Name: 나노 입자와 그들의 항균 활동 및 세포 독성 속성의 평가 수정 다중 벽 탄소 나노튜브의 합성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 학습하세요 다중벽 탄소나노튜브와 은나노입자를 이용한 항균 나노복합체 합성 방법을. 산화 및 환원침전 공정으로 제조된 이 재료는 강력한 항균 활성과 낮은 세포독성을 보여 의료 응용 가능성이 있습니다.

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이 연구는 국립 연구 재단의 Korea(NRF) 과학기술처와 ICT (No. 2017M3A7B8061942)를 통해 나노 소재 기술 개발 프로그램와 중앙 대학교 연구 보조금 (2016)에 의해 지원 되었다.

1. MWCNT 산화
<ol><li>50 mL 유리병으로 MWCNT의 30-50 밀리 그램을 측정 합니다. 천천히 그래서 H2의 8 mL을 추가4: 피 펫 1 mL 피 펫 팁으로 HNO3 솔루션 (90% 초기 농도, 3:1 vol/vol). 주의: 화학 증기 두건이이 준비를 실시 해야 합니다.<ol>
<li>발열 반응 완료에 대 일 분을 허용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MWCNT 유리병의 바닥에 침전 될 때까지 60-80 ° C와 160 W 1 h에서 솔루션을 sonicate. 주의: 수 위는 sonicator 해야 유리병의 상단 보다 낮은 그래서 물을 유리병에 도입 되지 것입니다.</li>
	<li>원심 분리기 튜브에 솔루션을 전송.<ol>
<li>micropipette 추가할 증류수의 30 mL dropwise MWCNT-COOH 솔루션. 주의: 강한 발열 반응 증류수의 추가 발생합니다. 증류수를 천천히 추가 하 고 냉각을 위한 시간을 허용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>12000 x g와 15 분 동안 실 온에서 MWCNT-COOH 솔루션 원심 주의: 원심 분리기를 작동 하는 경우는 원심 분리기 샘플 튜브 반대 같은 무게로 튜브를 배치 하 여 균형 유지 확인 하십시오.</li>
	<li>상쾌한 피 펫 및 1 mL 피 펫 팁을 제거 합니다. 피 펫 및 1 mL 피 펫 팁 에탄올 5 mL를 추가 합니다. 추가적인 pipetted 에탄올과 유리병의 벽을 씻어. 12000 x g와 15 분 동안 실내 온도에 솔루션 원심<ol>
<li>PH 종이 상쾌한의 pH를 결정 합니다. 세척 및 centrifuging 표면에 뜨는 pH 중립 될 때까지 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 상쾌한을 제거 합니다. 침전 하 고 솔루션에서 MWCNT-COOH를 균등 하 게 분산을 증류수 1 mL를 추가 합니다. 건조까지 진공에서-60 ° C에서 솔루션을 freeze-dry.</li>
</ol>2. 실버 나노 입자 증 착 MWCNTs에
<ol><li>50 mL 원뿔 튜브에서 MWCNT-COOH의 10 mg을 놓고 30 mL의 증류수로 희석 합니다. 60 ° C와 160 W 1 h 솔루션 sonicate</li>
	<li>0.1 N AgNO3 의 6 mL 50 mL 원뿔 튜브에 배치 하 고 18 mL의 증류수로 희석. 60 ° C와 160 W 1 h 솔루션 sonicate 주의: Ag의 총 질량은 20%를 초과 하지 않는 그런 MWCNTs의 총 질량에 비례하여 AgNO3 를 추가 합니다.</li>
	<li>어 그 노3 솔루션 dropwise를 추가 피 펫 및 1 mL 피 펫 팁 MWCNTs 솔루션 sonicating 60 ° C와 160 AgNO3을 추가한 후 1 시간에 대 한 계속 sonicating W.에 혼합 하는 동안 합니다.</li>
	<li>12000 x g와 15 분 동안 실내 온도에서 용액을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 원심 솔루션 및 제거는 상쾌한 두 추가 시간.</li>
