Name: 항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할 테스트 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 배우세요 다중 플라스미드가 항생제 내성 진화에 미치는 영향을 E. coli MG1655 균주를 이용한 실험 방법으로. 이 기술은 기본적인 분자생물학 기법만으로 세균 혁신 메커니즘을 연구할 수 있게 합니다.

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이 작품 Instituto de에 의해 지원 되었다 건배 카를로스 3 세 (Estatal 계획 데 나 + D + 내가 2013-2016 년): CP15-00012, PI16-00860 및 CIBER (CB06/02/0053), 공동 자금 유럽 지역 개발 기금 ' 유럽을 달성 하는 방법 ' 부여 (ERDF). 재는 마드리드 (2016-T1/바이오-1105)와 I의 지역의 정부의 Atracción 드 talento 프로그램에 의해 지원 + 스페인 정부의 드 Economía, 산업 y Competitividad (BIO2017-85056-P)의 D Excelencia. ASM Instituto de에서 미겔 세르 친교에 의해 지원 됩니다 건배 카를로스 3 세 (MS15/00012) 공동는 유럽 사회 기금에 의해 자금을 "당신의 미래에 투자" (ESF) 그리고 ERDF.

1. 항생제 저항 유전자를 인코딩 실험 시스템의 건설
참고: 여기 대장균 MG1655 플라스 미드 또는 염색체 인코딩 항생제 저항 유전자의 받는 사람 부담으로 사용 되었다. 항생제 저항 유전자는 염색체 또는 그렇지 않으면 isogenic 스트레인 (그림 1)에서 다중 플라스 미드에 인코딩됩니다.
<ol><li>
Λ 페이지 통합 사이트 (attB)20 MG1655의 염색체의 항생제 저항 유전자를 삽입
	<ol>
<li>증폭 PCR에 의해 염색체 attB 사이트의 양쪽에서 500 bp 긴 지역. Oligonucleotides YbhC-F를 사용 하 여 (5'-CCTGTACCGTACAGAGTAAT-3')와 attB-R (5'-GCCCGCCACCCTCCGGGCCGGTATAAAAAAGCAGGCTTCA-3')는 왼쪽된 상 동 지역 및 attB-F에 대 한 (5'-AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTATACTAACTTGAGCGAAA-3') 및 YbhB/R (5'- TGGCGATAATATTTCACCGC-3') 적당 한. 뇌관 Tem1-pBAD-F를 사용 하 여 구편-1 저항 유전자 증폭 (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3')와 Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3'). 약 20 뇌관 디자인 bp (5' 끝) 시퀀스 complementarity 조각에 융합 하는 것을 보여주는.</li>
		<li>퓨즈 (를 포함 하 여 그것의 발기인 지구) 항생제 저항 유전자 PCR 제품을 상 동 지역에서 30 분 동안 50 ° C 등온선 어셈블리21를 사용 하 여.</li>
		<li>Electroporate MG1655 세포 포함 플라스 미드 pKOBEG. 참고: pKOBEG는 λ를 포함 하는 열에 민감한 벡터 이다 빨간 기계, 염색체와 PCR 제품22사이의 homology 기반 유전자 교류를 추진.<ol>
<li>1.1.2 단계23 에서 제품의 1 µ L를 사용 하 여 4 ° C에서 2 mm 큐 벳에 electrocompetent 셀의 40 µ L 및 2.5 kV. Resuspend LB 국물 + 0.2 %arabinose λ의 식을 유지 하기의 1 mL에 빨간 기계 세포.</li>
			<li>Microfuge 관에 총 볼륨을 전송 하 고 염색체에 삽입 하 여 저항 마커의 phenotypic 표정 수 있도록 강렬한 떨고 (200 rpm 궤도 셰이 커에)와 30 ° C (pKOBEG에 대 한 허용 온도)에서 2 h를 품 어.</li>
			<li>LB agar 항생제 저항 유전자 (암 피 실린 또는 carbenicillin 즐편-1대 100 mg/l)에 대 한 선택 하려면 적절 한 항생제를 포함 하는 셀 접시</li>
		</ol>
</li>
		<li>100 µ L 한 페 트리 접시에 접시와 볼륨의 나머지 부분을 아래로 회전, 신선한 파운드 국물의 100 µ L에서 resuspend 다른 배양 접시에 접시. 42 ° c.에서 밤새 품 어 참고:이 온도 pKOBEG의 복제에 대 한 관대 한 비. 이러한 조건에서 성장할 수 식민지 pKOBEG 잃게됩니다와 attB 사이트에 통합 하는 저항 유전자를 발표할 예정 이다 (편의상이 긴장 이라고 불릴 것 이다 MG1655:가 리사 에 여기에서).</li>
		<li>페니와 함께 접시의 식민지를 복제 하 여 pKOBEG의 손실에 대 한 테스트 (어떤 pKOBEG에 대 한 항생제 저항 마커 포함). 참고: 30 º C의 허용 온도에서 페니 격판덮개에 성장의 부족은 플라스 미드의 부재의 지표.</li>
