Chloropicrin 및 수소 불 화물 유발 각 막 상피 세포 상해에 대 한 높은 처리량 SiRNA 심사

이 비디오는 독성 물질 손상의 각막 상피 세포 모델에서 고처리량 siRNA 스크리닝 방법을 보여줍니다. 고처리량 siRNA 스크리닝은 독성 물질에 대한 세포 반응의 경로와 조절자를 규명하는 비용 효율적이고 시간 효율적인 방법이기 때문에 이 작업이 중요합니다. 이 연구는 각막이 독성 물질에 어떻게 반응하는지에 대한 이해를 높이는 데 도움이 될 수 있습니다.

일회용 배지 병에 밀리리터당 0.5마이크로그램의 하이드로코르티손을 함유한 예열 배지에 각막 상피 세포의 현탁액을 준비합니다. 병을 소용돌이쳐 세포가 고르게 매달려 있도록 한 다음 자동 액체 처리기의 오비탈 셰이커 네스트에 있는 저장소에 붓습니다. 셀 도금 공정 중에 37도 보온 플레이트에 셀 현탁액을 유지하십시오.

자동화된 액체 처리기를 사용하여 96웰 플레이트의 웰당 70마이크로리터의 배지에서 웰당 1,000개의 세포 밀도로 플레이트에 세포를 추가합니다. 연구할 모든 siRNA 라이브러리 플레이트에 대해 최소 14개의 96웰 플레이트에 세포를 파딩합니다. Seeding 프로세스 중에 분당 100 사이클로 오비탈 쉐이커를 지속적으로 실행하고 모든 단계에서 초당 50마이크로리터의 피펫팅 속도를 사용합니다.

첫 번째 플레이트를 파종하기 전에 자동 액체 처리기를 사용하여 세포 현탁액을 혼합합니다. 140마이크로리터의 세포 현탁액을 흡입하고 70마이크로리터를 두 세포 배양 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 모든 플레이트에 세포가 파종될 때까지 혼합 및 분주를 반복합니다.

필요에 따라 세포 현탁액 저장소를 다시 채웁니다. 플레이트를 파종한 후 액체 처리기에서 플레이트를 제거하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포 배양 인큐베이터로 옮깁니다.

다음 날 아침 세포 배양 인큐베이터에 있는 자동 이미징 시스템을 사용하여 모든 플레이트의 세포 밀도를 평가합니다. 15%에서 22% 사이의 합류 지점이 아닌 내부 웰이 있는 플레이트는 연구에서 제외합니다. siRNA 웰당 4개의 피코몰과 트랜스펙션 시약의 웰당 0.3마이크로리터를 시딩한 후 24시간 후에 세포를 다음과 같이 형질주입합니다.

공급업체로부터 플레이트당 80개의 siRNA target을 포함하고 1열과 12열은 비어 있도록 구성된 siRNA 라이브러리 플레이트를 구입합니다. 제조업체의 지침에 따라 siRNA 버퍼로 siRNA 라이브러리 플레이트를 재구성하여 siRNA의 각 웰에 대해 마이크로리터당 2피코몰의 최종 농도를 만듭니다. 모든 단계에 대해 자동화된 액체 처리기와 초당 25마이크로리터의 피펫팅 속도를 사용하여 모든 transfection을 수행합니다.

사전 구성된 팁 상자를 사용하여 형질 주입될 웰만 처리합니다. 라이브러리 플레이트의 위쪽 절반을 사용하여 상판 세트라고 하는 6개의 복제 플레이트 세트를 트랜스펙션합니다."라이브러리 플레이트의 아래쪽 절반을 사용하여 바닥 플레이트 세트라고 하는 6개의 복제 플레이트로 구성된 다른 세트를 트랜스펙션합니다."함께 12개의 플레이트는 전체 플레이트 세트를 구성합니다. 그리고 각 셀 플레이트에는 동일한 컨트롤 세트가 포함되어 있습니다. 모든 상단 및 하단 플레이트 세트가 library siRNA로 transfection된 후 negative pool siRNA가 있는 모든 플레이트의 B2 - B6 웰을 transfection합니다.

