Name: 조직의 최소 금액을 사용 하 여 초파리의 Permeabilized 섬유에 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: 배우세요 고해상도 호흡측정법을 이용해 Drosophila 투명화 흉부에서 미토콘드리아 산소 소비량을 측정하는 방법을. 최소 조직으로 생리학적으로 더 관련성 높은 결과를 얻어 대사 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 NP 국립 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC, 발견 부여) 및 대학교 드 몽 튼에서 교부 금에 의해 투자 되었다. LHB 건강 연구 (CIHR), 뉴 브 런 즈 윅 혁신 재단 (NBIF) 및 대학교 드 몽 튼의 캐나다 연구소에서 자금 지원을 하 고 싶습니다. EHC의 작품은 캐나다, 뇌 캐나다, NSERC, 캐나다 유방암 재단, 뉴 브 런 즈 윅 혁신 재단, 뉴브런즈윅 건강 연구 재단의 알 츠 하이 사회와 대학교 드 몽 튼에 의해 지원 됩니다.

1. 시 약 준비
<ol><li>해 부 및 조직의 permeabilization에 대 한 다음 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>보존 솔루션 준비: 2.77 m m 케이크2EGTA, 7.23 m K m2EGTA, 5.77 m m 나2ATP, 6.56 m m MgCl2, 황소자리, 20 mM 15 mM 나2phosphocreatine, 이미 20 m m, 0.5 m m dithiothreitol, 그리고 50mm K-MES, pH 7.1 (저장 될 수 있다 -20 ° C).</li>
		<li>사포닌 솔루션 준비: 보존 솔루션의 1 mL에 사포닌의 5 밀리 그램 (신선한 매일 준비).</li>
	</ol>
</li>
	<li>호흡의 측정에 대 한 다음 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>호흡 매체 준비: 120 m m KCl, 5mm KH2포4, 3 mM HEPES, 1mm EGTA, 1 mM MgCl2및 0.2 %BSA (w/v), pH 7.2.</li>
		<li>기판, uncoupler, 억제제를 준비 합니다. H2O, 모든 기질을 녹이 고 에탄올 (malonate는 H2O 희석)를 제외 하 고 절대에 억제제로 서 uncoupler FCCP 해산. 기판으로 malonate ( 재료의 표참조)의 대부분을 무력화. 프로토콜에 주어진 모든 농도 2 mL 챔버 내부 최종 농도.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 준비와 고해상도 Respirometer의 교정.
<ol><li>챔버, 모자, 그리고 세 번 70% 에탄올과 세 번 증류수 respirometer의 마 개를 세척.</li>
	<li>제로 산소 농도에서 보정: 피펫으로 실에서 호흡 매체의 2.3 mL 10 밀리 그램의 나트륨 dithionite 추가. 챔버의 최대 볼륨은 2 mL, 비록 2.3 mL 챔버를 닫을 때 아무 기포 마 개에서 유지 하기 위해 추가 됩니다. 챔버는 마 개를 닫고 결과 산소 소비 속도와 제로 산소 농도에서 전극 10-20 분 보정에 대 한 산소 농도 측정 합니다.</li>
	<li>Distillated 물 챔버를 세척 하 고 10 분, 절대 에탄올에 품 어 다음 증류수로 씻어.</li>