		<li>클론을 확인, PCR 증폭 외부 뇌관 YbhC Extern을 사용 하 여 건설 (5'-TTTGTGACCAGAAGACCGCA-3') 및 YbhB Extern (5'-CTCATCAGTAACGATCTGCG-3'), 젤 전기 이동 법을 통해 amplicon 시퀀스의 정확한 크기를 확인 합니다 삽입 된 유전자의 순서가 정확한 확인을 정화 제품.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
다중 플라스 미드에 항생제 저항 유전자를 삽입 합니다. 참고: 때문에 매우 높은 복사 번호와 플라스 미드 세균성 호스트 피트 니스에 큰 감소를 부과 하는 경향이, 좋습니다 복제, p3655 등의 자연의 기원과 다중 플라스 미드의 사용 (pSU18T-pBADgfp2, ColE1 형 원산지 복제24)입니다. 이 플라스 미드는 일반적으로 약의 적당 한 복사 번호를 제시 셀 당 15-20 복사본.<ol>
<li>PCR (발기인 지역 포함) 선택의 항생제 저항 유전자를 증폭 하 고 PCR 제품 phosphorylate 플라스 미드 PCR 증폭 중추에 선:<ol>
<li>PCR 증폭 항생제 저항 유전자; 즐편-1 사용 뇌관 Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3')와 Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3').</li>
			<li>정제 제품 제조업체의 지침에 따라 T4 polynucleotide 키를 사용 하 여 phosphorylate</li>
			<li>PCR 증폭 높은 중 합 효소와 oligonucleotides pBAD-F를 사용 하 여 플라스 미드 백본 (5'-CGTTGATCGGCACGTAAGAG-3')와 pBAD-R (5'-AAACGACGGCCAGTGCCAAG-3').</li>
			<li>T4-리가 사용 하 여 두 PCR 파편을 위하여 제조 업체의 지침에 따라.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Electroporate, 앞에서 설명한, 결 찰 제품 및 항생제 저항 유전자 (암 피 실린 또는 100 mg/L에서 carbenicillin에 대 한 적절 한 항생제 선택의 1 µ L의 최대 electrocompetent 대장균 DH5-α 세포의 40 µ L 즐편-1)에 대 한 및 플라스 미드 백본. 참고: arabinose 여기로 LB 보충 필요는 없습니다.</li>
		<li>독자의 선택의 상업적인 소형 예비 키트를 사용 하 여 플라스 미드를 추출:<ol>
<li>실 온에서 12000 x g에서 centrifuging 여 하룻밤 문화의 5 mL을 수확. Resuspend 물의 resuspension 솔루션의 250 µ L에서 세포와 섞어 잘. 세포의 용 해 솔루션의 250 µ L을 추가 하 고 잘 혼합. 중화의 350 µ L을 추가 하 고 잘 혼합.</li>
			<li>DNA 바인딩 열 키트, 1 분 동안 원심 분리기에서 제공 하는 상쾌한을 전송 하 고 삭제를 통해 흐름. 세척 솔루션, 1 분간 centrifuging와 각 세척에서 flowthrough 삭제의 500 µ L 열 두 번 씻는 다. 잔여 세척 버퍼를 제거 하려면 1 추가 분에 대 한 빈 열 원심</li>
			<li>깨끗 한 튜브는 열을 놓고 elute 순화 된 DNA를 막에 매우 순수한 물 50 µ L를 추가 합니다. 1-2 분 원심 하 고 흐름을 통해 순화 된 플라스 미드를 포함 하는 수집. 생어 시퀀스 삽입된 시퀀스 외부에서 뇌관을 사용 하 여 순서 올바른지 확인 없는 돌연변이 진화 실험 전에 저항 유전자에 존재 하는 플라스 미드의 유전자.</li>
		</ol>
</li>
		<li>일단 순서 확인 electroporate 대장균 MG1655 피로, 위에서 설명한 대로 플라스 미드. 참고:이 변형 생성 MG1655/바지.
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 실험적 진화 항생제 저항 (그림 1) 진화 구조 접근
<ol><li>파운드 플레이트에 연구 긴장 밖으로 행진: MG1655::가 리사 와 MG1655/바지 플러스 취약 부모의 스트레인, MG1655. 참고: 플라스 미드 바지 이어야 한다 MG1655, 안정 그래서 파운드 접시에 항생제를 추가할 필요가 없습니다. 변이 대장균 에 요금은 충분히 낮은 그래서 그것이 각 단계에서 플라스 미드 시퀀스를 확인 하는 데 필요한 건축 확인 합니다.</li>
	<li>각 잘에서 파운드의 200 µ L 96 잘 접시를 준비 하 고 (한 접시 스트레인 당) 독립적인 스에서 각 스트레인의 48 고립 된 식민지를 예방. 37 ° C와 200 rpm에서 하룻밤 접시를 품 어. 이러한 설립자 인구의 냉동된 재고 유지. 참고: 방지 하 고 96 잘 접시에서 문화 교차 오염에 대 한 제어, intercalating 96 잘 접시에 걸쳐 박테리아 없는 매체와 접종된 웰 스에 의해 바둑판 플레이트 설계를 사용 합니다. 이 플레이트 설계를 사용 하 여 전체 실험 진화 중.</li>
