나노 입자와 그들의 항균 활동 및 세포 독성 속성의 평가 수정 다중 벽 탄소 나노튜브의 합성

이 절차의 전반적인 목표는 나노튜브 표면에서 은 나노 입자가 합성된 탄소 나노튜브로 구성된 항균 나노복합체를 생산하는 것입니다. 이 방법은 다양한 종류의 박테리아 및 생물막에 대해 강한 정화조 특성을 가지면서 인간에 대한 독성이 낮은 새로운 박테리아 나노 물질의 개발에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간과의 생물학적 동등성을 유지하면서 박테리아를 박멸하는 데 있어 나노 복합체를 평가하는 방법을 설명합니다.

절차를 시작하려면 50ml 바이알에 30-50mg의 MWCNT를 넣습니다. 1 밀리리터 피펫 팁이 장착 된 마이크로 피펫을 사용하여 황산과 질산의 3 대 1 부피 용액 8 밀리리터를 MWCNT에 천천히 첨가합니다.발열 반응이 완료 될 때까지 30 분 동안 기다린 다음 MWCNT가 바이알 바닥에 정착 할 때까지 섭씨 60-80도 및 160 와트에서 용액을 초음파 처리합니다. 보통 약 1시간이 걸립니다.

혼합물을 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 마이크로피펫을 사용하여 30ml의 증류수를 카르복실산 기능화된 MWCNT에 조심스럽게 적방울 첨가하고 필요에 따라 혼합물이 냉각될 때까지 일시 중지합니다. 그런 다음 혼합물을 12, 000G에서 15분 동안 원심분리합니다.

1밀리리터 피펫 팁이 장착된 피펫으로 상층액을 제거합니다. 고체에 5ml의 에탄올을 넣고 바이알 벽을 추가 에탄올로 헹굽니다. 동일한 설정으로 혼합물을 다시 원심분리하고 pH 종이로 상등액의 pH를 확인합니다.

상등액 pH가 중성이 될 때까지 에탄올에서 원심분리하여 고체를 계속 세척한 다음 상등액을 제거하고 침전물에 증류수 1ml를 첨가합니다. 카르복실산 기능화 MWCNT를 물에 분산시키고 진공 상태에서 섭씨 영하 60도에서 분산액을 동결 건조합니다. 동결 건조 카르복실산 기능성 MWCNT 10mg을 50ml 원추형 원심분리기 튜브에 넣습니다.

튜브에 증류수 30ml를 추가합니다. 6ml의 0.1 일반 질산은과 18ml의 증류수를 다른 50ml 원추형 튜브에 결합합니다. 두 혼합물을 섭씨 60도, 160와트에서 1시간 동안 초음파 처리합니다.

그런 다음 섭씨 60도 및 160와트에서 MWCNT 분산액을 초음파 처리하면서 1밀리리터 피펫 팁이 장착된 피펫을 사용하여 질산은 용액을 MWCNT 분산액에 적가합니다. 일단 추가가 완료되면, 1 시간 동안 혼합물을 초음파 처리하고십시오, 그 후에 12, 실내 온도에 000 G에 15 분 동안 혼합물을 원심 분리하고 상층액을 제거하십시오. 은 MWCNT를 30 밀리리터의 증류수에 재분산시켜 섭씨 24도에서 30 분 동안 초음파 처리한다.

증류수 30ml에서 원심분리를 반복하고 상층액을 두 번 제거합니다. 다음으로, 세척 된은 MWCNT를 증류수 1 밀리리터에 5 분 동안 초음파 처리하여 분산시킨다. 분산액에 5ml의 에탄올을 넣고 혼합물을 실온에서 1시간 동안 저어줍니다.

다음 12, 실내 온도에 000 G에 15 분 동안 혼합물을 원심 분리하고 상등액의 pH를 검사하십시오. 상등액을 제거하고 볼텍싱에 의해 5 밀리리터의 에탄올에 혼합물을 재분산시킵니다. 상층액 pH가 중성이 될 때까지 원심분리로 침전물을 에탄올로 계속 세척합니다.

마지막으로, 세척 된은 MWCNT를 증류수 1 밀리리터에 분산시킵니다. 진공 상태에서 섭씨 영하 70도의 분산액을 24시간 동안 동결 건조하고 밀봉된 용기에 보관합니다. 테스트 준비를 시작하려면 R2A 한천 18.12g과 증류수 1리터를 혼합하고 오토클레이브합니다.

젤을 실온에서 식히십시오. 젤을 부을 준비가 되면 10mm 페트리 접시에 젤 90ml를 넣고 한천이 굳어지도록 합니다. 흄 후드에서 알코올 화염으로 멸균된 루프와 바늘을 사용하여 배양 배지 표면에 100마이크로리터의 메틸로박테리움 종 혼합물을 줄무늬를 만듭니다.

