Name: 척수의 유전으로 정의 된 신경에 있는 Adeno 관련 바이러스 중재 Transgene 식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 배우세요 척수 내 rAAV 주사를 통해 유전적으로 정의된 척수 뉴런을 조작하는 방법을. 이 기술은 통각 회로 연구와 특정 뉴런 하위유형의 기능 분석에 활용됩니다.

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우리는 마 지 못해이 일을 지원 하기 위한 한스 울 리 히 Zeilhofer를 감사 합니다. 헨드릭 Wildner 올가 Mayenfisch 재단에 의해 지원 되었다. 우리는 Lmx1b 항 체에 대 한 카르멘 Birchmeier 감사합니다.

<ol><li>Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+downunder%3A+an+update+from+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition downunder: an update from the spinal cord.</a> Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).</li>
<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).</li>
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<li>Foster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation%2C+silencing%2C+and+activation+establish+glycinergic+dorsal+horn+neurons+as+key+components+of+a+spinal+gate+for+pain+and+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch.</a> Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Francois, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brainstem-Spinal+Cord+Inhibitory+Circuit+for+Mechanical+Pain+Modulation+by+GABA+and+Enkephalins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins.</a> Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).</li>
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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+local+and+descending+inputs+for+primary+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons.</a> J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).</li>
<li>Haenraets, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+nociceptive+circuit+analysis+with+recombinant+adeno-associated+viruses%3A+the+impact+of+serotypes+and+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters.</a> J Neurochem. , (2017).</li>
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<li>Wildner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analysis+of+Ptf1a-+and+Ascl1-deficient+mice+reveals+new+markers+for+distinct+dorsal+horn+interneuron+populations+contributing+to+nociceptive+reflex+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity.</a> J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).</li>
<li>Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+injection+of+a+viral+vector+for+conditional+gene+manipulation+in+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord.</a> J Vis Exp. (73), e50313(2013).</li>
<li>Kohro, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+minimally-invasive+method+for+microinjection+into+the+mouse+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn.</a> Sci Rep. 5, 14306(2015).</li>
<li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gate+control+of+mechanical+itch+by+a+subpopulation+of+spinal+cord+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons.</a> Science. 350 (6260), 550-554 (2015).</li>
<li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+spinal+circuit+for+light+touch+and+fine+motor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control.</a> Cell. 160 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+spinal+circuits+transmitting+and+gating+mechanical+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain.</a> Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).</li>
<li>Gutierrez-Mecinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preprotachykinin+A+is+expressed+by+a+distinct+population+of+excitatory+neurons+in+the+mouse+superficial+spinal+dorsal+horn+including+cells+that+respond+to+noxious+and+pruritic+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli.</a> Pain. 158 (3), 440-456 (2017).</li>
<li>Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptic+boundaries+in+roof+plate+and+choroid+plexus+identified+by+intersectional+gene+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation.</a> Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).</li>
<li>Kim, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+genetically+defined+neurons+to+behavior+through+a+broadly+applicable+silencing+allele%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele.</a> Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).</li>
<li>Kim, J. C., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fate-mapping+approaches%3A+new+means+to+explore+the+embryonic+origins+of+the+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus.</a> Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

Intraspinal 주입 AAVs의 강력한 기술 연구 실험실에서 척추 세포 높은 시간적 및 공간 솔루션의 분석을 사용 될 수 있습니다. 이 프로토콜에는 세 가지 주요 척추 세그먼트는 hindlimb 그들의 주변 축 삭을 확장 하는 감각 뉴런에 의해 innervated 변환 수 있습니다. 3 개의 세그먼트를 시험 강력 하 고 재현할 수 행동 데이터를 생성 합니다. 그것은 또한 하나의 intraspinal 주입 후 가능한 보다 큰 감각 영역의 테스트 수 있습니다. 예를 들어 동일한 사출 정권 발 테스트 허용 (폰 Frey, 하 그 리브스, 등)와 허벅지 (피부 주사, 메카노 리셉터 자극), 해결 될 수 있는 감각 modalities 확대.
중요 한 단계:
강력한 형태학과 행동 데이터를 얻기 위해와 유물을 피하에 대 한 중요 한 몇 가지 단계가 있습니다. 바이러스 성 벡터의 디자인 및 발...