	<li>접종 2 µ L 새로운 96 잘 접시에 창시자 인구와 플레이트의 각 우물에서 연구에서 항생제의 하위 전공으로 각 잘에서 파운드의 198 µ L로 하 여 진화 구조 실험을 시작 합니다. 진화 구조 접근에 대 한 3 개의 긴장의 각각에 대 한 파운드에서 항생제의 ¼ 또는 최소 억제 농도 (MIC, 결정 이전25)의 1/8 시작 하 고 매일 항생제의 농도 두 번. 인구의 저항 돌연변이26취득 기회를 최대화 하기 위해이 방법을 사용 합니다. 37 ° C와 20 h 200 rpm에서 번호판을 품 어. 참고: 창시자 인구의 하룻밤 OD를 측정 합니다. 긴장 가운데 OD에 큰 차이가 있다면 잘 당 세포의 동일한 번호와 함께 실험을 시작 하는 초기 inoculum을 수정 합니다.</li>
	<li>매일, 야간 문화 후 각 모집단의 OD를 측정 하 고 2.3, 더블 전날 보다 항생제의 농도 가진 새로운 96 잘 접시에에서 설명 된 대로, 문화의 전송을 수행. 플레이트 20 h 37 ° c와 200 rpm을 품 어. 참고: 1: 100 희석 요인이 하루 약 6-7 세대 생산.</li>
	<li>동시에, 2.3 및 2.4, 하지만 항생제의 부재에 설명 된 대로 동일한 조건에서 각 변형의 컨트롤 인구를 전파 합니다. 참고: 제어 인구 항생제와 박테리아 실험 조건에 적응을 돕는 일반적인 돌연변이의 존재 때문에 발생 하는 돌연변이 사이 차별 도움이 됩니다. 병렬 돌연변이 항생제의 부재에서 발생 하는 박테리아 실험 조건에 적응 하도록 돕는 것 항생제 내성에 관련이 없습니다.</li>
	<li>600의 파장에서 흡 광도 측정 하 여 살아남은 인구 수 매일 추적 플레이트 리더를 사용 하 여 문화권의 nm (OD). 참고: 광학 밀도 값 0.1 나타냅니다 인구의 멸종 보다 낮은. 그림 2 생존 곡선의 예를 참조 하십시오.</li>
	<li>(3-5 일 마다) 모든 인구를 주기적으로 냉동된 재고 유지.</li>
	<li>[RStudio (버전 0.99.486)에 "생존" 패키지] 로그-순위 테스트를 사용 하 여 항생제12의 농도 증가 따라 시간이 지남에 다른 긴장의 인구의 생존에 통계적 차이 확인 하. 참고:이 실험 경우 다중 plasmids 약효는 특정 항생제 및 유전자 연구에 대 한 항생제 내성의 진화를 결정 합니다.</li>
</ol>3. 분자 기초 항 생 저항 (그림 1)의 진화의
<ol><li>인구와 클론의 대표 번호에서 전체 DNA 추출 긴장 및 치료 수행. 부모 긴장을 포함 (MG1655, MG1655::가 리사 와 MG1655/바지) 실험 기간 동안 축적 하는 돌연변이 검출 하기 수 있기를. 참고: DNA 추출 키트의 예에 대 한 자료의 표를 참조. 각 키트에는 다른 프로토콜; 제조업체 지침을 따릅니다.</li>
	<li>계량 DNA 품질 및 농도. DNA 품질 및 농도 확인 하기 위해 다른 방법이 있다. 260 nm/280 nm의 흡 광도 260 nm/230 nm의 비율을 측정 하는 품질을 결정 합니다. 형광, DNA 바인딩 염료를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 DNA 농도 측정 하 고 거기 확인을 agarose 젤 전기 이동 법이 DNA 저하 또는 RNA 오염.</li>
	<li>전체 인구 및 개별 샘플에서 사용 하 여 깊은 DNA 시퀀싱 항생제 내성의 유전 기초 조사를 복제 합니다. 참고: 우리는 인간 유전학, 옥스포드, 영국에 대 한 모든 시퀀싱 Wellcome 신뢰 센터에서 실시. 자세한 내용은 참조 산 밀란 외. 201612.</li>
	<li>Breseq 0.26.1 파이프라인27,28 를 사용 하 여 다형성 모드를 사용 하 여 인구에 있는 돌연변이의 주파수를 견적 하는 돌연변이 검출. 실험 기간 동안 축적 된 돌연변이 검출 하기 위하여 부모의 게놈을 다른 진화 게놈 비교 합니다.</li>
	<li>비교 그 인구 제어 인구에 있는 동시에 축적 된 돌연변이 돌연변이 박테리아 일반적인 실험 조건 (적응을 돕는 사이 분화 하는 항생제의 농도 증가에서 진화 그 제어 인구에서 발견) 그 항 생 저항 (항생제 압력을 복종 하는 인구에 독점적으로 그)에 관련 된. 참고: 병렬 돌연변이의 수 이므로 일반적으로 낮은 치료 사이 다른 병렬 변이 쉽게 평가 될 수 있다. 그것은 꽤 찾을 가능성이 연구 항생제 저항 유전자에 돌연변이 제외 하 고 다른 돌연변이 염색체에 항 생 저항, porins 또는 경과 시스템12같은 돌연변이와 관련 된.</li>
	<li>이 프로토콜의 섹션 1에서 동일한 방법을 사용 하 여 부모의 긴장에서 항생제 저항 유전자에 돌연변이 재구성 합니다. 1.1와 1.2 (를 사용 하 여 진화 유전자 PCR 템플릿으로) 부모의 배경에서 새로운 돌연변이 소개 하는 프로토콜의 포인트에 따라. 항생제 저항 phenotypes 돌연변이의 역할을 확인 하는 이러한 새로운 건축의 분석.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

