척수의 유전으로 정의 된 신경에 있는 Adeno 관련 바이러스 중재 Transgene 식

재조합 아데노 관련 바이러스의 척추 내 전달의 전반적인 목표는 등쪽 척수에서 유전적으로 정의된 뉴런의 조직학적 표지 및 기능적 조작을 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 다양한 통증 양상을 인식하는 데 어떤 신경 회로가 필요한지와 같은 통증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전적으로 표지된 뉴런을 특별히 제한되고 일시적으로 제어되는 방식으로 조작할 수 있다는 것입니다.

마취된 쥐의 척추를 따라 촉진하여 가장 꼬리 갈비뼈 쌍을 찾습니다. 그런 다음 세로로 1.5-2.5cm 정도 피부를 자르고, 꼬리 부분부터 가장 꼬리가 있는 갈비뼈 쌍까지 자른다. 집게로 피부를 들어 올리고 가위로 아래 근육에서 분리합니다.

수술 내내 노출된 조직을 멸균 0.9% 염화나트륨으로 촉촉하게 유지하십시오. 가는 집게와 작은 가위를 사용하여 정중선 바로 옆의 얇은 막질 층 옆을 절개하고 가시돌기에서 잘라냅니다. 여러 해부학적 랜드마크는 표적화할 올바른 척추를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

여기에서는 세 가지 대안에 대해 설명합니다. 척추를 따라 촉진합니다. 가장 꼬리 갈비뼈 쌍은 T13 척추 바로 위에 위치하며 엉덩이 높이의 골반 뼈는 L6 척추 수준에 있습니다.

또는 피부를 꼬리 쪽으로 당겨 장골능을 노출시킵니다. 같은 수준에서, 눈에 보이는 tetetransverse ligaments의 가장 꼬리 쌍이 L6 척추 돌기에 합류합니다. 관심 있는 척추를 식별하기 위해 꼬리에서 꼬리 방향으로 거꾸로 세십시오.

그렇지 않으면 척추 측면을 따라 힘줄이 가장 하얗고 가장 내측인 지점을 찾으십시오. T13 척추는 바로 주둥이에 있습니다. 요추 척수 분절 L4는 이 척추 내에 있습니다.

다음으로, 동물을 말아 올린 조직의 쿠션 위에 놓고 정위 골격의 척추 클램프로 들어 올립니다. 클램프를 대상 척추에 인접하게 정렬합니다. 하나의 클램프를 제자리에 고정한 다음 두 번째 클램프를 고정하는 동안 Adson 집게로 척추를 잡습니다.

대상 척추를 조심스럽게 눌러 적절한 클램핑을 확인합니다. 그런 다음 관심 척추 위의 척수 근육을 제거합니다. 먼저, 척추와 평행한 힘줄의 내측으로 절개를 만듭니다.

그런 다음 목표 척추에 대한 수직 절개를 앞과 꼬리로 만듭니다. 다음으로, 롱거스를 사용하여 관심 척추 위의 척수 근육을 찢거나 잘라냅니다. 필요에 따라 집게를 사용하여 척추 또는 척추 내 공간의 경막 위에 남아 있는 조직을 제거합니다.

이제 등쪽 혈관이 보이고 척수의 정중선을 표시합니다. 편측 주사의 경우 0.5mm 구형 커터가 장착된 고급 치과 드릴을 사용하여 척추의 목표 쪽 중앙에 매우 조심스럽게 구멍을 뚫어 부분 후판 절제술을 수행합니다. 척수를 노출시키기 위해 26게이지 베벨 바늘로 남아 있는 뼈 조각을 제거합니다.

바늘을 사용하여 척추 내 공간의 경막을 천공하여 대상 척추까지 약 300미크론, 등쪽 혈관 측면으로 약 300미크론 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 뚫린 구멍 아래에 경막을 뚫습니다. 이 시점에서 뇌척수액이 구멍에서 빠져나와야 하고 척수가 약간 부풀어 올라야 합니다.

먼저 유리 모세관을 마이크로리터 주사기에 장착하여 주입 주사기를 준비합니다. 단단하고 단단히 고정되도록 너트를 단단히 조입니다. 마이크로리터 주사기에 멸균 증류수를 채운 다음 플런저를 누릅니다.