	<li>공기 채도에서 보정: 피펫으로 실에서 호흡 매체의 2.3 mL는 stoppers, stoppers, 위에 초과 중간 발음 넣은 다음 공백 요소와 stoppers 리프트. 초과 호흡 매체는 챔버를 닫은 후 공기 방울의 존재를 피하기 위해 실 (2 mL 전체 볼륨)에서 pipetted입니다.</li>
	<li>한 시간, 산소 농도 (블루 추적) 250 주위 안정 될 때까지 45 분에 대 한 산소 소비량을 모니터링 24 ° c.에 nM</li>
</ol>3. 파리와 조직 Permeabilization의 해 부
<ol><li>얼음에 모든 단계를 수행 되었는지 확인 합니다.</li>
	<li>6 남성 파리 같은 스트레인의 anaesthetize, 같은 나이 (야생-타입 w1118, 15 일 cornmeal 매체에 먹이) 파리의 해 부를 촉진 하기 위하여 얼음에 같은 다이어트에 제기.</li>
	<li>Using 메스와 뾰족한 집게, 비행 근육을 포함 하는 직업적인만 계속 (머리 및 인체 제거) 파리를 해 부. 이 단계는 육안으로 할 수 있습니다. 뾰족한 집게와 결과 직업적인 처리 합니다.</li>
	<li>25 mm 페 트리 접시는 집게를 사용 하 여 차가운 보존 솔루션의 2 개 mL를 포함 하는 3 개의 해 부 직업적인 전송.</li>
	<li>뾰족한 집게는 직업적인은 집게의 끝을 삽입 하 여 기계적으로 직업적인을 permeabilize와 반복적으로 찢 어 떨어져 느슨하게 연결 된 네트워크를 조직.</li>
	<li>24-잘 접시에 두 개의 우물을 12.5 µ L의 사포닌 솔루션 및 사포닌의 62.5 µ g/mL의 최종 농도를 보존 솔루션의 1 mL 채우십시오. 호흡 매체의 1 mL로 두 개의 인접 한 우물을 채우십시오.</li>
	<li>뾰족한 집게 3 permeabilized 직업적인 희석된 사포닌 솔루션에 전송 하 고는 궤도 셰이 커, 얼음에 20 분 동안에 온화한 동요와 함께 품 어.</li>
	<li>후자의 부 화 후 씻어 내는 사포닌을 5 분 동안 얼음에 약한 동요와 함께 호흡 중간으로 가득 인접 한 우물에 섬유를 전송 합니다.</li>
</ol>4입니다. 건조 중량의 결정
<ol><li>흡수 성 표면에 permeabilized 직업적인 건조 하 고 3-4 회 뾰족한 집게를 사용 하 여 모든 습기가 제거 되도록 플립.</li>
	<li>3 직업적인을는 중량에 무게. Note 획득된 무게 미토 콘 드 리아 산소 소비 속도 정상화 하는 데 사용할 것입니다.</li>
	<li>얼음에 조직 호흡 매체의 한 방울에 즉시 전송 합니다.</li>
</ol>5. 산소 소비 속도 결정
<ol><li>respirometer의 챔버를 열고 (제거는 stoppers) 각 챔버에 10 mM pyruvate의와 malate의 2 mM를 추가.</li>
	<li>Permeabilized 조직 호흡 매체와 채워진 챔버에 직접 추가 합니다.</li>
	<li>마 개는 스페이서를 사용 하 여 교체 합니다.</li>
	<li>60 mL 주사기는 산소 탱크에서 직접 산소를 수집 하 고 조직을 통해 산소 유포 산소 소비를 제한 하지 것입니다 있는지 확인 하려면 각 챔버의 스 토퍼 모 세관을 통해 산소의 2 ~ 5 mL를 주입 합니다.</li>
	<li>해밀턴 주사기를 직업적인 챔버에 남아 있는지 확인 하려면 각 스 토퍼의 모 세관에 넣습니다.</li>
