Name: 유사 분열 동안 염색체 분리의 라이브 셀 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 배우세요 유사 분열 중 염색체 분리를 라이브 셀 이미징으로 관찰하는 방법을 Histone2B-GFP BacMam 2.0과 스피닝 디스크 공초점 현미경을 사용하여 배양 세포에서 염색체 역학을 연구하는 기술입니다.

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우리는 박사 Guo Chiuan 웅와 박사 Bharatkumar 조시 원고를 개선 하는 소중한 의견에 감사 하 고 싶습니다.

이러한 연구에서 실시 한 모든 실험 프로토콜 식품 및 의약품 안전 청 (FDA) 연구 시설에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인에 따라 수행 했다.
1. 격리와 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)의 문화
<ol><li>표준 프로토콜 7,,89마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs) PP2A-B56γ-마우스 긴장과 야생 타입 littermates에서를 격리 합니다.</li>
	<li>ExpandMEFs 3 구절에 대 한 동결 하 고 실험 8필요할 때까지 저장 합니다.</li>
</ol>2. 2-잘 연 발된 커버 유리에 대 한 자란 Mefs 라이브 영상
<ol><li>MEF 성장 미디어 Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM/F12)를 포함 하는 10%의 500 mL를 준비 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1 X 페니실린/스 항생제, L-글루타민 (200 m m) 및 비 본질적인 아미노산 (NEAA) 500 mL 미디어 병에서 X 1.</li>
	<li>37 ° c.에 미리 데워 진된 물 욕조에 통로 3에서 야생 타입에서 냉동된 MEFs와 PP2A-B56γ-생쥐의 병 동</li>
	<li>전송 15 mL 튜브에 MEFs를 해 동 하 고 천천히 10 mL 피 펫을 사용 하 여 15 mL 튜브에 DMEM/F12 미디어의 dropwise 20 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>T75 플라스 크에서 DMEM/F12 성장 매체의 20 mL와 함께 MEFs를 전송 하 고 셀 70% 합칠 때까지 그들을 확장 합니다. Confluency 4 x 또는 10 x 배율에서 역 현미경을 사용 하 여 추정 된다.</li>
	<li>Aspirate 유리 방목 지를 사용 하 여 성장 매체 후드에 진공 시스템에 부착 된 플라스틱, 0.25 %trypsin / EDTA의 3 mL를 추가 하 고 반응을 중지 DMEM/F12 성장 매체의 5 분 추가 3 ml 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>낮은 속도 (300 x g) 실 온에서 5 분 동안에 세포 원심 조심 스럽게는 상쾌한을 제거 하 고 다시 물 욕조에 37 ° C에 미리 데워 DMEM/F12 성장 매체의 1 mL에 셀 펠 릿을 중단.</li>
	<li>Trypan 블루 제외 방법 또는 다른 적절 한 셀 계산 방법 8을 사용 하 여 셀을 열거 합니다.</li>
	<li>2-잘 연 발된 커버 유리에 MEFs/잘 씨 약 20000. 200 µ L/잘 DMEM/F12 성장 매체를 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 그들을 하룻밤 배양 하 여 연결할 셀을 허용.</li>
</ol>3입니다. 동기화
<ol><li>DMEM/F12 성장 미디어 0.1%를 포함 하는 세포를 배양 하 여 G0/G1 단계에서 MEFs를 동기화 G0/G1 단계에서 최대 셀 수를 24 h, FBS. 참고: 지금까지 혈 청 기아는 기본 설정의 방법으로 사용 되었다, 비록에 다양 한 다른 방법 mitotic 무대 체포 10을 셀 필요에 따라 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 라벨
<ol><li>1.5 m g/mL DMSO에 nocodazole의 재고 솔루션을 준비 합니다. Nocodazole는 microtubule 형성 10을 억제 하 여 G2/M 단계에서 셀을 체포.</li>
	<li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq2.jpg"> </li><li> </li></ol><ol><li><ol><li><li></ol></li><li><li><li><li><li></li><li><li><li><li><ol><li><li></ol></li><li> </li><li></ol><ol><li><li><li><ol><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li></li><li></ol></li><li><li><li></ol>