팁에서 물이 쉽게 배출되지 않으면 마이크로피펫이 막혔을 가능성이 있으므로 교체해야 합니다. 전자 제어식 마이크로인젝터에 연결된 마이크로매니퓰레이터에 주사기를 장착합니다. 그런 다음 마이크로 인젝터를 사용하여 약 1마이크로리터의 공기를 빨아들여 물과 바이러스를 분리합니다.

다음으로, 2.5마이크로리터의 희석된 바이러스 용액 방울을 파라핀 필름 조각에 피펫으로 주입합니다. 스테로택시 프레임을 사용하여 마이크로피펫의 끝을 액적 안으로 조심스럽게 옮기고 마이크로피펫 안으로 끌어올립니다. 그런 다음 팁에서 바이러스 용액 한 방울이 나올 때까지 분배를 누릅니다.

주사기를 집어넣고 펜을 사용하여 마이크로피펫에 스케일을 표시하여 분주량을 모니터링합니다. 입정계 팔을 사용하여 마이크로피펫의 끝을 경막의 구멍 중 하나 위로 움직인 다음 노출된 척수 표면에 약간의 함몰이 나타날 때까지 아래로 움푹 패입니다. 척추 등쪽 뿔에 주사를 목표로 하려면 팁을 100미크론 단위로 500미크론 깊이까지 아래로 이동한 다음 200미크론 위로 이동하여 조직의 기계적 안정화를 허용합니다.

팁의 최종 깊이는 300미크론입니다. 분당 50나노리터의 주입 속도로 300나노리터를 주입하도록 펌프를 프로그래밍한 후 시작 버튼을 눌러 주입을 시작합니다. 주입이 완료된 후 마이크로피펫의 스케일을 확인하여 바이러스 수치가 떨어졌는지 확인합니다.

압력이 평형을 이룰 수 있도록 마이크로피펫을 3분 더 제자리에 둡니다. 3분 후 마이크로피펫을 천천히 집어넣은 다음 다른 두 주사 부위에 대해 절차를 반복합니다. 마지막 주입 후 척추 클램프와 마우스 아래의 쿠션을 제거합니다.

단절된 바늘로 절개층을 닫고 흡수성 봉합사로 표재성 조직층을 봉합하고 비흡수성 봉합사로 피부를 봉합합니다. 봉합된 상처에 요오드 소독제를 바릅니다. 마취를 종료하고 동물이 회복될 때까지 열 매트 위에 그대로 두었다가 집 우리로 되돌려 보냅니다.

주사 부위의 척추 조직은 실험이 끝날 때 검사해야 합니다. 이는 성공적인 주입 및 형질주입을 확인하고 수술로 인한 과도한 조직 손상을 배제하는 데 필요합니다. 재조합 AAV의 척추 내 주사로 얻을 수 있는 발현 수준을 설명하기 위해, eGFP 형광 단백질을 암호화하는 바이러스를 야생형 마우스의 요추 척수에 주입했습니다.

약 1mm 간격으로 세 차례 주사를 맞았을 때, 요추 분절 L3에서 L5까지 거의 연속적인 감염이 발생했다. 척추 표면에서 300미크론 깊이에서 바이러스를 주입하면 척수 등쪽 뿔에 있는 세포가 우세하게 감염됩니다. 그러나 감염된 세포는 복부 뿔에서도 발견될 수 있습니다. eGFP를 발현하는 cre dependent flex 벡터를 GlyT2:Cre 형질전환 마우스의 척수에 주입했습니다.

그 결과 GLYT2 양성 뉴런의 분포를 반영하는 eGFP 발현이 더 제한되었습니다. 이 프로토콜을 따르면 3개의 연속된 척추 세그먼트를 타겟팅할 수 있습니다. 우리는 이것이 강력한 행동 결과를 얻기에 충분하다는 것을 발견했습니다.

이 기술을 사용하면 특정 뉴런 및 세포 집단과 감각 경로의 기능을 연구할 수 있습니다.