	<li>산소 농도 약 400 때 챔버를 완전히 닫습니다 nM, 공기 채도 위에 산소 레벨 달성 (약 160% 공기 포화) 약 실 내부.</li>
	<li>중지 하 고 약 실에서 공기 방울에 대 한 확인을 교 반기.</li>
	<li>조직 질량 특정 산소 소비 pmol O2 consumed.s-1.mg-1 조직의 표시 질량 (mg), 조직의 호흡 속도 정상화 이전 무게의 질량을 입력 합니다.</li>
	<li>일단 산소 소비 (빨간색 추적) 안정화는, 5mm ADP 해밀턴 주사기를 추가 합니다.</li>
	<li>각 주입 후 증류수, 70% 에탄올으로 주사기를 헹 구 고 다시 증류수.</li>
	<li>산소 소비는 다시 안정, 일단 5 µ L 시 토 크롬 c의 4 m m의 주사.</li>
	<li>ETS의 다른 단계에서 미토 콘 드리 아 산소 소비를 평가 하기 위해 다음 기판의 순차 주사 하십시오.<ol>
<li>2 M 프롤린의 5 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>1 M 호박의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>1 M 글리세롤-3-인산의 30 µ L를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.5-1의 단계에 의해 적정 방식에서 uncoupler FCCP 주입 최적 농도까지 µ M (1 m m 솔루션의 2 µ L)는에 도달, 즉, 금지 없이 가능한 높은 산소 소비를 달성 하기 위해 집중 (주의: 테이블 참조 재료의).</li>
	<li>전적으로 잔여 산소 소비 (ROX)을 측정 하기 위하여 ETS에 전자 플럭스를 억제 하기 위해 순차적으로 다음 억제제를 주입 다른 사람의 사이에서 oxygenase 반응 등 즉 비 호흡 반응:<ol>
<li>1 m m로 테 논의 1 µ L 추가 (주의: 재료의 표참조).</li>
		<li>5 µ L 2 M malonate의 추가 (주의: 재료의 표참조).</li>
		<li>5 mM antimycin A의 1 µ L 추가 (주의: 재료의 표참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>추가 하는데 0.2 m m와 0.5 m m TMPD 순차적으로 실로 복잡 한 4에 의해 산소 소비량을 측정 하는데부터 시작 합니다.</li>
	<li>추가 복잡 한 IV를 억제 하기 위해 나트륨 아 지 드의 20 mM (주의: 재료의 표참조).</li>
	<li>신호는 안정, 일단 챔버는 스페이서와 함께, 다시 순수한 산소의 2 개 mL를 주입 하 여 챔버 산소 개폐 실 때 농도 250-300 nmol.mL-1.</li>
	<li>10-15 분에 대 한 신호를 측정 하 고 계산 화학 배경, 즉, TMPD의 autoxidation 때문에 산소 소비.</li>
</ol>6. 청소는 Respirometer의
<ol><li>측정 후 증류수와 챔버를 한번 씻어 하 고 린스 70% 에탄올에 세 번 약 실.</li>
	<li>10 분에 억제제를 비활성화에 대 한 절대 에탄올에 품 어.</li>
	<li>증류수로 세 번 씻어, 약 실 70% 에탄올를 다음 사용률까지는 마 개 및 뚜껑 교체.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