등 쪽 척수 주변 신체와 뇌 사이의 정보 교환을 위해 근본적 이다. 열, 감기, 같은 감각 자극, 만지거나 유해 자극 척수의 등 쪽 뿔의 신경 세포에이 정보를 전달 전문된 주변 신경에 의해 감지 됩니다. 여기, 억제 및 흥분 성의 수의 복잡 한 네트워크 변조 하 고 결국 척추 프로젝션 뉴런 supraspinal 통해 릴레이 감각 정보 사이트1,2. 척추에 의해 실시 계산 인터-프로젝션 뉴런 감각 정보, 정보 억제 또는 릴레이 강도에 따라서 결정 문 및. 변화 억제와 흥분, 밸런스 변경된 등 감각 자극의 통합에 과민 증 또는 용어인 (일반적으로 비-고통 스러운 자극 후 고통 스러운 감각) 등 감각 장애를 일으킬 수 있습니다. 이러한 변화는 다양 한 만성 통증의 근본 원인을 상태3,4수 생각 된다. 따라서, 척추 회로 감각 처리에 높은 중요성의 따라서 생물체의 환경 및 자기 인식. 최근 출현 및 분자, 유전자의 조합 및 유전으로 확인 된 척추 신경 부분 모집단의 정확한 조작 하도록 하는 수술 기법, 과학자 들은 이제 이해 하기 시작 기본 척추 회로 고유 감각 modalities의 처리를 담당 합니다.
야생-타입 또는 유전자 변형 쥐에 rAAV의 intraspinal 주입 크게 기여한 조작, 분석, 및 척추 신경5,6,7, 의 특정 하위 집합의 기능 이해 8 , 9 , 10 , 11.이 기술은 마커 단백질의 배달을 허용 (GFP 등 / GFP 융해 단백질), 기자 단백질 (예: GCaMP), 또는 effector 단백질 (예: 세균 독 소, channelrhodopsin, 또는 pharmacogenetic 수용 체)는 공간 척추 신경에 제한 된 방식 으로입니다. Cre recombinase 척추 신경의 특정 하위 집합에서을 표현 하는 유전자 변형 쥐로 Cre 종속 rAAVs의 로컬 주입 각각 신경 인구의 특정 분석을 허용 한다. 우리는 라벨, ablate, 억제 또는 척추 glycinergic 뉴런을 보여주는 그들은 척추 게이트 통증 제어의 필수적인 부분입니다 및 전송7을 렵 게 활성화에이 기술을 채용 했습니다. 이 실험에서 intraspinal 주입 Cre 종속 rAAV GlyT2::Cre 쥐 요 추 척수 신경 세포 glycinergic의 선택적 조작 사용할 수 있습니다. 따라서, glycinergic 신경 동물의 생존에 대 한 중요 한 포함 하는 supraspinal 회로의 동시 조작 피할 수 있습니다.
RAAVs의 intraspinal 주사 주입의 사이트에 감염 제한, 하는 동안 로컬 뉴런에서 뿐만 아니라 axonal 예측을 통해 사출 사이트에 연결 하는 신경 세포에 바이러스 성 변환 발생할 수 있습니다. 후자는 자주 사용 한다 특정 핵은 뇌에서 신경 입력을 제공 하는 추적 CNS 영역에. 그러나 Axonal 예측의 감염,, 수도 있습니다 혼동 요인의 정의 된 인구는 특정 사이트에서 공부 한다. 이러한 문제를 해결 하기 위해 우리가 최근에 AAV serotypes serotypes 및 발기인 최소화 또는 최대화 역행 변환 하는 데 사용할 수 있는 식별 식 카세트의 포괄적인 분석을 실시 했습니다. 척추 회로에서이 특정 연구의 맥락에서 우리 retrogradely transduce 지 루트 신경 절 (DRG), rostral ventromedial 모 수 (호), 및 somatosensory 피 질 뉴런에 다른 serotypes 및 발기인의 능력 분석 12.이 프로토콜에서 설명 하는 기술을 사용할 수 있습니다 따라서 척추 신경 주사 사이트에서 분석 하거나 투영 신경 척수의 삽입 된 사이트에 입력을 제공 하는 분석. 여기에 설명 된 프로토콜에서 요 추 척수의 왼쪽에 rAAV의 3 개의 주사 3 허리 세그먼트 (L3-L5)에서 뉴런의 변환 수 있도록 수행 됩니다. L3-L5 세그먼트는 사출 사이트에 hindlimb 동측에서 감각 입력의 대부분을 받습니다. 시연 L3-L5 유전자 레이블이 뉴런의 기능 조작 이다 강력한 행동 변화를 연상 하기에 충분 따라서 유전자 레이블이 신경 하위의 회로 기능에 대 한 기능 증거를 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micropipette 끌어당기는 사람: DMZ-Universal-Electrode-Puller</td><td>Zeitz</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>마취 장치: Oxymat3 산소 발생기</td><td>Weinmann</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>마취 장치: VIP 3000 수의학 기화기</td><td>Midmark</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>열 매트: Mio Star Thermocare 100</td><td>Migros</td><td></td><td></td>717614700000</tr><tr><td>전기 면도기</td><td>Philips</td><td>BT9290</td><td></td></tr><tr><td>수술용 현미경(OPMI pico)</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>소동물 입체 기구</td><td>Kopf</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Neurostar StereoDrive(옵션)</td><td>Neurostar</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>모델 51690 Cunningham 마우스 척추 어댑터</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-4811</td><td></td></tr><tr><td>PHD 울트라 주사기 펌프와 나노마이트</td><td>하버드 장치</td><td>70-3601</td><td></td></tr><tr><td>해밀턴 701 RN 10 &mu; l 유리 마이크로 리터 주사기</td><td>해밀턴</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>해밀턴 탈착식 바늘 (RN) 압축 피팅 1mm</td><td>해밀턴</td><td>55750-01</td><td></td></tr><tr><td>미세 치과 드릴링 장치 : Osada 성공 40</td><td>Osada</td><td>OS-40</td><td></td></tr><tr><td>구형 커터, 0.5mm</td><td>Busch</td><td>12001005B</td><td></td></tr><tr><td>전자 폰 프레이 마취계</td><td>IITC</td><td>23905</td><td></td></tr><tr><td>유연한 폰 프레이 헤어</td><td>IITC</td><td>#7</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 파스칼 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>0.8 NA &times; 20 Plan-apochromat objective</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>1.3 NA &times; 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Surgical Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle #4, 13cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Adson 집게, 1 x 2 이빨, 12cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson rongeurs, 곡선형, 0.7mm 컵</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #2 laminectomy forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar 바늘 홀더, 톱니형, 8.5mm 클램프 길이</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</strong</td></tr><tr><td>>소모품 및 