	<li>Ag-MWCNTs 혼합물을 1 mL의 증류수를 추가 하 고 솔루션에 균등 하 게 침전을 분산. 에탄올의 5 mL을 추가 하 고 허용 1 시간 실 온에서 진행 하는 반응.</li>
	<li>12000 x g와 15 분 동안 실내 온도에서 용액을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>PH 종이 상쾌한의 pH를 결정 합니다. 세척 및 centrifuging 표면에 뜨는 pH 중립 될 때까지 반복 합니다.</li>
	<li>Ag-MWCNTs를 1 mL의 증류수를 추가 하 고 솔루션에서 균등 하 게 분산. 24 h에 대 한 진공에서-70 ° C에서 솔루션 freeze-dry</li>
</ol>3. 존의 저해 시험
<ol><li>18.12 g R2A 한 천 1 L 플라스 크에 증류수의 믹스. 15 분 동안 121 ° C에 압력솥에 혼합 소독.</li>
	<li>실내 온도에 냉각 젤을 허용 합니다. 단단한 매체를 준비 하는 경화 전에 접시에 젤의 10 mL를 배치 합니다.</li>
	<li>단단한 매체에 박테리아의 장소 100 µ L. 스프레더를 사용 하 여 단단한 매체에 박테리아를 확산. 주의:이 절차는 알코올 램프로 조명 화학 증기 두건에서 실시 해야 합니다.</li>
	<li>48 h 30 ° C에서 요리를 품 어.</li>
	<li>3.12 g R2A 국물의 1 L 플라스 크에 증류수의 믹스. 15 분 동안 121 ° C에 압력솥에 혼합 소독.</li>
	<li>루프와 바늘을 사용 하 여 액체 매체에 성장된 식민지를 전송 하 고 180 rpm와 30 ° C에 인큐베이터에서 품 어</li>
	<li>600에서 UV 분 광 광도 법에 의해 OD (광학 밀도) 값을 기록 세균성 성장을 측정을 시간 단위로 nm. 참고: R2A 한 천 R2A Methylobacterium 종 의 성장 위한 선호 한 때문에 표준 뮬러-힌 튼 천 보다는이 테스트에 사용 된
</li>
	<li>하단 agar를 준비 하는 페 트리 접시에 준비 된 R2A 한 천의 장소 10 mL.<ol>
<li>3.12 g R2A 국물과 한 천의 8 g 1 L 증류수의 믹스. 하단 agar에이 젤의 15 분 장소 10 ml 121 ° C에서 압력솥에 혼합 소독.</li>
	</ol>
</li>
	<li>50 µ L는 micropipette 살 균 종이 디스크에 Ag MWCNTs 솔루션의 로드.<ol>
<li>건조 하 고 30 분 동안 자외선에서 진공 챔버에 Ag MWCNTs 샘플을 소독.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Agar에 장소 Ag-MWCNTs 샘플입니다.</li>
	<li>48 h 30 ° C에서 한 천 배지를 품 어.</li>
	<li>저해12의 측정 영역입니다. 참고: 사용 하는 소프트웨어에 대 한 지침 참조에 포함 되어 있습니다.</li>
</ol>4. 항균 테스트
<ol><li>반복 단계 3.1을 3.7 세균성 문화를 준비 합니다.</li>
	<li>최대 OD에서 피 펫과 100 µ L 마이크로 피 펫 팁 신선한 액체 매체의 3 mL에 박테리아의 100 µ L를 접종.</li>
	<li>5 준비 15 mL 원뿔 튜브에 제어 솔루션의 50 µ L 샘플. 각 관을 다음을 추가: 1) 메탄올; 2) 1000 µ g/mL MWCNT-COOH; MWCNTs-3) 50 µ g/mL Ag; MWMWCNTs-4) 40 µ g/mL Ag; MWCNTs-5) 30 µ g/mL Ag.</li>
	<li>컨트롤은 위에서 설명한 대로 UV 분 광 광도 법에 따라 극대로 활성화 될 때까지 180 rpm와 30 ° C에서 품 어.</li>
	<li>각 샘플의 OD 값을 측정 하 고 마이크 농도 계산. OD 값은 샘플 국물에 세균성 세포의 수와 직접적인 관련이 있습니다.</li>
	<li>스프레더와 고체 매체에 교양된 박테리아 확산.</li>
	<li>48 h 30 ° C에서 접시를 품 어.</li>
	<li>세균성 식민지 및 측정 CFU 값 항균 활동12을 계산 합니다. 참고: 사용 하는 소프트웨어에 대 한 지침 참조에 포함 되어 있습니다.</li>
</ol>5. 생존 분석 결과