또한 negative pool siRNA를 가진 library siRNA를 수신하지 않는 다른 두 플레이트의 wells B2를 B6로 transfection합니다. 이는 노출되지 않은 컨트롤로 사용됩니다. transfection mix를 추가한 후 4시간 동안 cell culture incubator에서 모든 cell plate를 배양하고 매시간 가볍게 두드려 혼합합니다.

자동화된 액체 처리기를 사용하여 예열된 매체로 플레이트를 두 번 세척하고 PBS에서 1-5개를 희석한 다음 잘 예열된 매체당 100마이크로리터로 다시 공급합니다. 모든 단계에 초당 50마이크로리터의 피펫팅 속도를 사용하십시오. 웰 C2 - C6을 비형질 주입된 대조군으로 사용합니다.

B7 - B11 웰 및 C7 - C11 웰을 transfection되지 않은 상태로 유지하여 독성 물질 노출에 대한 약물 및 차량 제어로 사용합니다.transfection 후 24시간이 지나면 자동 액체 처리기를 사용하여 플레이트를 다시 공급합니다. 모든 단계에 초당 50마이크로리터의 피펫팅 속도를 사용하십시오.

각 우물에서 100마이크로리터를 흡입하고 폐기물 저장소에 버립니다. 잘 예열된 H-Cort.medium 당 100 마이크로리터로 각 우물을 다시 먹이십시오. 필요에 따라 폐기물 저장통을 비우십시오.

필요에 따라 물통에 매체를 다시 채웁니다. transfection 2일 후 및 노출 2시간 전에 H-Cort에서 양성 대조군 Cardamonin의 62.5 마이크로몰 용액을 준비합니다. 매체를 만들고 8열 희석 저장소의 B열에 추가합니다.

H-Cort. meduim에서 DMSO의 06.25% 용액을 준비하고 동일한 저장소의 C 행에 추가합니다. DMSO는 차량 제어로 사용됩니다.

자동 액체 처리기를 사용하여 각 셀 플레이트의 웰 B7에서 B11 및 C7에서 C11까지 10마이크로리터의 매체를 제거하고 저장소의 G 및 H 행으로 폐기합니다. 사전 구성된 팁 박스를 사용하여 포지티브 및 차량 제어를 수신할 웰만 처리하고 모든 단계에 초당 50마이크로리터의 피펫팅 속도를 사용하십시오. 10마이크로리터의 양극 및 차량 제어 장치를 해당 우물로 옮기고 세 번 혼합합니다.

이 세포 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. 모든 추가 세포 플레이트에 대해 이 단계를 반복합니다. 이중 니트릴 장갑, 실험실 가운, 일회용 폴리에틸렌 슬리브 보호대 및 보안경을 착용하고 화학 연기 후드에서 모든 화학 물질 노출 작업을 수행하십시오.

불산과 접촉한 피펫 팁과 저장소, 그리고 2.5% 글루콘산칼슘이 함유된 액체 불산의 오염을 유해 폐기물 흐름에 폐기하기 전에 오염을 제거하십시오. 조사중인 각 라이브러리 플레이트에 대해 80 밀리리터의 예열 된 H-Cort에 288 마이크로 리터의 1 % 불산 (hydrofluoric acid)을 첨가하여 0.0036 % 불화 수소산 매체 용액을 준비합니다. 150ml 병에 담긴 미디엄.

병을 휘젓고 묽은 불화수소산을 화학 흄 후드의 37도 인큐베이터에서 10분 동안 배양합니다. 불화수소산 매체 용액을 플레이트 워머의 시약 저장소에 추가합니다. 두 명의 기술자가 함께 작업하여 노출을 수행합니다.