화학</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thin-wall glass capillary, 1mm 외경</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW 100-3</td><td></td></tr><tr><td>주사기(1, 5 및 20ml)</td><td>B. Braun</td><td>(9166917V, 4606051V, 4606205V)</td><td></td></tr><tr><td>26G 경사진 바늘</td><td>B. Braun</td><td>4665457</td><td></td></tr><tr><td>멸균 메스 블레이드</td><td>B. Braun</td><td>BB523</td><td></td></tr><tr><td>외과용 봉합사 Safil Quick+ 4/0, 흡수성</td><td>B. Braun</td><td>C1046220</td><td></td></tr><tr><td>외과용 봉합사 Premilene 5/0, 비흡수성</td><td>B. Braun</td><td>C0932191</td><td></td></tr><tr><td>멸균 PBS 또는 식염수(0.9%)</td><td></td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 70% (소독제)</td><td></td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>요오드 용액(예: Braunol)</td><td>B. Braun</td><td>18380</td><td></td></tr><tr><td>마취제(예: Attane isoflurane)</td><td>Provet</td><td>2222</td><td></td></tr><tr><td>Aldasorber</td><td>333526</td><td></td><td></td></tr><tr><td>진통제(예: 부프레노르핀: temgesic)</td><td>개별</td><td>GTIN: 7680419310018</td><td></td></tr><tr><td>안과 연고(예: vita-pos)</td><td>Pharma medica</td><td>GTIN: 4031626710635</td><td></td></tr><tr><td>면봉(예</td>: <td>출처)IVF Hartmann</td><td>1628100</td><td></td></tr><tr><td>안면 조직(예</td>: <td>출처)Uehlinger AG</td><td>2015.10018</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus microscope slides</td><td>ThermoScientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J mice (wildtype)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID:IMSR_JAX:000664</td><td></td></tr><tr><td>Rorbtm1.1(cre)Hze/J 마우스 (ROR&beta; Cre)</td><td>잭슨 연구소</td><td>RRID:IMSR_JAX:023526</td><td></td></tr><tr><td>Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J 마우스 (R26Tom)</td><td>잭슨 연구소</td><td>RRID: IMSR_JAX:007914</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Viral vectors</ 강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV1. 씨엠씨7. CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1. CAG.eGFP)</td><td>펜 벡터 코어</td><td>AV-1-PV1963</td><td></td></tr><tr><td>AAV1. CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1. CAG.flex.eGFP)</td><td>펜 벡터 코어</td><td>AV-1-ALL854</td><td></td></tr><tr><td>AAV1. CAG.flex.tdTomato.WPRE .bGH (AAV1. CAG.flex.tdTomato)</td><td>펜 벡터 코어</td><td>AV-1-ALL864</td><td></td></tr><tr><td>AAV1. EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1. EF1a.flex.DTA)</td><td>펜 벡터 코어</td><td>커스텀 프로덕션</td><td></td></tr><tr><td>AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi))</td><td>펜 벡터 코어</td><td>커스텀 프로덕션</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Plasmids </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry</td><td>Addgene</td><td>44361</td><td></td></tr><tr><td>pAAV.EF1&alpha;. flex.hChR2(H134R)-eYFP</td><td>Addgene</td><td>20298</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Bacteria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MDS42</td><td>ScarabGenomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stbl3</td><td>ThermoScientific</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Quiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond PC 500</td><td>Machery & Nagel</td><td>740574</td><td></td></tr><tr><td>clozapine-N-oxide (CNO)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BBL-NS105-0025</td><td></td></tr><tr><td>클로로퀸 디포스페이트 염</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>히스타민</td><td>Sigma</td><td>H7125</td><td></td></tr><tr><td>Dapi</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>항체 (희석)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP (1:1000)</td><td>Molecular Probes</td><td>RRID:AB_221570</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-NeuN (1:3000)</td><td>Abcam</td><td>RRID:AB_10711153</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Pax2 (1 : 200)</td><td>R & D Systems</td><td>RRID:AB_10889828</td><td></td></tr><tr><td>기니피그 anti-Lmx1b (1 : 10 000)</td><td>Dr Carmen Birchmeier</td><td>Muller et al. 2002</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFAP (1 : 1000)</td><td>DakoCytomation</td><td>RRID:AB_10013382</td><td></td></tr><tr><td>당나귀에서 제기된 2차 항체 (1:800)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

