항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할 테스트

이 실험 방법의 전반적인 목표는 항생제 내성의 진화에서 다중복사 플라스미드의 역할을 테스트하는 것입니다. 이 방법은 박테리아 혁신의 진화에서 멀티카피 플라스미드의 역할과 같은 미생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기본적인 분자 생물학 방법과 간단한 실험 설계만 필요하다는 것입니다.

정말 멋지다. 먼저, 방정식 측 ATTB에서 람다 파지의 염색체에 항체 내성 유전자를 운반할 대장균 MG1655 균주를 구성합니다. 이를 위해 PCR은 ATTB 부위의 양쪽에 있는 500개의 염기 패럴롱 영역을 증폭합니다.

그런 다음 PCR은 항생제 내성 유전자를 증폭시킵니다. 그런 다음 섭씨 50도에서 30분 동안 등온 어셈블리를 사용하여 상동성 영역을 PCR 산물에 융합합니다. 등온 조립 후, 제품 1마이크로리터를 40마이크로리터의 전기 사용 가능한 MG1655 셀에 2mm 큐벳으로 옮깁니다.

그런 다음 섭씨 4도 및 2.5 킬로 볼트에서 셀을 전기 천공합니다. electroporation 후에, 0.2%arabinose를 가진 LB 국물의 1 밀리리터에 있는 세포를 옮기십시오. 그런 다음 세포가 들어있는 LB 육수를 마이크로 분리 튜브에 피펫으로 넣습니다.

섭씨 30도에서 2시간 동안 튜브를 세게 흔듭니다. 2시간 후, 항생제를 보충한 LB 한천 플레이트에 배양액 100마이크로리터를 플레이트합니다. 그런 다음 나머지 셀을 스핀다운합니다.

그리고 펠릿을 100마이크로리터의 신선한 LB 육수에 다시 현탁시킵니다. 이 세포를 다른 LB 한천 플레이트에 다시 플레이트합니다. 그런 다음 밤새 섭씨 42도에서 플레이트를 배양합니다.

다음 날, PCR은 외부 프라이머 ybhC extern 및 ybhB extern을 사용하여 구축물을 확인하기 위해 클론을 증폭합니다. 그런 다음 아가로스 껍질 전기영동을 통해 앰플리콘 크기를 확인합니다. 이와 동시에 DNA 염기서열분석을 수행하여 삽입된 유전자의 염기서열을 확인합니다.

멀티카피 플라스미드에 항체 내성 유전자를 운반하도록 균주를 구성하기 위해 먼저 PCR에서 항생제 내성 유전자 blaTEM-1을 증폭합니다. PCR이 완료된 후 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하여 증폭된 산물을 인산화합니다. 다음으로, 고충실도 중합효소 및 올리고뉴클레오티드 PBAD FINV 및 PBAD RINV를 사용하여 PBAD 플라스미드 골격을 PCR 증폭합니다.

그런 다음 T4 리가아제를 사용하여 두 PCR 단편을 접합합니다. 다음으로, 40마이크로리터의 DH5 알파 셀을 1마이크로리터의 결찰 산물로 전기천공합니다. 그런 다음 항생제 내성 유전자와 한천 플레이트의 플라스미드 골격에 적합한 항생제를 선택합니다.

그런 다음 제조업체의 지침에 따라 DNA 추출 키트를 사용하여 플라스미드 추출을 수행합니다. 그런 다음 관심 있는 저항성 유전자에 대해 생어 염기서열분석을 수행하여 진화 실험 전에 가능한 돌연변이가 없는지 확인합니다. 염기서열 확인 후, 대장균 균주 MG1655의 플라스미드를 전기천공하여 MG1655 균주를 운반하는 플라스미드를 최종적으로 얻습니다.

이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 모델 시스템 균주의 구성과 실험적 진화 중에 관찰된 돌연변이의 재구성입니다. 먼저 LB 한천 플레이트에 관심 있는 MG1655 균주를 줄무늬로 만듭니다. 그런 다음 96웰 플레이트의 각 웰에 200마이크로리터의 LB 매체를 추가합니다.