우리는 분자 생물학, 실험 진화 및 다중 플라스 미드 박테리아에 항생제 내성의 진화에서의 역할을 조사 하도록 깊은 DNA 시퀀싱을 결합 하 여 새로운 프로토콜을 제시. 이 프로토콜은 다양 한 분야에서 기술을, 비록 그것을 개발 하는 데 필요한 모든 방법을 간단 하 고 일반 미생물학 실험실에서 수행할 수 있습니다. 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 아마 모델 시스템 긴장의 건설과 실험 진화 후 관찰 (이 정확한 동일한 메서드를 사용 하 여 수행 됩니다) 돌연변이의 재건 이다. 그러나, 등온선 어셈블리 시스템21, 분자 생물학에 있는 경험의 중간 수준 가진 모든 사용자가 구현할 수 있도록이 프로토콜 크게 단순화 합니다.
프로토콜의 또 다른 중요 한 단계는 항생제의 농도 증가에서 실험적인 발전 이다. 예를 들어,이 프로토콜 ¼-1/8의 긴장과 매일 항생제의 농도 두 배로 마이크의 실험을 시작 합니다. 그러나, 항생제의 더 낮은 비율 멸종<sup...

항생제 저항 박테리아에는 주요 건강 문제1입니다. 근본적인 수준에서 병원 성 박테리아에 항생제 내성의 확산은 자연 선택2,3진화의 간단한 예입니다. 간단히 말하면, 항생제를 사용 하 여 생성 내성 변종에 대 한 선택 합니다. 진화 생물학에 있는 중요 한 문제는 따라서, 항생제에 저항을 진화 세균성 인구 수에 영향을 주는 요소를 이해 하는 것입니다. 선택 실험 박테리아의 진화 생물학을 조사 하는 매우 강력한 도구로 등장 하 고이 필드 진화 문제4,,56의 넓은 범위에 대 한 놀라운 통찰력을 생산 하고있다. 실험 진화에서 단일 부모의 부담에서 시작 하는 세균성 인구는 정의 하 고 긴밀 하 게 제어 된 조건 하에서 passaged 직렬. 이러한 문화의 성장 하는 동안 발생 하는 돌연변이의 일부 세균 피트 니스, 증가 하 고 이러한 문화를 통해 자연 선택에 의해 확산. 실험 기간 동안 인구의 샘플 비 진화 냉동된 화석 레코드를 만들기 위해 주기적으로 저온 유지 됩니다. 박테리아 인구 진화 하 접근의 다양 한 숫자를 사용할 수 있지만 두 가지 가장 일반적인 방법 적합성 분석 실험, 그들의 먼 조상과 전체 게놈 시퀀싱, 즉 경쟁 진화 박테리아의 능력을 측정 하는 그 드라이브 적응 유전자 변화를 식별 하는 데 사용. 선구적인 작업 리처드 Lenski와 동료7,8, 다음 실험 진화에 표준 접근 복제 인구 수가 상대적으로 적은 도전 하고있다 (일반적으로 < 10)에 새로운 적응을 환경 문제, 새로운 탄소 소스, 온도, 또는 육 식 살 균 소 등입니다.
항생제 내성 박테리아에의 한 감염 저항 높은 만큼 환자 조직에 치명적인 수준 항생제 농도 증가 하는 것은 큰 문제가 된다. 임상 세균이 임계값 항생제 농도, 임상 중단점 이상 항생제의 과다 복용에 저항을 진화 하는 것을 허용 하는 무슨에 따라서 관심이. 이 실험적으로 연구 하는 방법? 세균성 인구 수가 적은 항생제의 높은 복용량으로 도전, Lenski 스타일에서 실험, 그리고 가장 가능성이 결과 경우 항생제 멸종을 모든 인구를 몰 것 이다. 같은 시간에 사용 되는 항생제의 복용량은 부모의 긴장의 최소 억제 농도 (MIC) 아래 낮은 경우 다음 가능성이 크다 세균성 인구 저항, 임상 관련 레벨을 진화 할 것 이다 특히 저항 큰 비용을 수행합니다. 이러한 두 가지 시나리오 사이의 한 타협 "진화 구조" 실험9,,1011을 사용 하는 것입니다. 이 방법에서는, 문화는 매우 큰 수 (일반적으로 > 40) 증가 시간이 지남에, 일반적으로 항생제 농도 두 배로 모든 주12항생제의 복용과 함께 도전 이다. 이 실험의 특징은 어떤 인구 증가 저항을 진화 하지 않는 멸종 구동 될 것입니다. 이 방법으로 도전 대부분 인구, 구동 하지만 작은 진화 하는 저항의 높은 수준으로 유지 됩니다. 이 문서에서 우리는이 실험 설계를 사용 하 여 저항의 진화에 다중 플라스 미드 기여를 조사 하는 방법을 보여줍니다.
박테리아는 두 가지 주요 노선, 염색체 돌연변이, 그리고 모바일 유전 요소, 주로 플라스 미드13의 인수를 통해 항생제에 저항을 취득. 플라스 미드 활용14,15박테리아 사이의 저항 유전자를 옮길 수 있기 때문에 항생제 내성의 진화에 중요 한 역할을 재생 합니다. 플라스 미드의 크기와 생물학에 따라 두 그룹으로 나눌 수 있습니다: "작은", 세균성 세포 및 "큰" 높은 사본 수, 낮은 복사 번호16,17. 항생제 내성의 진화에 큰 플라스 미드의 역할 그들은 저항 및 멀티 저항 박테리아15중 보급의 핵심 드라이버는 conjugative 플라스 미드를 포함 하기 때문에 광범위 하 게 문서화 되었습니다. 작은 다중 플라스 미드 박테리아17,18, 매우 일반적인 있으며 그들은 종종 항생제 저항 유전자19에 대 한 코드. 그러나, 항생제 내성의 진화에서 작은 다중 플라스 미드의 역할에 공부 되었습니다 했다.
최근 작품에서 우리는 다중 플라스 미드가 그들은 유전자 돌연변이 속도 셀12당 더 높은 유전자 복사본 수를 증가 하 여 수행 하는 유전자의 진화를 가속 수 제안. 그것은 다중 플라스 미드 3 세대에 대 한 저항을 부여 하는 가장-1 돌연변이의 외관의 속도 가속 표시 했다 E. 콜라이 긴장 MG1655 및 β-lactamase 유전자 즐편-1 실험 모델을 사용 하 여 cephalosporin ceftazidime입니다. 이러한 결과 표시 다중 플라스 미드 항생제 내성의 진화에 중요 한 역할을 재생 있습니다.
여기, 우리는 우리가 개발 하는 방법에 대 한 자세한 설명을 제시 다중 플라스 미드 중재 항생제 내성의 진화를 조사. 이 메서드는 세 가지 다른 단계: 연구는 다중 플라스 미드 또는 호스트 박테리아의 염색체에 유전자의 첫 번째, 삽입. 둘째, 선택적인 압력에 적응 하는 다른 긴장의 잠재력을 평가 하기 위해 실험 진화 (진화 구조)의 사용. 그리고 세 번째, 분자 기초 플라스 미드 중재 진화 DNA 시퀀싱 및 부모의 유전자 형에서 개별적으로 의심된 돌연변이 재구성을 사용 하 여 기본을 결정.
마지막으로, 여기에 설명 된 프로토콜 항생제 내성의 진화를 조사 하도록 설계 되었습니다, 비록 한 주장할 수 있다이 방법은 어떤 multicopy에 돌연변이 의해 취득 하는 혁신의 진화를 분석 하 일반적으로 도움이 될 수 있습니다. 플라스 미드로 인코딩된 유전자입니다.