이 연구에서는 초파리에서 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정 전에 샘플 준비 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 기간 및 필요한 개인의 수의 점에서 특히 미토 콘 드리 아 격리를 사용 하 여 프로토콜에 관련 된 다른 문제를 극복 하기 위해 개발 되었다. 일반적으로 조직의 여러 개인에 게 서 얻은 큰 금액을 요구 하는 미토 콘 드 리아 격리 사용 대신,이 실험에서 몇 초파리의 직업적인 permeabilized 근육 섬유에 수행 됩니다. 이 프로토콜에만 3 개인 최적의 결과를 표시할 필요 합니다. 따라서, 다양 한 시간 포인트에서 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정으로 동기화 하는 데 같은 나이의 같은 섹스의 작은 그룹을 더 달성 가능 하다.
첫째, 그것은 같은 나이, 성별, 스트레인의 초파리를 사용 하는 것이 중요 하 고 결과 (그림 6), 낮은 분포도를 동일한 조건에서 제기 호흡 나이, 성별, 유전자 형, 그리고 파리의 다이어트와 함께 변경할...

과일 파리, 초파리 melanogaster 사용 되었습니다 모델 생물으로 서 유전자 연구에 대 한1세기 이상. 이 유 기체의 연구만 sex-linked 상속2, 돌연변이 속도3, 신경 시스템의 개발 및 세포 운명 결정4에 대 한 중요 한 기초 지식을 주도 하지 않은 하지만 또한 최근 등장으로 Alzheimer와 Parkinson의5,6등 여러 질병에 고유의 메커니즘을 연구를 유용한 도구입니다. 또한, 그들은 시간의 짧은 기간 동안 많은 수에서 올려질 수 있고 짧은 수명으로 노화 과정을 공부 하는 인기 있는 모델입니다. 그들은 또한 인간의 장기는 심장, oenocytes (hepatocyte 같은 셀), 지방 기관 (간 및 백색 지방 조직으로 유사 하 게 작동), 인슐린 생산 세포 (췌 장 β 세포에 해당), 동종 구조를가지고 뿐만 아니라 hemolymph 수송 대사 산물 (척추 동물의 혈액과 유사)7. 또한, 중앙 통로 중간 대사 (인슐린/인슐린 같은 성장 인자와 같은 신호 통로 및 대상의 Rapamycin-토르 경로 포함)의 높은 보존된7있습니다. 이러한 이유로 초파리 최근 당뇨병8등 인간의 신진 대사 질환에 병 적인 조건에서 특히 신진 대사를 제어 하는 기본 메커니즘을 설명 하기 위해 개발 되었습니다. 물질 대사의 주요 구성 요소는 mitochondrion 여러 경로 통합 하 고 생활의 가장 중요 한 생물 학적 기능 중 하나를 수행 하는 (OXPHOS) 산화 인 산화 과정을 통해 ATP 생산. 생물의 물질 대사에 있는 그들의 중추적인 역할을 고려 하면 그것은 놀라운 미토 콘 드 리아 장애 루 경화 증 뿐만 아니라 파 킨 슨 병9 , Alzheimer 질병10, 같은 많은 질병에 관련 된 11 , 12. 그들은 또한 노화 과정의 근본적인 결정 요인. 실제로, 그들은 산화 손상11높은 농도에서 세포에 해로운 수 셀 반응성 산소 종 (선생님)의 주요 생산자. 노화 또한 미토 콘 드리 아 속16의 손상 뿐만 아니라 손상 된 돌연변이 미토 콘 드리 아 DNA13, mitophagy 장애14,15 의 축적에 연결 되었습니다. 미토 콘 드리 아는 또한 세포의 항상성의 주요 결정 요인 그들은 풍부 또는 부족 macronutrients17,18의 여러 세포 기능을 조정 하려면 다른 기질을 이용할 수 있다.
실제로, 다른 영양소 (탄수화물, 지질 및 단백질) 다이어트에는 소화, 흡수와 세포에 수송. 그들은 다음, cytosol에 변화 그리고 파생된 기판 그들이 있는 줄이는 해당 하는 NADH와 FADH219를 생산 하는 미토 콘 드 리아 매트릭스로 이송 됩니다. 이러한 감소 등가물은 다음 전자 교통 시스템 (ETS)의 다른 효소 복합물에 의해 산화 된다. 이 단지는 복잡 한 같은 미토 콘 드리 아 내 막에 포함 된 복잡 한 제. 또한, 미토 콘 드리 아 글리세롤 3 인산 염 효소, 프롤린 효소 등 효소 다른 단지 ETS20,21에 전자의 항목에 대 한 대체 경로 나타냅니다. '대안'이 단지는 곤충, 특히 중요 한으로 종에 따라 그들은 적극적으로 참여할 수 호흡20,,2223,21증가 하. 