<ol><li>인큐베이터에서 배양 세포를 제거한 후 매체를 흡입 하 고 PBS의 5 mL의 dropwise 워시로 세 번 세척.</li>
	<li>1 분 후 씻어 셀 및 흡입에 PBS에 트립 신-EDTA의 1 mL 추가 합니다.<ol>
<li>붙어 세포를 제거 하 고 접시를 누릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DMEM (Dulbecco의 수정이 글의 중간)의 5 mL을 추가 하 고 셀을 제거 합니다. 3 분 x 200g에 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.<ol>
<li>DPBS와 섞어 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>자동 셀 카운팅 기계 솔루션의 10 µ L에서 세포를 계산. 참고: 셀 계산 기계 사용에 대 한 지침 참조13에 포함 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>장소 1 × 105 DMEM 솔루션을 포함 하는 6-잘 접시에 잘 당 AML12 세포의. 매체에는 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 살 균 항생제 포함 되어 있습니다.</li>
	<li>5% CO2/95% 공기 환경에서 37 ° C에서 8 ~ 12 h에 대해 품 어.</li>
	<li>흡입 한 흡 인기와 우물에서 상쾌한.<ol>
<li>제어, NMS DMSO (디 메 틸 sulfoxide) 및 30-40 µ g/mL Ag MWCNT DMEM 1 mL의 구성 하는 각 샘플을 추가 합니다.</li>
		<li>8 h 5% CO2/95% 공기 환경에서 37 ° C에서 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 mL의 PBS로 세척 하 고 표면에 뜨는 샘플을 제거 합니다.</li>
	<li>셀에 dropwise 준비 라이브/죽은 키트 (µ 2 mM EthD-1 20 L의 PBS의 10 mL에 DMSO에 4 m m calcein 오전 5 µ L)의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>100 X 300 X에서 표준 형광 현미경으로 room temperature 30-45 분 또는 10 분 측정 형광에 대 한 37 ° C에서 품 어.</li>
</ol>6. Trypan 블루 분석 결과
<ol><li>5.6.2 위의 통해 5.1 단계에 따라 샘플을 준비 합니다.</li>
	<li>상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>1 x DPBS의 1 mL 접시 세척 하 고 가만히 따르다.</li>
	<li>접시 및 문화에서 셀 분리에 3 분 동안 품 어 trypsin의 1 mL를 추가 합니다. 세포 배양 매체를 사용 하 여 접시를 세척 하 고 세포를 수집. 15 mL 튜브에 수집 된 셀 놓습니다.</li>
	<li>튜브 200 g x 3 분 동안 4 ° C에서 원심</li>
	<li>상쾌한을 삭제 합니다. 1 mL 신선한 매체의 셀 펠 릿을 추가 하 고 셀을 다시 해산.</li>
	<li>분산 된 세포의 10 µ L trypan 블루의 10 µ L을 추가 하 고 자동 셀 카운팅 기계 셀을 카운트. 참고: 셀 계산 기계 사용에 대 한 지침 참조에 포함 되어 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 예금 된 Ag 나노 입자와 MWCNTs의 준비에 대 한 간단한 방법을 보고합니다. 이 포함 하는 실버 접한 상당한 항균 활동 및 본문에은 나노 입자의 통제 흡수에 대 한 최소한의 가능성을 보여 줍니다. 우리는 입증 합성된 Ag-MWCNTs의 30 µ g/mL는 포유류 간 세포를 무시할 수 세포 독성 Methylobacterium 종 에 대 한 항균 활동의 효과적인 수준. 상업 분야에 확장 하기 전에 추가 개선 및 biosafety 평가 Ag-MWCNTs에 대 한 요구는 환경 친화적이 고 저렴 한 Ag-MWCNTs를 생산 도울 수를 환 원제로 서 에탄올을 사용 하 여.