<table><tbody><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BiorRad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation 큐벳</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z706078</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>흡광도 260nm/280nm 및 260nm/230nm</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Memmert</td>의 비율을 측정하는 DNA 품질 측정<td>UF1060</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터 (셰이커)</td><td>Cole-Parmer Ltd</td><td>SI500</td><td></td></tr><tr><td>전기영동 전원 공급 장치</td><td>BioRad</td><td>1645070</td><td>아가로스 젤 전기영</td></tr>동 <tr><td>챔버</td><td>BioRad</td><td>1704405</td><td>아가로스 젤 전기영동</td></tr><tr><td>피펫</td><td>Biohit</td><td>725020, 725050, 725060, 725070</td><td></td></tr><tr><td>멀티채널 피펫</td><td>Biohit</td><td>728220, 728230, 728240</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더 Synergy HTX</td><td>BioTek</td><td>BTS1LF</td><td></td></tr><tr><td>접종 루프</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8388</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Falcon</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>BD Difco</td><td>DF0446-17-3</td><td></td></tr><tr><td>LB 한천</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 중합효소</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F533S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Resctriction enzymes</td><td>Fermentas FastDigest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Plasmid extraction kit</td></tr><tr><td>Wizard Genomic DNA Purification Kit</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>gDNA 추출 키트</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & 조직 키트</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>gDNA 추출</td></tr><tr><td>키트 Electroporation 큐벳</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z706078</td><td></td></tr><tr><td>Petri 접시</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9054</td><td></td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>ClearLine</td><td>390701</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트(-80&ordm; C 저장)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>249945</td><td></td></tr><tr><td>QuantiFluor dsDNA System</td><td>Promega</td><td>E2670</td><td>Quantification of DNA concentartion</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioRad</td><td>1613100</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>50x TAE buffer</td><td>BioRad</td><td>1610743</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EK0031</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>EL0014</td><td></td></tr></tbody></table>