오른쪽에 있는 기술자에게 12채널 피펫터를 사용하여 세포 플레이트에서 세포 배양 배지를 제거한 다음 플레이트를 왼쪽에 있는 기술자에게 전달하도록 합니다. 왼쪽에 있는 기술자에게 불화수소산 매체 용액의 웰당 100마이크로리터를 추가하도록 합니다. 독성 물질에 노출될 모든 세포판에 대해 이 과정을 반복합니다.

또한 불산 용액 대신 새로운 매체를 사용하여 노출되지 않은 제어 플레이트에 대해 이 과정을 반복합니다. 플레이트를 화학 흄 후드 인큐베이터에 20분 동안 넣은 다음 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다. 앞서 보여준 것처럼 모든 플레이트가 노출되고 세포 배양 인큐베이터로 되돌아간 후 positive control 추가 단계를 반복합니다.

세포 배양 상층액을 수집하고 노출 후 24시간 동안 MTT 분석을 사용하여 세포 생존율을 평가합니다. 포도당 10g을 함유한 PBS에 0.5mg/mL MTT 기질 용액을 준비하고 37도까지 예열합니다. MTT 기질 용액을 자동 Liquid Handler의 저장소에 추가합니다.

모든 단계에 초당 50마이크로리터의 피펫팅 속도를 사용하십시오. 분석할 웰만 처리하도록 팁 상자를 사전 구성합니다. 자동 액체 처리기를 사용하여 셀 플레이트의 내부 60웰에서 95마이크로리터의 배지를 흡입하고 2개의 384웰 저장 플레이트 각각에 42.5마이크로리터를 증착합니다.

MTT 기질 용액을 웰당 100마이크로리터의 용액을 세포 플레이트에 즉시 첨가하고 세포 배양 인큐베이터에서 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 384웰 저장 플레이트를 밀봉하고 후속 분석을 위해 영하 80도에서 보관합니다. 모든 상단 및 하단 플레이트 세트와 노출되지 않은 관련 컨트롤에 대해 이 프로세스를 반복합니다.

필요에 따라 MTT 기질 저장소를 다시 채웁니다. 원하는 경우 복제 사이에 팁을 재사용하되 MTT 기판 용액을 추가할 때와 플레이트 세트 간에 전환할 때 세척하십시오. 1시간 배양 후 자동 리퀴드 핸들러를 사용하여 각 세포 배양 플레이트의 내부 60웰에서 MTT 기질 용액을 제거하고 DMSO 웰당 100마이크로리터로 교체합니다.

모든 단계에 초당 50마이크로리터의 피펫팅 속도를 사용하고, 분석할 웰만 처리하도록 팁 박스를 사전 구성합니다. 폐기물 저장소를 비우고 필요에 따라 DMSO 저장소를 다시 채웁니다. 접시 셰이커에 담긴 접시를 3분 동안 흔듭니다.

플레이트 분광 광도계를 사용하여 570 및 690 나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 570나노미터의 흡광도에서 690나노미터의 배경 흡광도를 빼고, 노출되지 않은 플레이트의 각 대조군에 대한 값의 평균을 구합니다. 각 대상에 대한 흡광도 값을 노출되지 않은 대조군의 평균 흡광도 값으로 나누어 생존율 백분율을 계산합니다.

노출되지 않은 평균 네거티브 풀을 사용하여 모든 대상에 대한 세포 생존율 백분율을 계산합니다. 제조업체의 지침에 따라 세척이 필요 없는 비드 기반 분석을 사용하여 세포 배양 상등액에서 IL-8의 농도를 측정합니다. 샘플과 표준물질을 수용할 수 있는 분석 플레이트 레이아웃을 생성합니다.

마이너스 384 냉동고에서 80웰 보관 플레이트를 제거하고 실온에서 해동합니다. 플레이트를 간단히 원심분리하여 웰 바닥에서 샘플을 수집합니다. anti-IL-8 acceptor beads와 biotinylated antibody를 검은색 384-well 보관 플레이트에 추가합니다.