접시를 섭씨 30도에서 48시간 동안 배양한 다음 R2A 육수 3.12g과 증류수 1리터를 섞고 배지를 섭씨 121도에서 15분 동안 고압멸균합니다. 멸균된 루프와 바늘을 사용하여 집락을 R2A 성장 배지로 옮깁니다. 진탕 인큐베이터에서 섭씨 30도 및 180RPM으로 샘플을 배양합니다.

광학 밀도가 0.7보다 커질 때까지 600나노미터에서 매시간 광학 밀도를 측정합니다. 다음으로, 10ml의 R2A 한천이 들어있는 다른 페트리 접시를 준비합니다. 그런 다음 R2A 육수 3.12g과 한천 8g을 증류수 1리터에 섞습니다.

혼합물을 섭씨 121도에서 15분 동안 오토클레이브합니다. 100 마이크로 리터의 메틸 박테리아 배양액을 한천 혼합물에 혼합합니다. 페트리 접시의 R2A 한천 바닥층에 메틸로박테륨 함유 젤 10ml를 붓고 증류수에 원하는 농도의 동결 건조은 MWCNT를 분산시킵니다.

마이크로피펫을 사용하여 이 분산액 50마이크로리터를 6x1mm 멸균 종이 디스크에 로드합니다. 증류수를 다른 멸균 종이 디스크에 대조군으로 바르십시오. 두 디스크를 모두 자외선 아래의 진공 챔버에서 30분 동안 건조시키고 살균합니다.

그런 다음 은 MWCNT 샘플과 대조군을 한천에 놓고 한천 플레이트를 섭씨 30도에서 48시간 동안 배양합니다. 완료되면 은 MWCNT 샘플 주변의 억제 영역을 측정합니다. 테스트 전에 섭씨 121도에서 15분 동안 삼중 증류수를 오토클레이브합니다.

이 멸균수에서 카르복실산 기능화 MWCNT의 밀리리터당 1000마이크로그램 분산액과 밀리리터당 50마이크로그램, 밀리리터당 40마이크로그램 및 밀리리터당 30마이크로그램 분산액을 준비합니다. 항균 테스트 절차를 시작하려면 앞서 설명한 대로 메틸로박테륨 배양을 준비하고 600나노미터에서 광학 밀도를 모니터링합니다. 광학 밀도가 최대일 때 100마이크로리터의 메틸로박테륨 배양액을 3밀리리터의 새로운 R2A 배양 배지에 접종합니다.

이 용액 500마이크로리터를 5개의 15밀리리터 원추형 튜브 각각에 놓습니다. 튜브 중 하나에 100마이크로리터의 메탄올을 추가하여 메탄올 기준 샘플을 준비합니다. 동일한 방식으로 4개의 분산액 각각에 대한 샘플을 준비합니다.

샘플과 나머지 메틸로박테륨 대조군 배양을 180 RPM 및 30°C에서 대조군의 광학 밀도가 최대 활성을 나타낼 때까지 배양합니다. 멸균된 스프레더를 사용하여 각 샘플을 펴십시오.amp페트리 접시의 고체 R2A 한천 젤에 넣습니다. 섭씨 30도에서 48시간 동안 접시를 배양합니다.

결과 박테리아 군집을 세고 최소 살균 농도를 결정합니다. 은 MWCNT는 기재된 절차를 사용하여 성공적으로 합성하였다. 평균 증착 된 은 입자 크기는 약 3.83 나노 미터였습니다.

메틸로박테륨 성장은 은 MWCNT의 밀리리터당 50마이크로그램 또는 밀리리터당 40마이크로그램 분산액으로 배양할 때 관찰되지 않았습니다. 박테리아 개체군은 은 MWCNT의 밀리리터당 30마이크로그램 분산액으로 배양했을 때 대조군 샘플에 비해 100, 000배 감소했습니다. 은 MWCNT의 밀리리터당 10마이크로그램 분산액으로부터 제조된 샘플 주변에서 억제 영역이 관찰되었습니다.

밀리리터당 1마이크로그램 분산액에서 제조된 샘플에 대해 억제 영역이 관찰되지 않았습니다. 은 MWCNT의 밀리리터당 40마이크로그램 분산액이 추가되었을 때 일부 세포 독성이 관찰되었습니다. 밀리리터당 30마이크로그램의 분산액을 첨가했을 때 유의미한 세포독성은 관찰되지 않았습니다.

트리판 블루 분석법은 은 MWCNTs의 밀리리터당 30마이크로그램 분산액을 첨가했을 때 최소한의 세포 독성이 있음을 확인했습니다. 이 프로토콜은 탄소 나노 물질에 직접 작용하는 금속 나노 입자를 가진 나노 복합체를 준비하는 연구원에게 도움이 될 것입니다. 이 프로토콜에 따라 연구원들은 준비된 나노 복합체의 항균 특성도 평가할 수 있습니다.