다음 포인트는 설명 했다. 다양 한 유형의 개발된 나노 재료와 박테리아를 파괴 하는 것이 가능 하다. 나노 입자 예금 될 수 있는 나노튜브 표면에 여러 사이트를 가능 하다. 항균 속성 크기와 표면에 예금 된은 나노 입자의 수를 제어 하 여 맞출 수 있습니다. 개발 된 나노 세균 세포에 ...

이 연구의 궁극적인 목표는 그 양식을 biofilms 박테리아의 성장을 억제할 수 있는 친환경 항균 나노 재료를 만드는 것입니다. 이러한 항균 나노 일반적으로 사용 된 화학 제품 또는 항생제 화합물의 독성 및 항생제 저항 문제를 극복할 가능성이 있다. biofilm 수 화 된 세포 외 고분자 물질 (EPS) 다 당 류, 단백질, 핵 산, 지질1,2의 구성 이다. Biofilms는 이물질의 침입을 방지 하 고3,4적극적으로 성장 하는 박테리아를 도움이 됩니다. Biofilms 발생할 냄새 및 만성 전염병5,6. Methylobacterium spp., 예를 들어 물 있으면 항상 또는 에어컨 열교환기, 샤워 룸, 의료 기기 등 지속적으로 세균 박멸을 보장 하기 어려운 장소에 준수에 의해 성장. 이러한 유형의 biofilms 발생할 냄새 및 만성 전염병5,6.
일반적으로, 화학 제품 또는 항생제 화합물 biofilms를 형성 하는 박테리아의 성장을 억제 하는 데 사용 됩니다. Vivo에서 화학 물질의 안전에 대 한 우려 및 항생제 내성 박테리아의 출현 biofilms의 대형을 방지 하 고 박테리아의 성장을 억제 하는 새로운 재료를 개발 하는 필요를 몰고 있다.
이 연구에서는 항균 나노 항 생 저항 및 독성에서 무료로 합성 됩니다. 유명한 항균 물질 이며 nanoscience 및 나노기술의 최근 개발 활성 연구 금속 나노 입자7,8의 항균 효과로 이어졌다. 최근 연구는 작은 크기와 높은 표면 볼륨 비율은 나노 입자의 항균 활동 증가9,,1011에 결과 보고 있다.
여기에 소개 하는 나노 증가 항균 특성 및 높은 종횡비, 단위 부피 당 표면적을 증가 탄소 나노튜브 실버 나노 입자를 결합 합니다. 조작된 실버 나노 탄소 나노튜브 합성 상당한 항균 특성 및 인간과 동물 세포에 최소한의 독성을 전시 한다. 이전 연구에서 합성 프로세스 등 NaBH4, formamide, dimethylformamide, 히드라 진 위험 감소 시키는 대리인을 사용합니다. 과정은, 위험, 복잡 하 고 시간이 많이 걸리는. 합성 과정 보고 여기 훨씬 덜 위험 감소 시키는 대리인으로 에탄올을 사용 하 여.
금지 영역 및 Ag-MWCNTs에 대 한 최소 살 균 농도 (MBC) 측정 되었다; 라이브/죽은 고 Trypan 블루 분석 실험 독성 및 항균 특성을 측정 하기 위해 사용 되었다. 최소 억제 농도 (MIC)와 미토 콘 드리 아 독성 (MTT) 분석 실험 이었다는 분석 방해는 것는 탄소 나노튜브의 특이 한 색상 때문에 수행 되지 않습니다. 마지막으로, 포유류 세포를 영향을 주지 않고 Methylobacterium 종 의 성장을 방지 하기 위해 최소 농도 결정 했다.