전자 시스템을 먹이이 ETS에서 마지막 수락자 분자 산소까지는 ubiquinone 및 이후 복잡 한 iii, 그리고 복잡 한 4, 전송 됩니다. 이 전자 전송 안 미토 콘 드리 아 막 복잡 한 V (그림 1)에서 ATP를 ADP의 인 산화를 운전에 걸쳐 양성자 동기 힘을 생성 합니다. 세포의 항상성, 미토 콘 드리 아 대사 관련 모델 D. melanogaster 대표를 사용 하 여 공부에 미토 콘 드리 아의 역할의 다양 한 기본 메커니즘의 윤곽을 그리 다 수 있는 강력한 도구 pathophysiological 고려 조건 또는 셀룰러 및 환경 스트레스. 그러나 의외로, 소수의 연구만 실제로 측정 초파리24,,2526에서 미토 콘 드리 아 호흡. 실제로, 미토 콘 드 리아 산소 소비를 평가 하는 것을 목표로 실험 미토 콘 드리 아의 격리가 필요 합니다. 다른 미토 콘 드리 아 기능 (예: 선생님 생산 또는 미토 콘 드 리아 효율27,28의 표식으로 P/O 비율)의 측정에 대 한 유리, 이러한 격리는 일반적으로 오히려 다량 필요 조직의 여러 개인24,29에서. 조직과 개인의 높은 금액에 대 한이 요구는 중요 한 제한 요소, 특히 모든 개인이 같은 나이 이어야 한다 고려 하 고 가급적 실험에 대 한 동일한 성의 다른 시간에 호흡 측정을 만들기 최상의 힘 드는 포인트. 또한, 미토 콘 드 리아 격리 미토 콘 드리 아 대사를 경 세 하는 기본적인 기계 장치에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다, 하는 동안 미토 콘 드리 아를 격리 하는 데 사용 하는 방법 복제 하기 어려움 등 여러 단점을가지고 미토 콘 드리 아 네트워크, 그리고 미토 콘 드리 아 구조와 기능29,,3031의 변경의.
이 연구의 목적은 최소한의 양의 아주 몇몇 개인에서 조직만을 사용 하 여 초파리에 미토 콘 드리 아 산소 소비량을 측정 하는 강력한 프로토콜을 제시 하는 것입니다. 이 프로토콜의 미토 콘 드리 아 산소 소비에서 제자리에 고해상도 respirometry32,33, 와 함께에서 permeabilized 근육 섬유29 초파리 직업적인에서를 사용 하 여 측정 구성 34 , 35.이 메서드는 또한 추가적인 장점 때문에 셀의 다른 구성 요소와 상호 작용으로 잘으로 미토 콘 드리 아의 구조와 기능에 더 보존 permeabilized 고전적인 미토 콘 드 리아 격리 방법에 비해 섬유29,,3136,이 접근을 더 순수 관련 시키는. 이 프로토콜, 미토 콘 드 리아 기능 수 있습니다 정확 하 게 평가 초파리의 3 개의 직업적인 ETS의 몇 가지 다른 단계에서 산소 소비의 결심을 허용 하는 기판으로 고해상도 respirometry를 사용 하 여. 따라서,이 프로토콜은 초파리 모델을 활용 하 여 많은 환경 또는 병 태 생리 조건에서 대사를 제어 하는 기본 메커니즘에 대 한 주요 질문에 답변을 도울 수 있었다.
하는 ETS의 몇 가지 다른 단계에서 산소 소비량을 측정 하 고 어떻게 다른 기판 평가 호흡, 다른 기판 (그림 1), uncoupler을 그리고 억제제 사용된30 의 permeabilization 후에 조직입니다. 특히, 다른 기판의 순차적 추가 자극 하는 ETS의 다른 단지를 통해 전자의 항목을 수행 됩니다. uncoupler 생성 시안 화물 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), 비 결합 호흡을 측정 하기 위해 최적의 농도에 추가, 즉, phosphorylating 비 호흡 극대 산소 소비를 자극. I, II, 및 III 다음 비 ETS 산화 반응으로 인해 잔여 산소 소비를 모니터링을 수행 하는 단지의 순차적 임무 N, N, N의 주입에 의해 복잡 한 IV 최대한 호흡 능력을 평가 하는 마지막으로,', N-Tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD)는 인공 전자 업체, 그리고 하는데. 그것은 그것 이기 때문에 파리는 발생 하는 온도 실험 24 °C에서 실시 하는 것을 주의 하는 것이 중요.