척수의 유전으로 정의 된 신경에 있는 adeno 관련 바이러스 중재 transgene 식

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

척추 신경 부분 모집단의 선택적 조작 주로 두 가지 방법으로 달성 되었다: 1) Intersectional 유전학, 그것에 의하여 이중 또는 삼중 유전자 변형 쥐 기자 또는 이펙터의 선택적 식 달성 하기 위해 생성 됩니다 원하는 척추 인구에서 유전자 (예를 들어, Rosa26 소재 시에서). Cre 종속 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV); 2) intraspinal 주입 여기 선택의 기자 또는 이펙터 유전자에 대 한 코딩 Cre 종속 AAV 벡터는 Cre recombinase 원하는 신경 부분 모집단에 표현 하는 쥐의 척수에 주입 됩니다. 이 프로토콜 Cre 종속 rAAV 벡터를 생성 하는 방법을 설명 하 고 어떻게 신경 요 추 척수의 등 쪽 뿔에 transduce rAAVs와 L3-L5 세그먼트. 요 추 척추 세그먼트 L3-L5는 hindlimbs에서 감각 정보를 전송 하는 그 주변 감각 뉴런에 의해 innervated 있습니다, 자연 스러운 행동 및 감각 테스트 사출 쪽에 동측 hindlimb에 적용에 대 한 응답 수 있습니다. 감각 처리에 조작된 신경의 기능을 검사 하기 위해 분석. 우리는이 기술을 사용 하 여 유전자를 분석 하는 방법을의 예 정의 척추 신경의 하위 집합을 제공 합니다. Cre 유전자 변형 쥐 클래식 리포터 transgene 마우스 유도 식에 비해 바이러스 중재 transgene 식의 주요 장점은 다음과 같습니다: 1) 다른 Cre 종속 rAAVs 다양 한 기자 또는 effector 단백질 인코딩 될 수 있습니다 주입 한 Cre 유전자 변형 줄, 따라서 여러 여러 유전자 변형 마우스 라인을 만들 필요가 극복 했다. 2) intraspinal 주입 조작 Cre 표현 셀 주사 사이트를 주입 후 시간을 제한합니다. 주요 불리는: 1) 리포터 유전자 발현 rAAVs에서 더 많은 변수 이다. 2) 수술의 척추 신경 transduce 필요 합니다. 두 가지 방법 중 어떤은 더 적절 한 해결을 신경 인구 및 연구 질문에 따라 달라 집니다.