<table><tbody><tr><td>0.1 N 질산은</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>1090811000</td><td></td></tr><tr><td>탄소 나노 튜브, 다중 벽</td><td>도쿄 화학 공업 주식 회사</td><td>308068-56-6</td><td></td></tr><tr><td>R2A 한천</td><td>MBcell</td><td>MB-R1129</td><td></td></tr><tr><td>R2A 국물</td><td>MBcell</td><td>MB-R2230</td><td></td></tr><tr><td>Methylobacterium spp.</td><td>KCTC</td><td>12618</td><td>from Korea Collection for Type Cultures 대전 한국 12618, 대전, 한국</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Cell imaging Kit</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>R37601</td><td></td></tr><tr><td>AML12</td><td></td><td></td><td>from Chungnam University, Dajeon, Korea</td></tr><tr><td>human PBMC</td><td>ATCC</td><td>PCS-800-011</td><td></td></tr><tr><td>TEM</td><td>JEOL</td><td>JEM-2100F</td><td></td></tr><tr><td>XRD,</td><td>RIGAKU</td><td>D/MAX 2500</td><td>Cu K 광자 소스 (40kV, 100mA)</td></tr><tr><td>JuLI Br</td><td>NanoEnTek</td><td>JULI-BRSC&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

나노 입자와 그들의 항균 활동 및 세포 독성 속성의 평가 수정 다중 벽 탄소 나노튜브의 합성

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

본이 연구에서는 다중 벽 탄소 나노튜브 (MWCNTs) 산소 기반 기능 그룹을 형성 하는 수성 황산 솔루션으로 치료 했다. 실버 MWCNTs 실버 AgNO3 산화 MWCNTs의 수성 해결책에서의 감소 증 착에 의해 준비 되었다. CNTs의 독특한 색깔을 감안할 때, 그것은 최소 억제 농도 또는 때문에 그들은 방해는 분석 실험 독성 및 항균 속성을 평가 하는 미토 콘 드리 아 독성 분석 실험에 적용 가능 하지 않았다. 저해 영역과 Ag-MWCNTs에 대 한 최소 살 균 농도 측정 하 고 라이브/죽은 Trypan 블루 분석은 CNTs의 색을 방해 하지 않고 독성 및 항균 속성을 측정 하는 데 사용.

전송 전자 현미경 (TEM) 이미지 Ag-MWCNTs (그림 1A 및 1B)의 형성을 확인합니다. 그들의 성공적인 합성 표면에 변화에 의해 확인 되었다. MWCNTs에 Ag 입자의 크기 계산 (그림 1C). 평균 입자 크기는 약 3.83 nm. Ag-MWCNTs로 합성의 XRD 패턴 그림 1D에 표시 됩니다. MWCNT;에 해당 하는 피크에 20-30 ° 나머지 봉우리 Ag에 해당합니다. 항균 성 활동 데이터는 그림 2에 표시 됩니다. 세균성 식민지 인구 Methylobacterium 컨트롤 (그림 2A);에 의해 확인 되었다 메탄올의 추가 감소 인구 10<s...

이 연구에서는 항균 나노 multiwalled 탄소 나노튜브의 산 성 산화 및은 나노 입자의 연속적인 감소 증 착에 의해 합성 되었다. 항균 성 활동 및 세포 독성 테스트 준비로 나노 수행 했다.

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