분석 플레이트 레이아웃에 따라 샘플 및 표준 곡선에 사용하도록 지정된 웰에 비드-항체 혼합물을 추가합니다. 354마이크로몰의 염화나트륨을 함유하는 배지에서 표준물질을 재구성합니다. 표준 곡선을 2배 연속 희석하고 다른 검은색 384웰 보관 플레이트에 3배 추가합니다.

자동화된 액체 처리기를 사용하여 분석을 수행합니다. 사전 구성된 팁 상자를 사용하여 분석 플레이트 레이아웃에 따라 웰을 처리합니다. 모든 단계에 초당 50마이크로리터의 피펫팅 속도를 사용하십시오.

8마이크로리터의 수용체 비드-항체 혼합물을 흰색 384웰 얕은 웰 분석 플레이트로 옮깁니다. 비드-항체 혼합물을 분석 플레이트 레이아웃에 따라 샘플 및 표준 곡선에 사용하도록 지정된 웰에 추가합니다. 그런 다음 표준 곡선을 얕은 우물 분석 플레이트의 적절한 웰로 옮깁니다.

다음으로, 얕은 저장통에 3.54몰의 염화나트륨 용액을 준비합니다. 4.5마이크로리터의 염화나트륨 용액을 검은색 384웰 저장 플레이트의 샘플로 옮겨 표준 곡선과 일치하도록 샘플의 염 농도를 조정합니다. 30마이크로리터 혼합 부피를 사용하여 샘플을 세 번 혼합한 다음 분석 플레이트 레이아웃에 따라 2마이크로리터의 샘플을 흰색 얕은 우물 분석 플레이트로 옮깁니다.

실온에서 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다. 검은색 384웰 보관 플레이트에 보조 비드를 추가합니다. 분석 플레이트 레이아웃에 따라 샘플과 표준 곡선에 사용하도록 지정된 웰에 비드를 추가합니다.

10마이크로리터의 2차 비드를 분석 플레이트 레이아웃에 따라 표준 곡선 또는 샘플을 받을 흰색 384웰 얕은 웰 분석 플레이트의 웰로 이동합니다. 각 접시 사이의 팁을 씻으십시오. 실온에서 어두운 곳에서 한 시간 더 배양합니다.

투명 플레이트 씰로 분석 플레이트를 밀봉하고 비드 기반 분석과 호환되는 플레이트 리더를 사용하여 스캔합니다. 플레이트와 검출기 사이의 거리는 0.2mm, 스캔에는 180밀리초의 여기 시간, 550밀리초의 측정 시간을 사용합니다. IL-8 분석의 원시 데이터를 스프레드시트로 가져옵니다.

IL-8 분석의 표준 곡선에 대해 자동 곡선 피팅을 사용한 다음 각 샘플에 대해 원시 데이터를 밀리리터당 피코그램으로 변환합니다. 각 목표값에 대한 6번의 반복실험의 평균을 계산합니다. 그런 다음 SSMD 값을 계산하고 노출된 음의 대조군을 기준으로 변화를 접습니다.

각 타겟에 대해 x축을 따라 접힘 변화를 보여주고 y축을 따라 SSMD를 보여주는 이중 손전등 플롯에 데이터를 표시합니다. 결론적으로, 우리는 독성 물질에 의한 안구 손상에 대한 고처리량 스크리닝 연구에 적합한 방법과 배양 조건을 개발했습니다. 우리는 불산(hydrofluoric acid) 손상 모델에서 siRNA 라이브러리의 1차 스크리닝을 완료함으로써 이러한 방법의 유용성을 입증했습니다.

고처리량 게놈 데이터 세트는 특정 유전자가 부상이나 질병에서 수행하는 역할을 이해하는 데 크게 기여할 수 있으며, 이는 체외 또는 생체 내 연구에 보다 효율적으로 후속 조치에 집중하는 데 도움이 될 수 있습니다.