항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할 테스트

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

다중 플라스 미드는 원핵생물에서 매우 풍부 하지만 세균 진화에서 그들의 역할 제대로 이해 남아 있습니다. 우리는 최근에 증가 유전자 복사 셀 다중 플라스 미드를 제공한 당 플라스 미드로 인코딩된 유전자의 진화를 가속 수는 것을 보여주었다. 이 작품에서는, 우리는 유전자 진화를 촉진 하는 다중 플라스 미드의 능력을 테스트 하는 실험 시스템을 제시. 간단한 분자 생물학 방법을 사용 하 여, 우리는 항생제 저항 유전자 대장균 MG1655, 염색체 또는 다중 플라스 미드에 삽입할 수 있는 모델 시스템을 건설 한다. 우리 항생제의 농도 증가 따라 다른 변종을 전파 실험 진화 접근을 사용 하 고 우리는 시간이 지남에 세균성 인구의 생존을 측정. 선택 항생제 분자 그리고 저항 유전자는 유전자 돌연변이의 인수를 통해 저항을 부여만 수 있습니다. "진화 구조" 이렇게 항생제 내성의 획득 홍보 다중 플라스 미드의 잠재력을 테스트 하는 간단한 방법을 제공 합니다. 실험 시스템의 다음 단계에서는 항생제 내성의 분자 기초는 특징 이다. 돌연변이 식별 하기 위해 항생제 내성의 수집에 대 한 책임 우리가 사용 하 여 전체 인구와 클론에서 얻은 샘플의 깊은 DNA 연속. 마지막으로, 연구에서 유전자에 돌연변이의 역할을 확인, 우리 부모의 배경에서 그들을 재구성 하 고 테스트 결과 긴장의 저항 표현 형.

우리의 이전 작품에서 진화 β-lactamase 유전자 즐편-1 제 3 세대 cephalosporin ceftazidime12 에 저항을 부여 쪽으로 조사 되었다. 이 유전자는 돌연변이 즐편-1 편-1은 ceftazidime29등 cephalosporins의 활동의 범위를 확장할 수 있습니다 편-1 ceftazidime에 저항을 부여 하지 않습니다, 하지만 때문에 선정 되었다. Β-lactamases 등 수정 효소 활동의 그들의 범위에서 변화를 선도 하는 aminoglycoside 항생제 내성 효소에 있는 돌연변이 일반적인29,30. 이 실험 시스템은 효소의이 종류의 진화를 탐구 하는 것이 이상적입니다. 이 프로...

여기 우리는 항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할을 테스트 하는 실험 방법 제시.