인코딩 마커 단백질 rAAV의 intraspinal 주입에 의해 얻을 수 있는 식 수준을 설명 하기 위해 우리는 먼저 AAV1를 주입. 야생-타입 마우스의 요 추 척수로 CAG.eGFP. 3 주사 간격을 약 1 m m 떨어져 생산 L5 요 추 척추 세그먼트 L3는 거의 지속적인 감염 (그림 1A-C). 척추 표면에서 300 µ m의 깊이에서 바이러스 주입 척수의 등 쪽 뿔에 셀의 주된 감염에 지도 한다. 그러나, 감염 된 세포 복 부 경적 (그림 1D)에서 또한 찾아낼 수 있었다. 다음, 목표 Cre 유전자 변형 마우스 Cre 종속 rAAV 주입 때 rAAV 중재 식에 차이 보여주는 것 이었다. 우리는 그러므로 Cre 종속 AAV1 주입. CAG.flex.eGFP GlyT2::Cre 유전자 변형 쥐의 척수에 벡터. 으로, 전에 eGFP...

Intraspinal 주입 recombinase 종속 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV)의 척수에서 모든 유전자 이라는 셀 형식을 조작 하 사용할 수 있습니다. 여기 우리가 transduce 요 추 척수의 등 쪽 뿔에 신경 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 조작된 신경 하위의 기능 심문 수 있습니다.