<ol><li>Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+in+CIN%3A+Mitotic+Infidelity+and+Its+Consequences+for+Tumor+Promotion+and+Suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression.</a> Dev Cell. 39, 638-652 (2016).</li>
<li>Etemad, B., Kops, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+issues%3A+kinetochore+transformations+and+spindle+checkpoint+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing.</a> Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).</li>
<li>Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+assembly+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The spindle assembly checkpoint.</a> Curr Biol. 22, 966-980 (2012).</li>
<li>Jallepalli, P. V., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+and+cancer%3A+cutting+through+the+mystery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery.</a> Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+protein+CSPP1+interacts+with+CENP-H+protein+to+coordinate+accurate+chromosome+oscillation+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis.</a> J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).</li>
<li>Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+detection+and+implication+of+genome+instability+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The detection and implication of genome instability in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).</li>
<li>Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+phosphatase+2A+B56%CE%B3+regulatory+subunit+is+required+for+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The protein phosphatase 2A B56γ regulatory subunit is required for heart development.</a> Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells+Suitable+for+Culturing+Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (64), e3854(2012).</li>
<li>Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP2A-B56%CE%B3+is+required+for+an+efficient+spindle+assembly+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">PP2A-B56γ is required for an efficient spindle assembly checkpoint.</a> Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).</li>
<li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).</li>
<li>Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+LINC+complex+recruitment+at+nuclear+indentation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites.</a> Sci Rep. 8 (4), 7362(2014).</li>
<li>Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26904940">The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity.</a> Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).</li>
<li>Iuso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+Expression+of+Human+Protamine+1+%28hPrm1%29+Remodels+Fibroblast+Nuclei+into+Spermatid-like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures.</a> Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).</li>
<li>Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+perspectives+on+stem+cell-based+therapies+undergoing+clinical+trials+for+regenerative+medicine%3A+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+Bull%22%5BJournal%5D)">Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies.</a> Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

정확한 염색체 분리를 보장 하는 세포 주기 통제 검문소 방지 이수성 및 셀 변환 1,2,3. 현재 연구에서 우리는 PP2A B56γ의 그 비활성화 발견 약화 스핀 들 어셈블리 검사점 귀착되 었 다. 라이브 셀 이미징을 사용 하 여 nocodazole 9PP2A B56γ MEFs 유사 분열 동안 염색체 미 분리 처리를 관찰할 수 있었습니다.
이 프로토콜 Histone2B GFP 라벨 라이브 셀 이미징에 대 한 레이블 염색체 BacMam 2.0 기술에 의해 생성 된 사용 합니다. 라벨에 중요 한 단계 중 하나는 셀 라벨 충분 한 달성 하기 위해 (PPC) 당 입자의 권리 금액을 계산 하 고 있습니다. 그것은 10-50 PPC 적합 적정을 통해 발견 되었다. 이 시 약; 세포에...

