장기 라이브 셀 이미징 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 평가 하

이 절차의 전반적인 목표는 생세포 이미징을 사용하여 항유사분열 약물인 파클리탁셀(paclitaxel)로 치료한 후 세포의 운명 결정을 평가하는 것입니다. 이 방법을 통해 개별 세포가 항 유사 분열 약물 파클리탁셀의 다양한 용량에 어떻게 반응하는지 시각화 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고정 세포 이미징 또는 인구 기반 분석에서는 얻을 수 없는 단일 세포 또는 전체 집단에 대한 풍부한 정보를 제공한다는 것입니다.

이 방법을 시연하는 사람은 Ganem Laboratory의 MD/PhD 후보인 Marc Vittoria입니다. 먼저 광학 클리너로 이미징 접시의 유리 바닥을 청소하여 이미징을 방해할 수 있는 지문이나 먼지를 제거합니다. 충분한 광학 클리너를 사용하여 유리 표면 전체를 적십니다.

세포가 있는 유리 바닥 접시를 이미징 접시 어댑터의 현미경 스테이지에 놓습니다. 접시에서 플라스틱 덮개를 제거하고 접시를 유리로 덮인 챔버로 덮습니다. 챔버에 5%의 이산화탄소로 구성된 공기가 안정적으로 흐를 수 있도록 하는 밸브가 있는지 확인하십시오.

5%의 이산화탄소를 가습하기 위해 가스는 멸균 수조 하우징에 삽입된 튜브를 통해 흐릅니다. 이를 통해 가스가 95% 습도로 평형을 이룰 수 있습니다. 현미경을 제어하는 소프트웨어 프로그램을 사용하여 인코딩된 스테이지를 시작하고 보정합니다.

이렇게 하면 정확한 XY 좌표가 보장되고 초점 드리프트를 방지할 수 있습니다. 다음으로, 콘덴서를 올리고 조리개를 닫아 자기장이 어둡도록 Kohler 조명을 수행합니다. 선명한 육각형 모양의 빛이 보일 때까지 콘덴서를 내립니다.

그런 다음 센터링 나사를 사용하여 시야에서 빛의 육각형을 중앙에 배치합니다. 육각형 모양이 보이면 전체 시야가 비춰질 때까지 조리개를 엽니다. 현미경의 자동 초점을 작동하여 실험 기간 동안 모든 지점의 초점이 유지되도록 합니다.

획득 소프트웨어를 사용하여 이미징을 위해 각 웰에서 겹치지 않는 여러 시야를 선택합니다. 세포가 유리 바닥에 잘 부착되고 50%에서 70% 사이의 융합 영역을 선택합니다. 뭉친 세포 영역은 후속 분석을 어렵게 만들 수 있으므로 피하십시오.

유사분열 세포의 운명을 평가하려면 최대 96시간 동안 10분마다 선택한 각 시야에서 이미지를 수집하도록 이미징 소프트웨어를 설정합니다. 교란되지 않은 유사분열은 20분에서 40분 동안 지속되므로 10분 간격으로 세포가 분열하는 시점을 식별하기에 충분한 샘플링을 제공할 수 있습니다. 일시적인 현상인 핵 파열을 식별하려면 5분마다 이미지를 획득합니다.

GFP에 융합된 인간 히스톤 H2B를 사용하여 위상차 광학 장치를 사용하여 세포 반올림 및/또는 염색체 응축을 관찰하여 유사분열에 진입하는 세포를 식별합니다. 세포 반올림과 염색체 응축은 모두 눈으로 쉽게 시각화됩니다. 세포가 유사분열에 들어가는 시간을 주석으로 표시합니다.

세포가 운명에 도달할 때까지 세포를 계속 추적합니다. 대조 세포는 염색체를 효율적으로 정렬하고 1시간 이내에 anaphase에 들어가야 합니다. 세포가 둘로 쪼개지기 시작할 때 위상차 광학 장치를 사용하거나 H2B-GFP로 표지된 극 방향 이동 염색체의 시각화를 통해 anaphase를 시각화합니다.

세포가 anaphase를 겪는 시간에 주석을 달아줍니다. 대조적으로, 파클리탁셀로 처리된 세포는 몇 시간 동안 응축된 염색체로 둥글게 유지됩니다. 세포 사멸을 겪는 유사분열적으로 정지된 세포를 식별합니다.

유사분열 중에 죽는 세포는 세포가 bleb, shrink 및/또는 파열될 때 위상차 현미경으로 시각화됩니다. H2B-GFP를 이미징하면 염색체도 세포 사멸 중에 분열됩니다. 세포 미끄러짐을 겪는 유사분열적으로 정지된 세포를 식별합니다.