<table><tbody><tr><td>고해상도 호흡기 측정기 Oxygraph O2K</td><td>Oroboros Instruments, 인스브루크, 오스트리아</td><td>10022-02</td><td>스타트업 O2K 호흡계 키트 &nbsp;</td></tr><tr><td>O2K-적정 세트&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments, 인스브루크, 오스트리아</td><td>20820-03</td><td>다양한 볼륨의 Hamilton 주사기 &nbsp;</td></tr><tr><td>Datlab 소프트웨어</td><td>Oroboros Instruments, 인스브루크, 오스트리아</td><td>20700</td><td>데이터 수집 및 분석용 소프트웨어 &nbsp;</td></tr><tr><td>세밀한 팁이 있는 항자성 펜치</td><td>VWR</td><td>82027-400</td><td> &nbsp;</td></tr><tr><td>Secura225D-1S-DQE</td><td>Sartorius AG, Goettingen, Germany</td><td></td><td>Semi-micro balance (여러 회사에서 배포)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster 야생형 w1118</td><td>Bloomington Drosophila 재고 센터, IN, USA</td><td></td><<td>br/> 저장 조건: 24 &deg; C</td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜 -비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -< > N , N, N &prime; , N 프라임 테트라 아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>EGTA 보관 조건 : RT</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td>주의 : 금속 부식성, 급성 독성, 피부 부식, 심각한 눈 손상, 급성 수생 독성. 저장 조건: RT</td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td> 저장 조건: RT</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td> 저장 조건: -20 &deg; C</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td> 저장 조건: RT</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td> 저장 조건: RT</td></tr><tr><td>Na2Phosphocreatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td> 저장 조건: -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td> 저장 조건: RT</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td> 저장 조건: 2-8 &deg; C</td></tr><tr><td>MES 수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td> 보관 조건:</td></tr><tr><td>퀼라야 껍질에서 추출한 RT 사포닌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7900</td><td>Saponin 보관 조건: RT 용액 준비: 보존 용액 1mL에 5mg. 매일 신선하게 준비하십시오.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td> 저장 조건: RT</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td> 저장 조건: RT</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td> 저장 조건: RT</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05470</td><td> 저장 조건: 2-8 &deg; C</td></tr><tr><td>Na2S2O4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>157953 디티오나이트나트륨. 주의: 자체 발열 물질 및 혼합물, 급성 독성, 급성 수생 독소 만성 수생 독성. 저장 조건: RT</td></tr><tr><td>나트륨 피루브산</td><td>시그마-알드리치</td><td>P2256</td><td>피루브산 저장 조건: 2-8 &deg; C 용액 준비: MilliQ 물에서. 매일 신선하게 준비하십시오.</td></tr><tr><td>L-(-)-말산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td>Malate 보관 조건: RT 용액 준비: MilliQ 물에서. KOH로 중화하고 -20°C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>아데노신 5'-디포스페이트 모노칼륨 염 수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>A5285</td><td>ADP 저장 조건: -20 &deg; C 용액 준비: MilliQ 물에서. KOH로 중화하고 -80°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>말의 심장에서 추출한 사이토크롬 c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td>사이토크롬 c 저장 조건: -20 &deg; C 용액 준비: MilliQ 물에서. -20 &deg;C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>L-프롤린</td><td>시그마-알드리치</td><td>P0380</td><td>프롤린<브르/> 보관 조건: RT 용액 준비: MilliQ 물에서. -20 &deg;C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>나트륨 숙시 네이트 이염 기성 육수 화물</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>S2378</td><td>숙시 네이트 < / > 보관 조건 : RT 용액 준비 : MilliQ 물에서. HCl로 중화하고 -20°C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>sn-글리세롤 3-인산 비스(시클로헥실암모늄) 염</td><td>시그마-알드리치</td><td>G7886</td><td>글리세롤-3-인산 저장 조건: -20 &deg; C 용액 준비: MilliQ 물에서. HCl로 중화하고 -80°C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>C2920</td>, <td>FCCP. 주의 : 급성 독성, 피부 민감성, 만성 수생 독성. 보관 조건 : RT 용액 준비 : 절대 에탄올. -20°C의 유리병에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>로테논</td><td>시그마-알드리치</td><td>R8875</td><td>주의: 급성 독성, 피부 자극성, 눈 자극성, 특정 표적 장기 독성(호흡 시스템), 급성 수생 독성, 만성 수생 독성. 용액 준비: 절대 에탄올. -20°C의 어두운 바이알에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>말론산</td><td>시그마-알드리치</td><td>M1296</td><td>말로네이트. 주의: 급성 독성, 심각한 눈 손상. 보관 조건: RT 용액 준비: MilliQ 물에. KOH로 무력화하세요. 매일 신선하게 준비하십시오.</td></tr><tr><td>Streptomyces sp의 안티마이신 A.</td><td>시그마-알드리치</td><td>A8674</td><td>안티마이신 A. 주의: 급성 독성, 급성 수생 독성, 만성 수생 독성. 저장 조건: -20 &deg; C 용액 준비: 절대 에탄올. -20 &deg;C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7394</td><td>TMPD 저장 조건: RT 용액 준비: MilliQ 물에서. 어두운 유리병에 보관하십시오. -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>(+)-나트륨 L-아스코르브산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>A4034</td><td>아스코르브산염 보관 조건: RT 용액 준비: MilliQ 물에서. 어두운 유리병에 보관하십시오. -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>아지드화나트륨. 주의: 급성 독성(구강 및 피부), 특정 표적 장기 독성(뇌), 수생 독성, 만성 수생 독성.&nbsp; 용액 준비: MilliQ 물에서. -20 &deg;C에서 보관하십시오.</td></tr></tbody></table>