이 절차의 전반적인 목표는 나노튜브 표면에서 은 나노 입자가 합성된 탄소 나노튜브로 구성된 항균 나노복합체를 생산하는 것입니다. 이 방법은 다양한 종류의 박테리아 및 생물막에 대해 강한 정화조 특성을 가지면서 인간에 대한 독성이 낮은 새로운 박테리아 나노 물질의 개발에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간과의 생물학적 동등성을 유지하면서 박테리아를 박멸하는 데 있어 나노 복합체를 평가하는 방법을 설명합니다.절차를 시작하려면 50ml 바이알에 30-50mg의 MWCNT를 넣습니다. 1 밀리리터 피펫 팁이 장착 된 마이크로 피펫을 사용하여 황산과 질산의 3 대 1 부피 용액 8 밀리리터를 MWCNT에 천천히 첨가합니다.발열 반응이 완료 될 때까지 30 분 동안 기다린 다음 MWCNT가 바이알 바닥에 정착 할 때까지 섭씨 60-80도 및 160 와트에서 용액을 초음파 처리합니다. 보통 약 1시간이 걸립니다.혼합물을 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 마이크로피펫을 사용하여 30ml의 증류수를 카르복실산 기능화된 MWCNT에 조심스럽게 적방울 첨가하고 필요에 따라 혼합물이 냉각될 때까지 일시 중지합니다. 그런 다음 혼합물을 12, 000G에서 15분 동안 원심분리합니다.1밀리리터 피펫 팁이 장착된 피펫으로 상층액을 제거합니다. 고체에 5ml의 에탄올을 넣고 바이알 벽을 추가 에탄올로 헹굽니다. 동일한 설정으로 혼합물을 다시 원심분리하고 pH 종이로 상등액의 pH를 확인합니다.상등액 pH가 중성이 될 때까지 에탄올에서 원심분리하여 고체를 계속 세척한 다음 상등액을 제거하고 침전물에 증류수 1ml를 첨가합니다. 카르복실산 기능화 MWCNT를 물에 분산시키고 진공 상태에서 섭씨 영하 60도에서 분산액을 동결 건조합니다. 동결 건조 카르복실산 기능성 MWCNT 10mg을 50ml 원추형 원심분리기 튜브에 넣습니다.튜브에 증류수 30ml를 추가합니다. 6ml의 0.1 일반 질산은과 18ml의 증류수를 다른 50ml 원추형 튜브에 결합합니다. 두 혼합물을 섭씨 60도, 160와트에서 1시간 동안 초음파 처리합니다.그런 다음 섭씨 60도 및 160와트에서 MWCNT 분산액을 초음파 처리하면서 1밀리리터 피펫 팁이 장착된 피펫을 사용하여 질산은 용액을 MWCNT 분산액에 적가합니다. 일단 추가가 완료되면, 1 시간 동안 혼합물을 초음파 처리하고십시오, 그 후에 12, 실내 온도에 000 G에 15 분 동안 혼합물을 원심 분리하고 상층액을 제거하십시오. 은 MWCNT를 30 밀리리터의 증류수에 재분산시켜 섭씨 24도에서 30 분 동안 초음파 처리한다.증류수 30ml에서 원심분리를 반복하고 상층액을 두 번 제거합니다. 다음으로, 세척 된은 MWCNT를 증류수 1 밀리리터에 5 분 동안 초음파 처리하여 분산시킨다. 분산액에 5ml의 에탄올을 넣고 혼합물을 실온에서 1시간 동안 저어줍니다.다음 12, 실내 온도에 000 G에 15 분 동안 혼합물을 원심 분리하고 상등액의 pH를 검사하십시오. 상등액을 제거하고 볼텍싱에 의해 5 밀리리터의 에탄올에 혼합물을 재분산시킵니다. 상층액 pH가 중성이 될 때까지 원심분리로 침전물을 에탄올로 계속 세척합니다.마지막으로, 세척 된은 MWCNT를 증류수 1 밀리리터에 분산시킵니다. 진공 상태에서 섭씨 영하 70도의 분산액을 24시간 동안 동결 건조하고 밀봉된 용기에 보관합니다. 테스트 준비를 시작하려면 R2A 한천 18.12g과 증류수 1리터를 혼합하고 오토클레이브합니다.젤을 실온에서 식히십시오. 젤을 부을 준비가 되면 10mm 페트리 접시에 젤 90ml를 넣고 한천이 굳어지도록 합니다. 흄 후드에서 알코올 화염으로 멸균된 루프와 바늘을 사용하여 배양 배지 표면에 100마이크로리터의 메틸로박테리움 종 혼합물을 줄무늬를 만듭니다.