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

이 실험 방법의 전반적인 목표는 항생제 내성의 진화에서 다중복사 플라스미드의 역할을 테스트하는 것입니다. 이 방법은 박테리아 혁신의 진화에서 멀티카피 플라스미드의 역할과 같은 미생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기본적인 분자 생물학 방법과 간단한 실험 설계만 필요하다는 것입니다.정말 멋지다. 먼저, 방정식 측 ATTB에서 람다 파지의 염색체에 항체 내성 유전자를 운반할 대장균 MG1655 균주를 구성합니다. 이를 위해 PCR은 ATTB 부위의 양쪽에 있는 500개의 염기 패럴롱 영역을 증폭합니다.그런 다음 PCR은 항생제 내성 유전자를 증폭시킵니다. 그런 다음 섭씨 50도에서 30분 동안 등온 어셈블리를 사용하여 상동성 영역을 PCR 산물에 융합합니다. 등온 조립 후, 제품 1마이크로리터를 40마이크로리터의 전기 사용 가능한 MG1655 셀에 2mm 큐벳으로 옮깁니다.그런 다음 섭씨 4도 및 2.5 킬로 볼트에서 셀을 전기 천공합니다. electroporation 후에, 0.2%arabinose를 가진 LB 국물의 1 밀리리터에 있는 세포를 옮기십시오. 그런 다음 세포가 들어있는 LB 육수를 마이크로 분리 튜브에 피펫으로 넣습니다.섭씨 30도에서 2시간 동안 튜브를 세게 흔듭니다. 2시간 후, 항생제를 보충한 LB 한천 플레이트에 배양액 100마이크로리터를 플레이트합니다. 그런 다음 나머지 셀을 스핀다운합니다.그리고 펠릿을 100마이크로리터의 신선한 LB 육수에 다시 현탁시킵니다. 이 세포를 다른 LB 한천 플레이트에 다시 플레이트합니다. 그런 다음 밤새 섭씨 42도에서 플레이트를 배양합니다.다음 날, PCR은 외부 프라이머 ybhC extern 및 ybhB extern을 사용하여 구축물을 확인하기 위해 클론을 증폭합니다. 그런 다음 아가로스 껍질 전기영동을 통해 앰플리콘 크기를 확인합니다. 이와 동시에 DNA 염기서열분석을 수행하여 삽입된 유전자의 염기서열을 확인합니다.멀티카피 플라스미드에 항체 내성 유전자를 운반하도록 균주를 구성하기 위해 먼저 PCR에서 항생제 내성 유전자 blaTEM-1을 증폭합니다. PCR이 완료된 후 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하여 증폭된 산물을 인산화합니다. 다음으로, 고충실도 중합효소 및 올리고뉴클레오티드 PBAD FINV 및 PBAD RINV를 사용하여 PBAD 플라스미드 골격을 PCR 증폭합니다.그런 다음 T4 리가아제를 사용하여 두 PCR 단편을 접합합니다. 다음으로, 40마이크로리터의 DH5 알파 셀을 1마이크로리터의 결찰 산물로 전기천공합니다. 그런 다음 항생제 내성 유전자와 한천 플레이트의 플라스미드 골격에 적합한 항생제를 선택합니다.그런 다음 제조업체의 지침에 따라 DNA 추출 키트를 사용하여 플라스미드 추출을 수행합니다. 그런 다음 관심 있는 저항성 유전자에 대해 생어 염기서열분석을 수행하여 진화 실험 전에 가능한 돌연변이가 없는지 확인합니다. 염기서열 확인 후, 대장균 균주 MG1655의 플라스미드를 전기천공하여 MG1655 균주를 운반하는 플라스미드를 최종적으로 얻습니다.이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 모델 시스템 균주의 구성과 실험적 진화 중에 관찰된 돌연변이의 재구성입니다. 먼저 LB 한천 플레이트에 관심 있는 MG1655 균주를 줄무늬로 만듭니다. 그런 다음 96웰 플레이트의 각 웰에 200마이크로리터의 LB 매체를 추가합니다.다음으로, 플레이트의 개별 웰에 각 균주의 분리된 콜로니 48개를 접종합니다. 접종 후 섭씨 37도의 셰이커에서 분당 200회전으로 밤새 플레이트를 배양합니다. 다시 말하지만, 각 웰에서 2마이크로리터의 배양물을 설립자 모집단과 함께 개별 웰에 198마이크로리터의 LB 배지가 있는 새로운 96웰 플레이트에 접종합니다.이것은 진화적 구조 실험을 시작할 것입니다. 섭씨 37도의 셰이커에서 20시간 동안 분당 200회 회전하는 플레이트를 배양합니다. 매일 항생제 농도를 전날보다 두 배로 늘리십시오.다음날, 각각의 배양액의 2 마이크로 리터를 신선한 96 웰 플레이트로 옮기고 매일 계속하십시오. 플레이트 리더의 개별 웰에서 600나노미터의 광학 밀도 판독값을 기록합니다. 프로토콜의 중요한 단계는 실험의 진화와 항생제의 농도 증가입니다.항생제 농도의 변화율은 항생제 내성의 진화를 촉진하기 위해 수정할 수 있는 매개변수 중 하나입니다. 다시 말하지만, 섭씨 37도의 셰이커에서 20시간 동안 분당 200회전으로 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 플레이트 리더에서 매일 생존하는 각 개체군에 대해 600나노미터의 광학 밀도 판독값을 측정합니다.3일에서 5일마다 주기적으로 개체군을 동결합니다. 진화된 개체군에서 전체 DNA를 추출하고 다른 균주 및 치료에서 클론을 추출합니다. 다음으로, 분광 광도계에서 260:280 및 260:230 나노미터에서 흡광도 비율을 측정하여 DNA의 품질을 결정합니다.그런 다음 형광 DNA 결합 염료를 사용하고 플레이트 리더에서 형광을 측정하여 DNA의 농도를 확인합니다. 또한 DNA에 아가로스 젤 전기영동을 적용하여 DNA 분해 또는 RNA 오염이 없는지 확인합니다. 그런 다음 전체 집단 및 개별 클론에서 얻은 샘플로 심층 DNA 염기서열 분석을 수행하여 항생제 내성의 유전적 기초를 연구합니다.이 연구는 세 가지 대장균 균주를 사용하는 실험 시스템의 가능한 결과의 예입니다. 이러한 균주는 대장균 MG1655, MG1655 resA 염색체에 내성 유전자를 가지고 있는 MG1655 및 멀티카피 플라스미드인 MG1655 pRESA에 내성 유전자를 가지고 있는 MG1655입니다. 사용되는 항생제는 세프타지딤과 메로페넴입니다.이 왼쪽 패널은 세프타지딤의 농도가 증가하는 하에서 생존 곡선을 보여줍니다. 이 그래프에서 MG1655 pRESA 균주의 개체군 하위 집합은 매일 세프타지딤 농도를 두 배로 늘린 후에도 14일 이상 성장할 수 있음이 분명합니다. 반대로, 다른 균주는 유사한 농도의 세프타지딤에 노출될 때 8일 이상 생존하지 못합니다.그러나 동일한 균주가 다른 항생제인 메로페넴의 유사한 농도에 노출되었을 때 생존 기간에 큰 차이를 보이지 않습니다. 이 세 가지 균주 모두 메로페넴에 노출되었을 때 6일에서 8일 사이만 생존합니다. 이는 멀티카피 플라스미드에 resA 유전자가 존재하면 세프타지딤에 대한 내성 진화를 강화하지만 메로페넴에 대해서는 그렇지 않다는 것을 나타냅니다.일단 숙달되면 제대로 수행되면 완전한 실험 프로토콜을 몇 주 내에 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 박테리아의 혁신 진화에서 멀티카피 플라스미드의 역할을 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

testing-role-multicopy-plasmids-evolution-antibiotic

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

여기서 우리는 주어진 대상 시퀀스에 대한 임의의 돌연변이 라이브러리를 작성하는 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 대장균의 생체내에서 수행됩니다이 방법은, 새로운 효소 활동을 진화하기 위해 기능 선택과 함께 할 수있는 방법을 보여줍니다.