다음 프로토콜에서 우리 염색체 분리 및 마우스 미 발달 섬유 아 세포 히스톤 2B-GFP, BacMam 2.0 라벨 및 라이브 셀 이미징 사용 하 여에서 세포 주기 동안 mitotic 진행을 시각화 하는 편리한 방법을 설명 합니다.
세포 주기 통제 검문소 염색체 분리를 모니터링 하 고 셀 1,2,3의 유전 무결성의 유지 관리에 중요 한 역할. 미 분리 된 염색체의 이수성, 가장 단단한 종양 4의 특징은 발생할 수 있습니다. 따라서, 후행 염색체의 염색체 불안정성을 공부 하는 방법으로 사용할 수 있습니다.
붙일 표시 또는 라이브 염색체 분리를 시각화 하는 데 사용 하 고 mCherry 태그의 생성 하지만 후행 염색체 단백질 수 태그 H2B GFP 단백질 유전자 전달 및 분자 생물학 5의 상당한 지식이 필요 합니다. 여기는 CL-HB는 리 젠 트, 편의 위해이 전화 CellLight Histone2B GFP BacMam 2.0 시 약의 사용에 설명 합니다. 이 시는 즉시 사용할 수 있습니다 하 고 따라서 벡터 품질 및 무결성에 대 한 우려를 제거 합니다. 또한,이 시는 잠재적으로 유해한 치료 또는 지질 및 염료 선적 화학 물질의 사용을 필요 하지 않습니다. 기존의 형광 라벨, 달리 CL-HB 리 젠 트 기능에 독립적으로 얼룩 (즉., 막 잠재력). CL HB 리 젠 트를 단순히 셀에 추가 하 고 단백질 식 밤새 껏 알을 품 수 수 있습니다. CL HB 섭정 포유류 세포에서 복제 하지 않습니다 그리고 biosafety 수준 (BSL) 1 실험실 설정에서 사용할 수 있습니다. 또한, 가장 역동적인 세포 분석을 수행 하 후 최대 5 일까지 충분 한 시간 동안 야간 보육이 과도 transfection은 감지할 수 있습니다.
또는, 염색체 이상이 cytometry, immunohistochemistry 또는 형광 제자리 교 잡 (물고기) 6등 다양 한 기법에 의해 공부 될 수 있었다. Cytometry는 이수성, 측정 될 수 있는 DNA 콘텐츠 및 세포 주기 세포의 단계에 따라 공부를 사용할 수 있습니다. Cytometry 이수성을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다, 하지만 그것은 염색체 미 분리에 정보를 제공 하지 않습니다. 물고기와 immunohistochemistry 기술 DNA 또는 염색체에 바인딩할 형광 프로브를 사용 합니다. 이러한 기술은 세포의 인구 상태 스냅숏을 제공, 그들은 라이브 셀 이미징 함으로써 특정 셀 시간의 기간 동안 다음에 cytokinesis spatiotemporal 시각화를 통해 얻은 정보를 누락을 허용 하지 않습니다.
이 프로토콜은 지체 염색체 또는 염색체 미 분리 취급 하는 nocodazole 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)에 PP2A-B56γ-마우스에서 분리 연구 하 사용 되었다. 응용 프로그램 위에 이외에,이 프로토콜 레이블 및 세포 주기 규칙을 공부 하는 데 사용할 수 있는 다양 한 셀 형식에 염색체 분리 또는 종양 세포의 염색체 불안정을 시각화 하는 간단한 도구를 제공 합니다. 또한, 그것은 또한 사용할 수 있습니다 다양 한 약물 치료에 의해 발생 하는 염색체 불안정을 공부 하거나 유전자 염색체 미 분리의 결과로 밖으로 노크의 효과 연구.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액 (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>EMD Millipore</td><td>MX 1458-6</td><td></td></tr><tr><td>극저온 바이알 보관 상자</td><td>Fisherbrand</td><td>10-500-28</td><td></td></tr><tr><td>극저온 바이알</td><td>Corning/costar</td><td>431416</td><td></td></tr><tr><td>T75 플라스크</td><td>Cellstar</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>2 웰 챔버 커버 유리</td><td>Nunc</td><td>155380PK</td><td></td></tr><tr><td>셀로미터 비전 셀 프로파일러</td><td>Nexcelom Bioscience LLC</td><td>셀로미터 비전 트리오</td><td></td></tr><tr><td>노코다졸</td><td>시그마</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>CellLight 히스톤 2B-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>C10594</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Cell Observer 회전 디스크 컨포칼 현미경 시스템</td><td>Carl Zeiss</td><td>현미경 Zeiss Cell Observer SD</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Thermoscientific</td><td>280 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Sanyo 상용 솔루션</td><td>MCO-18AIC (UV)</td><td></td></tr> <tr><td>클래스 II 생물 안전 캐비닛</td><td>The Baker Company</td><td>SterilGard</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td>Ver.4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>National Institute of Health</td><td>Ver. 1.51r</td><td></td></tr></tbody></table>