척수의 유전으로 정의 된 신경에 있는 Adeno 관련 바이러스 중재 Transgene 식

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

재조합 아데노 관련 바이러스의 척추 내 전달의 전반적인 목표는 등쪽 척수에서 유전적으로 정의된 뉴런의 조직학적 표지 및 기능적 조작을 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 다양한 통증 양상을 인식하는 데 어떤 신경 회로가 필요한지와 같은 통증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전적으로 표지된 뉴런을 특별히 제한되고 일시적으로 제어되는 방식으로 조작할 수 있다는 것입니다.마취된 쥐의 척추를 따라 촉진하여 가장 꼬리 갈비뼈 쌍을 찾습니다. 그런 다음 세로로 1.5-2.5cm 정도 피부를 자르고, 꼬리 부분부터 가장 꼬리가 있는 갈비뼈 쌍까지 자른다. 집게로 피부를 들어 올리고 가위로 아래 근육에서 분리합니다.수술 내내 노출된 조직을 멸균 0.9% 염화나트륨으로 촉촉하게 유지하십시오. 가는 집게와 작은 가위를 사용하여 정중선 바로 옆의 얇은 막질 층 옆을 절개하고 가시돌기에서 잘라냅니다. 여러 해부학적 랜드마크는 표적화할 올바른 척추를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.여기에서는 세 가지 대안에 대해 설명합니다. 척추를 따라 촉진합니다. 가장 꼬리 갈비뼈 쌍은 T13 척추 바로 위에 위치하며 엉덩이 높이의 골반 뼈는 L6 척추 수준에 있습니다.또는 피부를 꼬리 쪽으로 당겨 장골능을 노출시킵니다. 같은 수준에서, 눈에 보이는 tetetransverse ligaments의 가장 꼬리 쌍이 L6 척추 돌기에 합류합니다. 관심 있는 척추를 식별하기 위해 꼬리에서 꼬리 방향으로 거꾸로 세십시오.그렇지 않으면 척추 측면을 따라 힘줄이 가장 하얗고 가장 내측인 지점을 찾으십시오. T13 척추는 바로 주둥이에 있습니다. 요추 척수 분절 L4는 이 척추 내에 있습니다.다음으로, 동물을 말아 올린 조직의 쿠션 위에 놓고 정위 골격의 척추 클램프로 들어 올립니다. 클램프를 대상 척추에 인접하게 정렬합니다. 하나의 클램프를 제자리에 고정한 다음 두 번째 클램프를 고정하는 동안 Adson 집게로 척추를 잡습니다.대상 척추를 조심스럽게 눌러 적절한 클램핑을 확인합니다. 그런 다음 관심 척추 위의 척수 근육을 제거합니다. 먼저, 척추와 평행한 힘줄의 내측으로 절개를 만듭니다.그런 다음 목표 척추에 대한 수직 절개를 앞과 꼬리로 만듭니다. 다음으로, 롱거스를 사용하여 관심 척추 위의 척수 근육을 찢거나 잘라냅니다. 필요에 따라 집게를 사용하여 척추 또는 척추 내 공간의 경막 위에 남아 있는 조직을 제거합니다.이제 등쪽 혈관이 보이고 척수의 정중선을 표시합니다. 편측 주사의 경우 0.5mm 구형 커터가 장착된 고급 치과 드릴을 사용하여 척추의 목표 쪽 중앙에 매우 조심스럽게 구멍을 뚫어 부분 후판 절제술을 수행합니다. 척수를 노출시키기 위해 26게이지 베벨 바늘로 남아 있는 뼈 조각을 제거합니다.바늘을 사용하여 척추 내 공간의 경막을 천공하여 대상 척추까지 약 300미크론, 등쪽 혈관 측면으로 약 300미크론 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 뚫린 구멍 아래에 경막을 뚫습니다. 이 시점에서 뇌척수액이 구멍에서 빠져나와야 하고 척수가 약간 부풀어 올라야 합니다.먼저 유리 모세관을 마이크로리터 주사기에 장착하여 주입 주사기를 준비합니다. 단단하고 단단히 고정되도록 너트를 단단히 조입니다. 마이크로리터 주사기에 멸균 증류수를 채운 다음 플런저를 누릅니다.팁에서 물이 쉽게 배출되지 않으면 마이크로피펫이 막혔을 가능성이 있으므로 교체해야 합니다. 전자 제어식 마이크로인젝터에 연결된 마이크로매니퓰레이터에 주사기를 장착합니다. 그런 다음 마이크로 인젝터를 사용하여 약 1마이크로리터의 공기를 빨아들여 물과 바이러스를 분리합니다.다음으로, 2.5마이크로리터의 희석된 바이러스 용액 방울을 파라핀 필름 조각에 피펫으로 주입합니다. 스테로택시 프레임을 사용하여 마이크로피펫의 끝을 액적 안으로 조심스럽게 옮기고 마이크로피펫 안으로 끌어올립니다. 그런 다음 팁에서 바이러스 용액 한 방울이 나올 때까지 분배를 누릅니다.주사기를 집어넣고 펜을 사용하여 마이크로피펫에 스케일을 표시하여 분주량을 모니터링합니다. 입정계 팔을 사용하여 마이크로피펫의 끝을 경막의 구멍 중 하나 위로 움직인 다음 노출된 척수 표면에 약간의 함몰이 나타날 때까지 아래로 움푹 패입니다. 척추 등쪽 뿔에 주사를 목표로 하려면 팁을 100미크론 단위로 500미크론 깊이까지 아래로 이동한 다음 200미크론 위로 이동하여 조직의 기계적 안정화를 허용합니다.팁의 최종 깊이는 300미크론입니다. 분당 50나노리터의 주입 속도로 300나노리터를 주입하도록 펌프를 프로그래밍한 후 시작 버튼을 눌러 주입을 시작합니다. 주입이 완료된 후 마이크로피펫의 스케일을 확인하여 바이러스 수치가 떨어졌는지 확인합니다.압력이 평형을 이룰 수 있도록 마이크로피펫을 3분 더 제자리에 둡니다. 3분 후 마이크로피펫을 천천히 집어넣은 다음 다른 두 주사 부위에 대해 절차를 반복합니다. 마지막 주입 후 척추 클램프와 마우스 아래의 쿠션을 제거합니다.단절된 바늘로 절개층을 닫고 흡수성 봉합사로 표재성 조직층을 봉합하고 비흡수성 봉합사로 피부를 봉합합니다. 봉합된 상처에 요오드 소독제를 바릅니다. 마취를 종료하고 동물이 회복될 때까지 열 매트 위에 그대로 두었다가 집 우리로 되돌려 보냅니다.주사 부위의 척추 조직은 실험이 끝날 때 검사해야 합니다. 이는 성공적인 주입 및 형질주입을 확인하고 수술로 인한 과도한 조직 손상을 배제하는 데 필요합니다. 재조합 AAV의 척추 내 주사로 얻을 수 있는 발현 수준을 설명하기 위해, eGFP 형광 단백질을 암호화하는 바이러스를 야생형 마우스의 요추 척수에 주입했습니다.약 1mm 간격으로 세 차례 주사를 맞았을 때, 요추 분절 L3에서 L5까지 거의 연속적인 감염이 발생했다. 척추 표면에서 300미크론 깊이에서 바이러스를 주입하면 척수 등쪽 뿔에 있는 세포가 우세하게 감염됩니다. 그러나 감염된 세포는 복부 뿔에서도 발견될 수 있습니다. eGFP를 발현하는 cre dependent flex 벡터를 GlyT2:Cre 형질전환 마우스의 척수에 주입했습니다.그 결과 GLYT2 양성 뉴런의 분포를 반영하는 eGFP 발현이 더 제한되었습니다. 이 프로토콜을 따르면 3개의 연속된 척추 세그먼트를 타겟팅할 수 있습니다. 우리는 이것이 강력한 행동 결과를 얻기에 충분하다는 것을 발견했습니다.이 기술을 사용하면 특정 뉴런 및 세포 집단과 감각 경로의 기능을 연구할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Smit, RD, et al. 뇌 및 척추 복합 수술을 사용하여 이중 바이러스 벡터로 신생아 쥐의 피질척수관을 표적으로 삼습니다. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 신생아 쥐의 피질 척수 뉴런에 대한 바이러스 벡터의 표적 전달을 보여줍니다. 이 프로토콜은 전행성 및 역행성 바이러스 주사를 사용하여 정확한 유전자 발현을 가능하게 하여 척수 손상 후 신경 재생 및 가소성에 대한 연구를 촉진합니다.