다음으로, 플레이트의 개별 웰에 각 균주의 분리된 콜로니 48개를 접종합니다. 접종 후 섭씨 37도의 셰이커에서 분당 200회전으로 밤새 플레이트를 배양합니다. 다시 말하지만, 각 웰에서 2마이크로리터의 배양물을 설립자 모집단과 함께 개별 웰에 198마이크로리터의 LB 배지가 있는 새로운 96웰 플레이트에 접종합니다.

이것은 진화적 구조 실험을 시작할 것입니다. 섭씨 37도의 셰이커에서 20시간 동안 분당 200회 회전하는 플레이트를 배양합니다. 매일 항생제 농도를 전날보다 두 배로 늘리십시오.

다음날, 각각의 배양액의 2 마이크로 리터를 신선한 96 웰 플레이트로 옮기고 매일 계속하십시오. 플레이트 리더의 개별 웰에서 600나노미터의 광학 밀도 판독값을 기록합니다. 프로토콜의 중요한 단계는 실험의 진화와 항생제의 농도 증가입니다.

항생제 농도의 변화율은 항생제 내성의 진화를 촉진하기 위해 수정할 수 있는 매개변수 중 하나입니다. 다시 말하지만, 섭씨 37도의 셰이커에서 20시간 동안 분당 200회전으로 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 플레이트 리더에서 매일 생존하는 각 개체군에 대해 600나노미터의 광학 밀도 판독값을 측정합니다.

3일에서 5일마다 주기적으로 개체군을 동결합니다. 진화된 개체군에서 전체 DNA를 추출하고 다른 균주 및 치료에서 클론을 추출합니다. 다음으로, 분광 광도계에서 260:280 및 260:230 나노미터에서 흡광도 비율을 측정하여 DNA의 품질을 결정합니다.

그런 다음 형광 DNA 결합 염료를 사용하고 플레이트 리더에서 형광을 측정하여 DNA의 농도를 확인합니다. 또한 DNA에 아가로스 젤 전기영동을 적용하여 DNA 분해 또는 RNA 오염이 없는지 확인합니다. 그런 다음 전체 집단 및 개별 클론에서 얻은 샘플로 심층 DNA 염기서열 분석을 수행하여 항생제 내성의 유전적 기초를 연구합니다.

이 연구는 세 가지 대장균 균주를 사용하는 실험 시스템의 가능한 결과의 예입니다. 이러한 균주는 대장균 MG1655, MG1655 resA 염색체에 내성 유전자를 가지고 있는 MG1655 및 멀티카피 플라스미드인 MG1655 pRESA에 내성 유전자를 가지고 있는 MG1655입니다. 사용되는 항생제는 세프타지딤과 메로페넴입니다.

이 왼쪽 패널은 세프타지딤의 농도가 증가하는 하에서 생존 곡선을 보여줍니다. 이 그래프에서 MG1655 pRESA 균주의 개체군 하위 집합은 매일 세프타지딤 농도를 두 배로 늘린 후에도 14일 이상 성장할 수 있음이 분명합니다. 반대로, 다른 균주는 유사한 농도의 세프타지딤에 노출될 때 8일 이상 생존하지 못합니다.

그러나 동일한 균주가 다른 항생제인 메로페넴의 유사한 농도에 노출되었을 때 생존 기간에 큰 차이를 보이지 않습니다. 이 세 가지 균주 모두 메로페넴에 노출되었을 때 6일에서 8일 사이만 생존합니다. 이는 멀티카피 플라스미드에 resA 유전자가 존재하면 세프타지딤에 대한 내성 진화를 강화하지만 메로페넴에 대해서는 그렇지 않다는 것을 나타냅니다.

일단 숙달되면 제대로 수행되면 완전한 실험 프로토콜을 몇 주 내에 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 박테리아의 혁신 진화에서 멀티카피 플라스미드의 역할을 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.