로리터로 각 우물을 다시 먹이십시오. 필요에 따라 폐기물 저장통을 비우십시오.필요에 따라 물통에 매체를 다시 채웁니다. transfection 2일 후 및 노출 2시간 전에 H-Cort에서 양성 대조군 Cardamonin의 62.5 마이크로몰 용액을 준비합니다. 매체를 만들고 8열 희석 저장소의 B열에 추가합니다.H-Cort. meduim에서 DMSO의 06.25% 용액을 준비하고 동일한 저장소의 C 행에 추가합니다. DMSO는 차량 제어로 사용됩니다.자동 액체 처리기를 사용하여 각 셀 플레이트의 웰 B7에서 B11 및 C7에서 C11까지 10마이크로리터의 매체를 제거하고 저장소의 G 및 H 행으로 폐기합니다. 사전 구성된 팁 박스를 사용하여 포지티브 및 차량 제어를 수신할 웰만 처리하고 모든 단계에 초당 50마이크로리터의 피펫팅 속도를 사용하십시오. 10마이크로리터의 양극 및 차량 제어 장치를 해당 우물로 옮기고 세 번 혼합합니다.이 세포 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. 모든 추가 세포 플레이트에 대해 이 단계를 반복합니다. 이중 니트릴 장갑, 실험실 가운, 일회용 폴리에틸렌 슬리브 보호대 및 보안경을 착용하고 화학 연기 후드에서 모든 화학 물질 노출 작업을 수행하십시오.불산과 접촉한 피펫 팁과 저장소, 그리고 2.5% 글루콘산칼슘이 함유된 액체 불산의 오염을 유해 폐기물 흐름에 폐기하기 전에 오염을 제거하십시오. 조사중인 각 라이브러리 플레이트에 대해 80 밀리리터의 예열 된 H-Cort에 288 마이크로 리터의 1 % 불산 (hydrofluoric acid)을 첨가하여 0.0036 % 불화 수소산 매체 용액을 준비합니다. 150ml 병에 담긴 미디엄.병을 휘젓고 묽은 불화수소산을 화학 흄 후드의 37도 인큐베이터에서 10분 동안 배양합니다. 불화수소산 매체 용액을 플레이트 워머의 시약 저장소에 추가합니다. 두 명의 기술자가 함께 작업하여 노출을 수행합니다.오른쪽에 있는 기술자에게 12채널 피펫터를 사용하여 세포 플레이트에서 세포 배양 배지를 제거한 다음 플레이트를 왼쪽에 있는 기술자에게 전달하도록 합니다. 왼쪽에 있는 기술자에게 불화수소산 매체 용액의 웰당 100마이크로리터를 추가하도록 합니다. 독성 물질에 노출될 모든 세포판에 대해 이 과정을 반복합니다.또한 불산 용액 대신 새로운 매체를 사용하여 노출되지 않은 제어 플레이트에 대해 이 과정을 반복합니다. 플레이트를 화학 흄 후드 인큐베이터에 20분 동안 넣은 다음 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다. 앞서 보여준 것처럼 모든 플레이트가 노출되고 세포 배양 인큐베이터로 되돌아간 후 positive control 추가 단계를 반복합니다.세포 배양 상층액을 수집하고 노출 후 24시간 동안 MTT 분석을 사용하여 세포 생존율을 평가합니다. 포도당 10g을 함유한 PBS에 0.5mg/mL MTT 기질 용액을 준비하고 37도까지 예열합니다. MTT 기질 용액을 자동 Liquid Handler의 저장소에 추가합니다.모든 단계에 초당 50마이크로리터의 피펫팅 속도를 사용하십시오. 분석할 웰만 처리하도록 팁 상자를 사전 구성합니다. 자동 액체 처리기를 사용하여 셀 플레이트의 내부 60웰에서 95마이크로리터의 배지를 흡입하고 2개의 384웰 저장 플레이트 각각에 42.5마이크로리터를 증착합니다.MTT 기질 용액을 웰당 100마이크로리터의 용액을 세포 플레이트에 즉시 첨가하고 세포 배양 인큐베이터에서 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 384웰 저장 플레이트를 밀봉하고 후속 분석을 위해 영하 80도에서 보관합니다. 모든 상단 및 하단 플레이트 세트와 노출되지 않은 관련 컨트롤에 대해 이 프로세스를 반복합니다.필요에 따라 MTT 기질 저장소를 다시 채웁니다. 원하는 경우 복제 사이에 팁을 재사용하되 MTT 기판 용액을 추가할 때와 플레이트 세트 간에 전환할 때 세척하십시오. 1시간 배양 후 자동 리퀴드 핸들러를 사용하여 각 세포 배양 플레이트의 내부 60웰에서 MTT 기질 용액을 제거하고 DMSO 웰당 100마이크로리터로 교체합니다.모든 단계에 초당 50마이크로리터의 피펫팅 속도를 사용하고, 분석할 웰만 처리하도록 팁 박스를 사전 구성합니다. 폐기물 저장소를 비우고 필요에 따라 DMSO 저장소를 다시 채웁니다. 