조직의 최소 금액을 사용 하 여 초파리의 permeabilized 섬유에 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

과일 파리, 초파리 melanogaster, 물질 대사 연구에 대 한 새로운 모델을 나타냅니다. 실제로, 초파리 인간의 장기에 동종 구조, 높은 보존된 대사 경로가지고 있고 시간의 짧은 기간에 다른 근본적인 메커니즘의 연구를 수 있는 비교적 짧은 수명을. 그러나 그것은,, 그 세포 신진 대사, 미토 콘 드리 아 호흡에 필수적인 메커니즘 중 하나는 되어 철저 하 게 조사 하지이 모델에 놀라운. 초파리에서 미토 콘 드리 아 호흡의 측정 일반적으로 개인의 매우 많은 수를 요구 하 고 얻은 결과 매우 재현할 수 있기 때문에 가능성이 높습니다. 여기, 조직 초파리에서의 최소한의 금액을 사용 하 여 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 정확한 측정을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 직업적인 해 부 이며 모두 기계적으로 날카로운 집게와 화학적 사포닌, 교차 하는 세포 막, 미토 콘 드리 아 호흡을 조절 하는 다른 화합물을 수 있도록 permeabilized. Permeabilization, 후 프로토콜 여러 억제제에는 uncoupler에 그들의 응답에 뿐만 아니라 다른 기판 산화 전자 교통 시스템 (ETS)의 다른 단지의 용량을 평가 하기 위해 수행 됩니다. 이 메서드는 미토 콘 드리 아 아직 다른 세포질 구성 요소와 상호 작용 하기 때문에 미토 콘 드 리아 형태 보존 더 순수 관련으로 미토 콘 드 리아 격리를 사용 하 여 방법에 비해 많은 장점을 제공 합니다. 또한, 샘플 준비는 빠르게, 그리고 얻은 결과 매우 재현. 미토 콘 드리 아 호흡의 평가와 물질 대사 연구에 대 한 모델 초파리의 장점을 결합 하 여 새로운 통찰력 공개, 될 수 있는 중요 한 특히 때 파리 발생 하는 다른 환경 또는 병 태 생리 조건입니다.

위에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 미토 콘 드리 아 산소 소비의 대표 추적 그림 2에 제공 됩니다. Pyruvate와 malate permeabilized 근육 섬유 함께 챔버에 주입 이라고 CI 누출 호흡, 즉, 복잡 한 ETS의은 의해 자극 하는 경우는 NADH 생산 pyruvate와 통해 malate의 산화는 tricarboxylic 산 주기 (CI)입니다. 이 호흡 속도 동안 미토 콘 드 리아 산소 주로 ATP synthase 활성화 (누출)30때 미토 콘 드리 아를, intermembrane 공간에서 교차 하는 양성자 양성자 누출, 즉에 대 한 보상 유지 됩니다. ADP, ATP synthase 활성화 하며 전자 전송 때 I (CI-OXPHOS), ATP에 ADP의 동시 인 산화와 복잡 한 4 인 미토 콘 드 리아 산소 소비를 증가...

이 논문에서 초파리의 permeabilized 직업적인의 고해상도 respirometry를 사용 하 여 산소 소비량을 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 조직의 고전적인 미토 콘 드 리아 격리 기술에 비해 최소한의 금액을 요구 하 고 얻은 결과 더 순수 관련.

조직의 최소 금액을 사용 하 여 초파리의 Permeabilized 섬유에 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

이 절차의 전반적인 목표는 고해상도 호흡계를 사용하여 일반적인 초파리인 Drosophila Melanogaster의 미토콘드리아 호흡을 평가하는 것입니다. 이것은 먼저 초파리를 해부하여 흉부를 수집함으로써 달성됩니다. 그런 다음 비행 근육을 포함하는 흉곽을 날카로운 집게로 기계적으로 조심스럽게 투과화하고 사포닌으로 배양하여 추가 투과화를 위해 배양합니다. 그런 다음 토라시아는 호흡계의 챔버로 옮겨지고 미토콘드리아 산소 소비량은 다양한 기질, 언커플러 및 억제제의 조합으로 측정됩니다. 안녕하세요, 저는 Chlo입니다.

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연구

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Biochemistry

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미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 mitochondrial 투과 전환 기공 개구의 측정을위한 spectrofluorometric 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 검정은 미토콘드리아 칼슘의 동시 측정을...