유사 분열 동안 염색체 분리의 라이브 셀 이미징

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

염색체 해야 안정적이 고 균일 하 게 분리 되어 딸 세포에 mitotic 세포 분열 동안. 염색체 분리의 충실도 스핀 들 어셈블리 검사점 (SAC)을 포함 하는 여러 메커니즘을 통해 제어 됩니다. SAC 모든 염색체 kinetochores microtubules 스핀 들에 첨부 하지 않으면 세포 유사 분열 진행의 예방에 대 한 책임은 복잡 한 피드백 시스템의 일부입니다. 염색체 지체 및 비정상적인 염색체 분리 역 기능 세포 주기 통제 검문소의 표시기 이며 셀 분할의 게놈 안정성을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다. SAC의 규제 완화는 염색체 분리 중 오류의 축적을 통해 악성 세포로 정상 세포의 변화에 발생할 수 있습니다. SAC의 구현 및 복잡 한 kinetochore의 형성 단단히 kinases와 단백질 인산 가수분해 효소 2A 등 인산 가수분해 효소 사이 상호 작용에 의해 규제 됩니다 (PP2A). 이 프로토콜 마우스 미 발달 섬유 아 세포 했다 PP2A B56γ 규제 소 단위의 녹아웃 쥐에서 고립에서 염색체를 후행의 라이브 셀 이미징을 설명 합니다. 이 방법은 다른 세포 주기 제어 이미징 기술 cytometry 또는 immunocytochemistry 같은 염색체의 동적 spatiotemporal 시각화 대신 셀 cytokinesis 상태 스냅숏을 제공의 단점을 극복 동안 유사 분열.

야생 유형 및 PP2A-B56γ-마우스에서 MEFs 2-잘 챔버 커버 유리에 시드 되었고 첨부할 수 있습니다. 하루에 2, MEFs는 0.1%를 사용 하 여 동기화 했다 FBS 24 h에 대 한. 하루 3, MEFs 미디어에서 200 ng/mL에 nocodazole 및 30 PPC CL-HB regentwere 37에서 18 h incubated° C, 5 %CO2. 하루에 4, 셀은 회전 디스크 confocal 현미경 시스템 (그림 1)를 사용 하 여 몇 군데 있었다. 라이브 세포 이미징 그들은 유사 분열 (그림 2)를 통해 NEBD에서 진행으로 개별 셀의 운명을 시각화 하는 데 사용 되었다. Nocodazole는 G2M 단계에 microtubule 형성 방해 하 여 체포 하는 야생 타입 셀으로 알려져 있습니다. 세포 분열 ...

이 프로토콜 레이블 및 라이브 염색체 mitotic 세포 Histone2B GFP BacMam 2.0 레이블 및 회전 디스크 confocal 현미경 시스템을 사용 하 여 시각화 하는 간단 하 고 편리한 방법을 설명 합니다.