척수 손상을 연구하기 위해 신생아 쥐의 피질 척수 뉴런에 표적 바이러스 전달

출처: Tadokoro, T., et al. 성인 마우스에서 연하 아데노 관련 바이러스 9(AAV9) 벡터 전달. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 마우스의 척수에 유전자 전달을 위한 연막하 주입 기술을 보여줍니다. 이 절차에는 경막을 노출시키고, 연막을 천공하고, 형광 단백질 발현 유전자를 운반하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)를 연막하 공간에 주입하는 과정이 포함됩니다. 주사 및 회복 후 바이러스는 척수 세포의 유전자 발현을 촉진하여 표적 유전자 발현을 연구할 수 있습니다.

유전자 발현을 평가하기 위한 마우스 척수에서 연막하 유전자 전달

출처:Pourshafie, N., et al. 설치류의 신경근 질환을 치료하기 위해 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형 9를 사용한 MicroRNA의 전신 전달. J. Vis. Exp. (2018).이 비디오에서 척수 및 구근 근위축증 또는 SBMA 영향을 받은 마우스는 치료용 microRNA를 암호화하는 플라스미드를 운반하는 재조합 AAV(아데노 관련 벡터) 벡터의 꼬리 정맥 주사를 받습니다. 벡터는 돌연변이 AR(안드로겐 수용체)-mRNA(메신저 리보핵산)에 결합하여 분해를 유발하는 마이크로RNA를 생성합니다. 이는 독성 단백질 축적을 줄이고 신경근 기능을 개선하는 데 도움이 됩니다.