유사분열 미끄러짐을 겪는 세포는 위상차 현미경 검사법으로 관찰되며, 이는 아나페이즈(anaphase)를 거치지 않고 염색체를 계면으로 다시 평평하게 하고 탈응축하기 때문입니다. 이 세포는 종종 다핵으로 이루어진 큰 사배체 세포를 생성합니다. 원래 시야에서 셀을 계속 추적합니다.

전체 시야가 추적되면 동일한 웰에서 획득한 별도의 시야로 이동하여 세포 추적을 계속합니다. FUCCI 시스템을 발현하는 비형질전환 및 염색체적으로 안정적인 망막 색소 상피 세포주를 사용하여 유사분열 미끄러짐 후 세포 운명을 평가합니다. FUCCI 시스템이 제대로 작동하는지 확인하려면 대조 세포가 살아있는 세포 이미징 데이터 분석에서 적색 및 녹색 형광 단백질의 발현을 적절하게 번갈아 가며 발현하는지 검증합니다.

대조 세포는 세포가 G1기에서 S기로 진행됨에 따라 계면 동안 완전히 핵 적색 형광을 나타내는 것에서 완전히 핵 녹색 형광을 나타내는 것으로 전환해야 합니다. 세포는 유사분열이 완료되는 동안 계속해서 녹색 형광을 나타내야 합니다. 유사분열 직후, 세포는 간기 동안 다시 한 번 완전히 적색 형광을 나타내야 합니다.

위상차 현미경을 사용하여 유사분열에서 정지된 세포를 식별하고 유사분열 미끄러짐을 겪을 때까지 추적합니다. 유사분열에서 빠져나와 다시 간기로 들어간 세포는 유사분열 동안 녹색 형광을 나타내다가 G1 단계 동안 적색 형광으로 바뀝니다. 위상차 및 눈으로 epifluorescent imaging을 사용하여 미끄러진 세포를 추적하여 세포의 운명을 평가합니다.

세포주기에 다시 진입하는 세포를 식별합니다. 이러한 세포는 G1/S 전이를 나타내는 FUCCI 시스템을 사용하여 형광 발현의 빨간색에서 녹색으로의 변화로 식별됩니다. G1 세포주기 정지를 겪는 세포를 식별합니다.

이러한 세포는 24시간 이상 지속되는 적색 형광의 발현으로 식별됩니다. 또한 간기에서 죽는 세포를 식별합니다. 이러한 세포는 위상차 이미징을 사용하여 세포 파열, 기포 및 수축으로 식별됩니다.

이전과 같이 셀을 이미지화합니다. 핵 국소화 신호(TDRFP-NLS)와 H2B-GFP에 융합된 RFP의 탠덤 이량체 반복의 형광 신호는 계기 동안 공동 국소화되어야 합니다. 유사분열은 위상 광학을 사용한 세포 반올림 및/또는 H2B-GFP에 의한 염색체 응축으로 시각화됩니다.

유사분열 시 핵막이 파괴되고 TDRFP-NLS 신호가 세포질이 됩니다. 유사분열 후 핵막은 딸세포에서 재형성되고 TDRFP-NLS 신호는 핵이 됩니다. 라이브 셀 이미징을 통한 후속 계면 전반에 걸쳐 딸 세포를 추적합니다.

핵 국소화된 TDRFP-NLS가 주변 세포질로 일시적인 폭발을 관찰하여 핵 파열 현상을 식별합니다. 몇 분 안에 핵막이 수리되고 TDRFP-NLS가 핵으로 재지역화됩니다. 여기에 표시된 것은 미끄러진 세포가 파클리탁셀 처리에서 미끄러진 후 녹색으로 변하고 S기로 진입하는 대표적인 이미지입니다.

파클리탁셀 치료에서 빠져나온 세포의 대다수는 G1/G0 정지를 겪었고 세포사멸을 거치지 않고 48시간 이상 붉게 유지되었습니다. 미끄러짐 후 빨간색인 세포도 이 이미지에서 볼 수 있듯이 세포사멸을 겪게 됩니다. 핵막 파열은 파클리탁셀 처리된 세포에서 증가합니다.

10나노몰 파클리탁셀로 처리된 TDRFP-NLS 및 H2B-GFP 세포는 핵 파열이 증가하여 RFP가 핵에서 간기 세포의 세포질로 비편재화됩니다. 이 동영상을 시청한 후에는 다양한 약물 치료에 대한 반응으로 세포의 운명을 평가하기 위해 장기 라이브 셀 이미징을 수행하는 방법을 확실히 이해하게 될 것입니다.