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

이 방법의 전반적인 목표는 Histone 2B-GFP BacMam 2.0 라벨과 회전 디스크 컨포칼 현미경 시스템을 사용하여 유사분열 세포의 살아있는 염색체를 라벨링하고 시각화하는 것입니다. 이 방법은 배양된 세포의 유사분열 염색체를 시각화하여 염색체 분리에 대한 유전자 변형 또는 약물 치료의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유사분열 세포에서 살아있는 염색체를 라벨링하고 시각화하는 쉽고 편리한 방법을 제공한다는 것입니다.라이브 이미징 절차를 시연하는 것은 FDA 생물제제 평가 및 연구 센터(FDA Center for Biologics Evaluation and Research)의 바이러스 제품 부서에서 현미경 및 이미징 핵심 시설을 유지 관리하는 Kazuyo Takeda 박사입니다. 이 실험에 사용된 마우스 배아 섬유아세포(MEF)는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 하룻밤 사이에 섭씨 37도, 5%CO2의 2웰 챔버 커버 유리에서 성장합니다. 다음 날, 0.1%FBS를 포함하는 DMEM/F12 성장 배지에서 배양하여 G0/G1 단계의 MEF를 동기화합니다.라벨링 당일, DMSO에서 노코다졸의 1.5 밀리리터 스톡 용액을 준비하십시오. 중요한 단계는 세포에 대한 독성 없이 염색체 시각화를 위한 충분한 표지를 달성하기 위해 세포당 적절한 양의 CL-HB 입자를 계산하는 것입니다. 당사는 이전에 적정 실험을 통해 30 PPC가 가장 효과적이라고 결정했습니다.MEF에 10%FCS가 포함된 200마이크로리터의 성장 배지, 노코다졸 밀리리터당 200나노그램 및 세포당 30개의 입자가 있는 CL-HB 시약을 추가합니다. MEF를 섭씨 37도 및 5%CO2에서 18시간 동안 배양합니다. MEF의 시각화는 환경 챔버와 오일 이멀젼, 63X 대물 렌즈가 장착된 회전 디스크 컨포칼 현미경 시스템을 사용하여 수행됩니다.이미징 하루 전에 환경 챔버 전원을 켜고 전체 챔버를 섭씨 37도에서 밤새 예열합니다. 다음 날에는 현미경 스탠드, 카메라, 회전 디스크 장치, 조명기, 아르곤 레이저, 컴퓨터 및 전동 스테이지의 전원을 켭니다. 시스템을 3분 동안 예열한 후 점화 키를 켜서 아르곤 레이저를 시작합니다.아르곤 레이저의 토글 스위치를 대기에서 레이저 실행으로 전환합니다. 데이터 수집 및 처리 소프트웨어를 실행합니다. 스테이지 상단 인큐베이터의 CO2 컨트롤러를 시작하고 CO2 농도를 5%로 설정합니다.인큐베이터에서 챔버 커버 유리를 제거하고 현미경 스테이지에 놓고 오일 이멀젼 63X 대물 렌즈를 선택합니다.접안 렌즈를 통해 보고, 이미지의 초점을 맞추고, 핵막 파괴(NEBD) 단계에 있는 세포를 식별합니다. 488나노미터 아르곤 레이저를 시작하여 Histone 2B-GFP를 시각화합니다. 획득 제어 창을 열고 GFP 채널의 노출 시간을 설정합니다.NEBD에 있는 셀을 식별합니다. 그런 다음 세포의 상단 및 하단 초점면을 수동으로 결정하고 XYZ 광학 절편 설정을 입력합니다. 20분 동안 세포를 관찰합니다.모든 세포가 유사분열을 거치는 것은 아니기 때문에 유사분열 진행을 적극적으로 모니터링해야 한다는 점을 인식하는 것이 중요합니다. 세포가 20분 후에도 세포 분열을 진행하지 않으면 이미지 획득을 중지하고 NEBD에 있는 다음 세포로 이동합니다. 영화에 대한 데이터를 얻으려면 3분마다 사진을 촬영합니다.방추체 어셈블리 체크포인트에서 탈출한 PP2A-B56-감마 세포에서 유사분열 중 지연된 염색체를 이미지화하는 데 세포당 약 1시간이 필요합니다. 추가 분석을 위해 이미지를 ZVI 파일 형식으로 저장합니다. 라이브 셀 이미징은 NEBD에서 유사분열을 통해 진행됨에 따라 개별 세포의 운명을 시각화하는 데 사용되었습니다.노코다졸 치료 후, 관찰된 21개의 야생형 세포가 모두 중기에서 정지되었습니다. 대조적으로, PP2A-B56-감마가 결핍된 21개 세포 중 16개 세포가 노코다졸 치료 후 유사분열을 거칠 수 있었습니다. 또한, 이러한 MEF 중 13개에서 비정상적인 염색체 분리가 감지되었습니다.이 비디오 클립에는 염색체 오분리를 겪고 있는 PP2A-B56-gamma 세포의 예가 나와 있습니다. 이 기술을 완전히 익히면 라벨링 프로토콜 이전의 세포 처리에 따라 3-4일이 소요됩니다. 이는 일시적인 transfection이며 신호는 최대 5일까지만 검출할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.이 프로토콜은 세포주기 조절, 게놈 불안정성 및 세포 치료제의 품질과 관련된 추가 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 1차 세포주, 줄기 세포, 뉴런 및 불멸화된 T 세포와 같은 다양한 세포주에서 염색체의 라이브 이미징을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 Histone 2B-GFP BacMam 2 라벨 및 회전 디스크 컨포칼 현미경 시스템을 사용하여 유사분열 세포의 살아있는 염색체를 쉽게 라벨링하고 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

live-cell-imaging-of-chromosome-segregation-during-mitosis

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기 이미지는 기본 프로토콜을 설명하고 siRNA의 transfection 후 라이브 포유 동물 조직 배양 세포의 mitotic 타이밍을 계량.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