척추 및 구근 근위축 마우스 모델에서 재조합 아데노 관련 벡터 주입

바이러스 성 벡터는 타겟 유전자 조작을 위해 수 있습니다. 우리는 등쪽 뿔에 바이러스 벡터의 stereotaxic 주입, 기본 somatosensory afferents 및 중추 신경계의 뉴런 사이의 시냅스 접촉의 눈에 잘 띄는 사이트를 사용하여 조건부 유전자 발현 또는 마우스 척추 절제하는 방법을 보여줍니다.

마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입

이 프로토콜은 감각 축삭 재생을 연구하기 위한 모델로 성체 쥐에서 바이러스 벡터와 동시 등쪽 뿌리 압착 손상과 함께 등뿌리 신경절(DRG) 주사를 사용하는 것을 제시합니다. 이 모델은 감각 축삭 재생을 촉진하기 위한 유전자 요법의 사용을 조사하는 데 적합합니다.

등쪽 뿌리 신경절 사출 및 지느러미 루트 감각 축삭의 재생을위한 모델로 부상 크러시

본 연구의 목적은 성인 생쥐에서 새로운 subpial 유전자 전달 기술을 사용하여 척수 adeno-associated virus 9 (AAV9) 매개 유전자 전달의 효능과 안전성을 개발하고 검증하는 것이었다.

성인 쥐의 Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) 벡터 전달

쥐에서 대규모 중앙 신경 유전자 배달 방법 적용 됩니다. 이 예제에서는 목적은 전체 척수에 영향을 미치는 질병을 모방 이다. 광범위 한 변환, 주변 관리에서 CNS에 치료 단백질을 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다.

메서드 및 Adeno 관련 바이러스를 쥐의 정 맥 관리 및 중앙 신경 전달의 평가 대 한 팁

여기에 우리가 작은 동물에 게 효율적인 adeno 관련 바이러스 전달 되도록 하 여 중앙에서 변환 효율 예측 점수 시스템 구축 바이러스 솔루션에서 1 %lidocaine 염 산 염을 사용 하 여 직접 intrathecal 사출 기법 제시 lidocaine에 의해 유도 된 과도 함의 정도 따라 신경 시스템.

성인 쥐에 있는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스의 직접 Intrathecal 주입

이 프로토콜에서는 쥐 척수 조직으로 retrogradely 운송할 수 있는 바이러스 성 벡터의 주입을 보여 줍니다. 벡터는 시 냅 스에서 찍은 이며 대상 뉴런의 세포 체에 이송. 이 모델은 중요 한 척추 경로 또는 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 대상 셀의 역행 추적에 적합 합니다.

직접 분사 Lentiviral 벡터의 하이라이트 쥐 척수에서 여러 모터 통로

이 프로토콜은 전방 화학 유전 변형제를 체성 운동 피질에 주입하고 역행 수송 가능한 Cre 재조합 효소를 자궁 경부 척수에 주입하여 출생 후 5-10 일에 신생아 쥐의 세포 하위 집단에 유전자 요법을 적용하는 새로운 방법을 보여줍니다.

뇌 및 척추 결합 수술을 사용하여 이중 바이러스 벡터로 신생아 쥐의 피질척수관 표적화

지주막하 바이러스 주입을 사용하는 아데노 관련 바이러스의 광범위한 전달을 위한 새로운 기술이 설명됩니다. 이 방법은 표재층에서 마우스 신피질 뉴런의 광범위한 형질도입을 보장할 뿐만 아니라 비선택적 프로모터를 사용하는 경우에도 5층 피라미드 뉴런에서 전이유전자의 선택적 발현을 초래합니다.

AAV2의 지주막하 주입에 의한 마우스 신피질 뉴런의 광범위한 형질도입

배우세요 척수 내 rAAV 주사를 통해 유전적으로 정의된 척수 뉴런을 조작하는 방법을. 이 기술은 통각 회로 연구와 특정 뉴런 하위유형의 기능 분석에 활용됩니다.

척수의 유전으로 정의 된 신경에 있는 Adeno 관련 바이러스 중재 Transgene 식

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