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 투과율 전환 기공 영업의 다중 매개 변수 측정

제시된 방법은 최소한의 마우스 골격근에서 분리된 미토콘드리아를 사용하여 마이크로플레이트 기반 호흡 측정 분석 모음의 수행을 위한 단계별 지침을 제공합니다. 이러한 분석은 일반적으로 사용되는 동물 모델에서 미토콘드리아 산소 소비량의 기계론적 변화/적응을 측정할 수 있습니다.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아 격리 사용

고해상도 호흡율은 미토콘드리아의 산소 소비를 결정하는 데 사용된다. 이것은 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 '(I-IV) 호흡 속도, 최대 미토콘드리아 전자 전달계 용량 및 미토콘드리아 외막 무결성을 결정하기위한 간단한 기술이다.

고해상도 호흡율은 투과성이 그대로 세포에서 미토콘드리아 기능을 평가하는

미토콘드리아 기능의 조절 메커니즘에 대한 철저한 이해를 위해서는 미토콘드리아 구조-기능 관계에 대한 분석이 필요합니다. 살아 있고 고정된 초파리 난소에서 미토콘드리아 구조와 기능을 연구하는 구체적인 방법이 이 논문에 설명되어 있고 시연됩니다.

에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 연구 초파리 난소

선물이 산소 소비와 초파리 melanogaster 애벌레와 성인 두뇌에 있는 세포 외 산성화를 측정 하기 위한 프로토콜. 신진 대사 분석기는 적응 하 고 최적화 된 프로토콜 활용 됩니다. 마이크로 조직 억제는이 프로토콜의 중요 한 구성 요소 설계 하 고이 분석에 그들의 사용을 위해 특히 창조 되었다.

초파리 melanogaster Larval 및 성인 두뇌의 변화 분석

미토 콘 드리 아 호흡은 중요 organismal 생존; 따라서, 산소 소비 속도 미토 콘 드리 아 건강의 훌륭한 지표 이다. 이 프로토콜에 기저 측정 하는 상업적으로 사용할 수 있는 respirometer 사용 하 여 설명 하 고 최대 산소 소비 속도에 라이브, 그대로, 그리고 자유롭게 운동 꼬마 선 충.

그대로 꼬마 선 충 에 산소 소비 속도의 측정

형광 센서에 결합된 고분해능 호흡법은 미토콘드리아 산소 소비량과 반응성 산소 종(ROS) 생성을 결정합니다. 본 프로토콜은 투과화된 좌골 신경에서 미토콘드리아 호흡률 및 ROS 생산을 평가하는 기술을 기술한다.

고해상도 호흡 측정법에 의한 좌골 신경의 미토콘드리아 기능 평가

전기량 호흡 측정법은 작은 유기체의 신진대사율을 측정하는 데 이상적입니다. 본 연구에서 Drosophila melanogaster에 대해 적응시켰을 때, 측정된O2 소비량은 이전 연구에서 야생형 D. melanogaster에 대해 보고된 범위 내에 있었습니다. 더 작고 덜 활동적인 CASK 돌연변이의 플라이당 O2 소비량은 야생형보다 현저히 낮았습니다.

전기량 미세호흡계를 사용한 초파리 멜라노가스터의O2 소비량 측정

여기서는 PINK1B9-null 돌연변이 초파리의 생체 에너지를 분석하기 위한 고분해능 호흡 측정 프로토콜을 제시합니다. 이 분석법은 SUIT(Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration) 프로토콜을 사용합니다.

고분해능 호흡 측정법을 사용한 초파리 멜라노가스터 PINK1B9-Null 돌연변이의 미토콘드리아 기능 분석

이 논문은 지질-근위 환경에서 다양한 파트너 인자와 함께 in vitro에서 일체형 막 단백질의 상호 작용 및 어셈블리를 평가하는 방법을 설명합니다.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성 체외

배우세요 고해상도 호흡측정법을 이용해 Drosophila 투명화 흉부에서 미토콘드리아 산소 소비량을 측정하는 방법을. 최소 조직으로 생리학적으로 더 관련성 높은 결과를 얻어 대사 연구에 활용할 수 있습니다.

조직의 최소 금액을 사용 하 여 초파리의 Permeabilized 섬유에 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정

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