출처: Schumacher, D., 그리고 Sogaard-Andersen, L. 느리게 성장하는 사회성 박테리아 Myxococcus xanthus 의 완전한 영양 세포 주기의 형광 생세포 영상. J. Vis. Exp. (2018)이 영상은 박테리아 세포 분열 중 형광 태그된 염색체 기원을 추적하기 위해 생세포 영상을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 타임랩스, 위상 차이 현미경 및 형광 현미경을 사용하여 염색체 분리 역학을 포착합니다.

형광 표지 박테리아의 염색체 분리 타임랩스 영상

신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

선물이 HeLa 세포 분석 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다음의 더블 티 미 딘 동기화에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 동기적으로 S 단계에서 또한 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할에 대 한 연구를 활성화 하는 유사 분열을 진행 하는 셀의 많은 수를 얻기에 키.

유사 분열 동안 다기능 세포 주기 단백질의 역할을 연구 하기 Mitotic 세포 동기화와 고해상도 Confocal 현미경 검사 법

라이브 셀 이미징 고정된 셀 이미징 혼자 여 달성 하지 않은 단일 셀 이나 전체 인구에 풍부한을 정보를 제공 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 프로토콜 안티 mitotic 마약 paclitaxel와 치료 다음과 세포 운명 결정을 평가 하는 설명 합니다.

장기 라이브 셀 이미징 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 평가 하

여기에서, 우리는 연구원이 유사분열과 만두증 도중 살아있는 핵분열 효모 세포에 있는 단백질 행동 그리고 핵 역학을 공부하는 것을 허용하는 비 독성 현미경 검사법인 살아있는 세포 화상 진찰을 제시합니다.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

세포 분열은 형광성 으로 태그된 단백질 및 시간 경과 현미경 검사법을 사용하여 실시간으로 구상될 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜을 사용하여 사용자는 세포 분열 타이밍 역학, 유사분열 스핀들 어셈블리 및 염색체 의회 및 분리를 분석할 수 있습니다. RNA 간섭 (RNAi)-매개 유전자 녹다운 다음 이 사건에 있는 결점은 평가되고 정량화될 수 있습니다.

세포 분열의 살아있는 화상 진찰을 위한 초파리 S2 세포의 사용

여기에서 우리는 스핀들 형성 및 유사분열 진행의 역학을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 타임랩스 이미징을 적용하면 사용자가 유사분열의 다양한 단계에서 세포를 식별하고, 유사분열 결함을 추적 및 식별하며, 항 유사분열 약물에 노출될 때 스핀들 역학 및 유사분열 세포 운명을 분석할 수 있습니다.

미토틱 스핀들 교란에 따른 메타페이즈 타이밍 및 세포 운명의 역학을 평가하기 위한 라이브 셀 이미징

타임 랩스 현미경은 신진 효모에서 감수 분열을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 프로토콜은 세포 주기 동기화, 타임랩스 현미경 검사 및 표적 단백질의 조건부 고갈을 결합하여 감수 분열 염색체 분리 동안 특정 단백질의 기능을 연구하는 방법을 설명하는 방법을 설명합니다.

S. cerevisiae에서 감수 분열을 연구하기 위해 타임 랩스 현미경 및 단백질의 단계 별 핵 고갈 사용

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

배우세요 유사 분열 중 염색체 분리를 라이브 셀 이미징으로 관찰하는 방법을 Histone2B-GFP BacMam 2.0과 스피닝 디스크 공초점 현미경을 사용하여 배양 세포에서 염색체 역학을 연구하는 기술입니다.

유사 분열 동안 염색체 분리의 라이브 셀 이미징

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