접시를 섭씨 30도에서 48시간 동안 배양한 다음 R2A 육수 3.12g과 증류수 1리터를 섞고 배지를 섭씨 121도에서 15분 동안 고압멸균합니다. 멸균된 루프와 바늘을 사용하여 집락을 R2A 성장 배지로 옮깁니다. 진탕 인큐베이터에서 섭씨 30도 및 180RPM으로 샘플을 배양합니다.광학 밀도가 0.7보다 커질 때까지 600나노미터에서 매시간 광학 밀도를 측정합니다. 다음으로, 10ml의 R2A 한천이 들어있는 다른 페트리 접시를 준비합니다. 그런 다음 R2A 육수 3.12g과 한천 8g을 증류수 1리터에 섞습니다.혼합물을 섭씨 121도에서 15분 동안 오토클레이브합니다. 100 마이크로 리터의 메틸 박테리아 배양액을 한천 혼합물에 혼합합니다. 페트리 접시의 R2A 한천 바닥층에 메틸로박테륨 함유 젤 10ml를 붓고 증류수에 원하는 농도의 동결 건조은 MWCNT를 분산시킵니다.마이크로피펫을 사용하여 이 분산액 50마이크로리터를 6x1mm 멸균 종이 디스크에 로드합니다. 증류수를 다른 멸균 종이 디스크에 대조군으로 바르십시오. 두 디스크를 모두 자외선 아래의 진공 챔버에서 30분 동안 건조시키고 살균합니다.그런 다음 은 MWCNT 샘플과 대조군을 한천에 놓고 한천 플레이트를 섭씨 30도에서 48시간 동안 배양합니다. 완료되면 은 MWCNT 샘플 주변의 억제 영역을 측정합니다. 테스트 전에 섭씨 121도에서 15분 동안 삼중 증류수를 오토클레이브합니다.이 멸균수에서 카르복실산 기능화 MWCNT의 밀리리터당 1000마이크로그램 분산액과 밀리리터당 50마이크로그램, 밀리리터당 40마이크로그램 및 밀리리터당 30마이크로그램 분산액을 준비합니다. 항균 테스트 절차를 시작하려면 앞서 설명한 대로 메틸로박테륨 배양을 준비하고 600나노미터에서 광학 밀도를 모니터링합니다. 광학 밀도가 최대일 때 100마이크로리터의 메틸로박테륨 배양액을 3밀리리터의 새로운 R2A 배양 배지에 접종합니다.이 용액 500마이크로리터를 5개의 15밀리리터 원추형 튜브 각각에 놓습니다. 튜브 중 하나에 100마이크로리터의 메탄올을 추가하여 메탄올 기준 샘플을 준비합니다. 동일한 방식으로 4개의 분산액 각각에 대한 샘플을 준비합니다.샘플과 나머지 메틸로박테륨 대조군 배양을 180 RPM 및 30°C에서 대조군의 광학 밀도가 최대 활성을 나타낼 때까지 배양합니다. 멸균된 스프레더를 사용하여 각 샘플을 펴십시오.amp페트리 접시의 고체 R2A 한천 젤에 넣습니다. 섭씨 30도에서 48시간 동안 접시를 배양합니다.결과 박테리아 군집을 세고 최소 살균 농도를 결정합니다. 은 MWCNT는 기재된 절차를 사용하여 성공적으로 합성하였다. 평균 증착 된 은 입자 크기는 약 3.83 나노 미터였습니다.메틸로박테륨 성장은 은 MWCNT의 밀리리터당 50마이크로그램 또는 밀리리터당 40마이크로그램 분산액으로 배양할 때 관찰되지 않았습니다. 박테리아 개체군은 은 MWCNT의 밀리리터당 30마이크로그램 분산액으로 배양했을 때 대조군 샘플에 비해 100, 000배 감소했습니다. 은 MWCNT의 밀리리터당 10마이크로그램 분산액으로부터 제조된 샘플 주변에서 억제 영역이 관찰되었습니다.밀리리터당 1마이크로그램 분산액에서 제조된 샘플에 대해 억제 영역이 관찰되지 않았습니다. 은 MWCNT의 밀리리터당 40마이크로그램 분산액이 추가되었을 때 일부 세포 독성이 관찰되었습니다. 밀리리터당 30마이크로그램의 분산액을 첨가했을 때 유의미한 세포독성은 관찰되지 않았습니다.트리판 블루 분석법은 은 MWCNTs의 밀리리터당 30마이크로그램 분산액을 첨가했을 때 최소한의 세포 독성이 있음을 확인했습니다. 이 프로토콜은 탄소 나노 물질에 직접 작용하는 금속 나노 입자를 가진 나노 복합체를 준비하는 연구원에게 도움이 될 것입니다. 이 프로토콜에 따라 연구원들은 준비된 나노 복합체의 항균 특성도 평가할 수 있습니다.

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