에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균</em

출처: Erdogan, F.,et al., 박테리아 접합에 관여하는 전달 단백질의 서열 특이적 분석을 위한 접합 짝짓기 분석. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 구조 플라스미드를 사용하여 기증자에서 수혜자 대 장균 세포로 F 플라스미드를 전달하고 이중 항생제 내성을 통해 형질전환체를 선택하는 절차를 보여줍니다. 이 과정에는 박테리아 배양 혼합, 흔들림 없이 배양, 짝짓기 쌍 방해, 성공적인 플라스미드 전달을 확인하기 위한 선택적 배지에 도금하는 작업이 포함됩니다.

대장균의 F 플라스미드 전달 및 이중 항생제 선택

출처: Lea-Smith, DJ, et al. 모델 시아노박테리아 종에서 마크 및 마커가 없는 돌연변이체의 생성. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 시아노박테리아에서 항생제 표시 돌연변이를 생성하는 방법을 보여줍니다. 프로토콜은 시아노박테리아 배양으로 시작하여 표면 필리를 보존하는 원심분리 및 세척 단계가 이어집니다. 그런 다음 상동 서열 옆에 있는 항생제 내성 유전자를 운반하는 플라스미드를 도입합니다. 배양하는 동안 플라스미드는 필리를 통해 내재화되고 상동 재조합을 통해 표적 유전자를 대체합니다. 항생제 선택 및 재추출은 돌연변이 균주를 분리하고 정제하는 데 사용됩니다.

상동 재조합을 통한 시아노박테리아에서 항생제 표시 돌연변이체의 생성

Source: Escudero, J. A., et.al. Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates how escalating cefazidime exposure is used to compare the survival of three E. coli strains with different copies of the ampicillin resistance gene. It shows that only the strain with a multicopy plasmid survives at higher drug levels, highlighting how increased gene copy number accelerates resistance evolution.

Assessing the Role of Gene Copy Number in the Evolution of Bacterial Antibiotic Resistance 

이 프로토콜은 식품에서 클래스 1 인테그론 및 관련 유전자 카세트의 검출을 설명합니다.

클래스 1 Integrons 유전자 카세트 식품을 선별

우리는 항생제의 복제를 위한 이소제닉 항생제 저항하는 대장균의 도서관을 이용하는 플랫폼을 기술합니다. 박테리아 또는 곰팡이에 의해 생성된 항생제의 정체성은 각각의 내성 유전자를 발현하는 대장균의 성장에 의해 추론될 수 있다. 이 플랫폼은 경제적으로 효과적이고 시간 효율적입니다.

항생제 내성 플랫폼을 이용한 항생제 복제

우리의 실험적인 접근은 세균성 인구에 있는 plasmid 풍부하고 항생 저항을 시간이 지남에 따라 전략을 제공합니다.

실험적 진화 접근법에서 플라스미드 매개 항생제 내성의 정량화

여기에서는 물에서 항생제 내성 박테리아의 분리 및 식별과 항생제 내성 유전자(ARG)의 분자 특성 분석을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 배양 기반 및 비배양 기반(메타게놈 분석) 기술을 사용하면 인도 뭄바이의 담수에 존재하는 다양한 ARG의 총 박테리아 다양성과 총 풀에 대한 완전한 정보를 얻을 수 있습니다.

수인성 항생제 내성 박테리아의 분리 및 동정과 항생제 내성 유전자의 분자 특성 분석

접합은 두 개의 서로 다른 세포에 걸쳐 플라스미드 DNA를 동원하여 유익한 유전자의 확산을 촉진함으로써 수평적 유전자 전달을 매개합니다. 이 연구는 접합 플라스미드, 공여체 및 수용자에서 차등 마커를 사용하여 형질전환을 검출하는 것을 기반으로 접합 플라스미드 전달의 효율적인 검출을 위해 널리 사용되는 방법을 설명합니다.

대장균에서 천연 접합 플라스미드에 의해 매개되는 수평 유전자 전달의 검출

우리는 mini-Tn7 기반 발현 시스템을 사용하여 Acinetobacter baumannii의 조작된 유출 결핍 균주에 유출 펌프 유전자의 단일 복제 염색체 보완을 위한 손쉬운 절차를 설명합니다. 이 정밀한 유전 도구는 유전자 발현을 제어할 수 있으며, 이는 다제내성 병원체에서 유출 펌프의 특성 분석에 핵심입니다.

유출 결핍 박테리아 균주 및 단일 복제 유전자 발현 시스템을 사용한 Acinetobacter baumannii 의 다제 유출 시스템 특성 분석

배우세요 다중 플라스미드가 항생제 내성 진화에 미치는 영향을 E. coli MG1655 균주를 이용한 실험 방법으로. 이 기술은 기본적인 분자생물학 기법만으로 세균 혁신 메커니즘을 연구할 수 있게 합니다.

항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할 테스트

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