접시 셰이커에 담긴 접시를 3분 동안 흔듭니다.플레이트 분광 광도계를 사용하여 570 및 690 나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 570나노미터의 흡광도에서 690나노미터의 배경 흡광도를 빼고, 노출되지 않은 플레이트의 각 대조군에 대한 값의 평균을 구합니다. 각 대상에 대한 흡광도 값을 노출되지 않은 대조군의 평균 흡광도 값으로 나누어 생존율 백분율을 계산합니다.노출되지 않은 평균 네거티브 풀을 사용하여 모든 대상에 대한 세포 생존율 백분율을 계산합니다. 제조업체의 지침에 따라 세척이 필요 없는 비드 기반 분석을 사용하여 세포 배양 상등액에서 IL-8의 농도를 측정합니다. 샘플과 표준물질을 수용할 수 있는 분석 플레이트 레이아웃을 생성합니다.마이너스 384 냉동고에서 80웰 보관 플레이트를 제거하고 실온에서 해동합니다. 플레이트를 간단히 원심분리하여 웰 바닥에서 샘플을 수집합니다. anti-IL-8 acceptor beads와 biotinylated antibody를 검은색 384-well 보관 플레이트에 추가합니다.분석 플레이트 레이아웃에 따라 샘플 및 표준 곡선에 사용하도록 지정된 웰에 비드-항체 혼합물을 추가합니다. 354마이크로몰의 염화나트륨을 함유하는 배지에서 표준물질을 재구성합니다. 표준 곡선을 2배 연속 희석하고 다른 검은색 384웰 보관 플레이트에 3배 추가합니다.자동화된 액체 처리기를 사용하여 분석을 수행합니다. 사전 구성된 팁 상자를 사용하여 분석 플레이트 레이아웃에 따라 웰을 처리합니다. 모든 단계에 초당 50마이크로리터의 피펫팅 속도를 사용하십시오.8마이크로리터의 수용체 비드-항체 혼합물을 흰색 384웰 얕은 웰 분석 플레이트로 옮깁니다. 비드-항체 혼합물을 분석 플레이트 레이아웃에 따라 샘플 및 표준 곡선에 사용하도록 지정된 웰에 추가합니다. 그런 다음 표준 곡선을 얕은 우물 분석 플레이트의 적절한 웰로 옮깁니다.다음으로, 얕은 저장통에 3.54몰의 염화나트륨 용액을 준비합니다. 4.5마이크로리터의 염화나트륨 용액을 검은색 384웰 저장 플레이트의 샘플로 옮겨 표준 곡선과 일치하도록 샘플의 염 농도를 조정합니다. 30마이크로리터 혼합 부피를 사용하여 샘플을 세 번 혼합한 다음 분석 플레이트 레이아웃에 따라 2마이크로리터의 샘플을 흰색 얕은 우물 분석 플레이트로 옮깁니다.실온에서 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다. 검은색 384웰 보관 플레이트에 보조 비드를 추가합니다. 분석 플레이트 레이아웃에 따라 샘플과 표준 곡선에 사용하도록 지정된 웰에 비드를 추가합니다.10마이크로리터의 2차 비드를 분석 플레이트 레이아웃에 따라 표준 곡선 또는 샘플을 받을 흰색 384웰 얕은 웰 분석 플레이트의 웰로 이동합니다. 각 접시 사이의 팁을 씻으십시오. 실온에서 어두운 곳에서 한 시간 더 배양합니다.투명 플레이트 씰로 분석 플레이트를 밀봉하고 비드 기반 분석과 호환되는 플레이트 리더를 사용하여 스캔합니다. 플레이트와 검출기 사이의 거리는 0.2mm, 스캔에는 180밀리초의 여기 시간, 550밀리초의 측정 시간을 사용합니다. IL-8 분석의 원시 데이터를 스프레드시트로 가져옵니다.IL-8 분석의 표준 곡선에 대해 자동 곡선 피팅을 사용한 다음 각 샘플에 대해 원시 데이터를 밀리리터당 피코그램으로 변환합니다. 각 목표값에 대한 6번의 반복실험의 평균을 계산합니다. 그런 다음 SSMD 값을 계산하고 노출된 음의 대조군을 기준으로 변화를 접습니다.각 타겟에 대해 x축을 따라 접힘 변화를 보여주고 y축을 따라 SSMD를 보여주는 이중 손전등 플롯에 데이터를 표시합니다. 결론적으로, 우리는 독성 물질에 의한 안구 손상에 대한 고처리량 스크리닝 연구에 적합한 방법과 배양 조건을 개발했습니다. 우리는 불산(hydrofluoric acid) 손상 모델에서 siRNA 라이브러리의 1차 스크리닝을 완료함으로써 이러한 방법의 유용성을 입증했습니다.고처리량 게놈 데이터 세트는 특정 유전자가 부상이나 질병에서 수행하는 역할을 이해하는 데 크게 기여할 수 있으며, 이는 체외 또는 생체 내 연구에 보다 효율적으로 후속 조치에 집중하는 데 도움이 될 수 있습니다.

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연구

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