Name: 정상적인 대 장 암과 대 장 암-향상 된 프로토콜에서 인간의 내 피 세포의 고립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: 배우세요 대장암과 정상 대장 조직에서 순수하고 활력 있는 내피 세포를 분리하는 방법을. FACS 분류와 면역세포화학을 활용하여 혈관 생성 연구와 약물 테스트에 활용할 수 있는 세포를 얻습니다.

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우리는 기독교 Flierl, Katja Petter, 크리스티나 Schnürer (모든 사단의 분자 및 실험적인 수술), Uwe Appelt, 감사 (코어 단위 FACS 정렬) 마이클 Mroz와 우수한 기술 지원에 대 한 사이먼 Völkl (코어 단위 FACS-Immunomonitoring). 이 작품은 EN/ms 협 센터의 교부 금에 의해 임상 연구 (IZKF) 대학 의료 센터 에를랑겐, 독일 연구 재단의 지원 되었다 (DFG: 2438, s p 2에 대 한)와 루 츠 재단, 로버트 Pfleger 재단의 권한을 부여 하 여 독일 연구 재단에서 MS에 게 수 여 교부 금에 의해 뿐만 아니라 VSS [DFG: KFO257 (하위 프로젝트 4), SFB 796 (하위 프로젝트 B9)].

격리 프로세스 대학 의료 센터 에를랑겐 (#159_15, B TuMiC 연구)의 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다. 환자 포함 기준을 다음과 같이 했다: CRC, UICC 무대-4, 선 동적인 장 질병의 역사 없이 그리고 neoadjuvant 치료.
1. 수술 및 단일 셀 격리에 대 한 조직의 준비
<ol><li>CRC 환자에서 수술으로 견본을 얻기 (암 조직 > 0.5 g, 중앙 비 괴 사 성 종양, 정상적인 대 장 조직 > 종양 사이트에서 먼 10 cm).</li>
	<li>얻은 조직 조각은 대부분 < 1 g, 암에 대 한 하지만 > 일반 콜론에 대 한 1 g. 경우 조각 > 1 g 얻을 수 있습니다, 조직 처리에 대 한 신선한 메스를 사용 하 여 여러 개의 1 g 조각으로 그들을 분할. 참고: 종양 조직 조각 발병에서 0.5 g이 하 있는 경우에, 고립 일반적으로 실패 합니다.</li>
	<li>수집 신선한 떼어낸 조직 조각 얼음 차가운 행 크 균형 소금물 (HBSS) 페니실린/스/amphothericin B 보충의 40 mL에 메 마른 집게를 사용 하 여 (1 %HBSS-펜/strep/ampho) 50 mL 원심 분리기 튜브에 신속 하 게 그들을 전송 하 고는 실험실입니다. 참고: 콜론 조직은 매우 자주 발병에서 박테리아/곰 팡이로 오염 됩니다. 절연의 전체 절차 동안 펜/strep/ampho 오염 유기 체를 없애기 위해 모든 솔루션에 추가 합니다.</li>
	<li>4 회 이상 40 mL 얼음으로 각 조직 조각 씻어 감기 HBSS-펜/strep/ampho (단계 1.3 참조) 소독 집게를 사용 하 여 다음 튜브를 한 원심 분리기 튜브에서 순차적으로 조직 조각을 전송 하 여 50 mL 원심 분리기 튜브에.<ol>
<li>70% 에탄올과 각 단계 후 깨끗 한 겸 자.</li>
		<li>별도 집게를 사용 하 여 암 및 정상적인 결 장 조직 조각.</li>
		<li>모든 조직 조각 무게. 참고: 조직 조각 무게에 대 한 규모에 직접 넣지 마십시오. 세척, 후 포함 하는 조직 전에 조직 조각을 입력 한 후 마지막 원심 분리기 튜브 무게. 개별 조직 조각의 무게 빼기 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 단일 셀 서 스 펜 션의 생성
참고: 그것은 항상 습기를 공급 하는 조직 유지를 권장.
<ol><li>그것은 존재 하는 경우 연결 된 지방, 다른 비 tumorous 조직, 또는 잠재적으로 괴 사 성 조직 부분에서에서 제거 수술 표본 소독 집게를 사용 하 여 살 균 세포 문화 배양 접시에서 조직 조각을 전송 하 여 합니다.<ol>
<li>조직 조각 HBSS-펜/strep/ampho의 3-5 mL을 추가 하 여 항상에 moisturized 유지.</li>
		<li>신선한 멸 균 메스 (그림 1)를 사용 하 여 조직 조각을 정돈 한다. 조직 식별 명확 하지 않습니다 경우에 병리학을 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>작은 조각으로 남은 티슈를 말하다 (약 2 × 2 × 2 mm3) 곡선된 블레이드와 신선한 메스를 사용 하 여. 조직 조각 조직 분리 튜브 (예를 들어 gentleMACS C 관)로 살 균 겸 미리 미리 따뜻하게 (37 ° C) 세포 배양 매체 (Dulbecco´s 수정이 글 중간 [DMEM] 기저 매체) 제조 업체의에 따르면 가득 전송 지침입니다. 참고: 락 도구 처럼 메스를 사용 하려고 합니다. 조직 손상을 방지 하기 위해 셀을 짠 다 하지 않습니다.</li>
	<li>인간의 조직 프로그램 "37C_h_TDK_1"는 manufacturer´s 다음 지침을 사용 하 여 종양 분리 키트와 함께에서 (gentleMACS Octo Dissociator)와 같은 조직 dissociator를 사용 하 여 다이제스트/해리 조직 조각</li>
	<li>실 온 (RT)에서 300 x g에서 1 분 동안 분리 튜브 원심</li>
	<li>미리 데워 진된 (37 ° C) 0.5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) (DMEM 로우) 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 각 튜브를 보충 DMEM의 10 mL을 추가 하 고 세포 현 탁 액 셀 pipetting으로 50 mL 원심 분리기 튜브 위에 셀 스 트레이너 (100 µ m 기 공 크기)를 사용 하 여 필터링 필터 위에 현 탁 액입니다.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫에 의해 각 맥 관을 다시 DMEM 로우의 10 mL를 추가 하 고 나머지 50 mL 원심 분리기 튜브 위에 셀 스 트레이너를 전송.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 낮은 DMEM 매체의 추가적인 10 mL와 한 번 셀 여과기를 세척.</li>
	<li>RT에 300g x 7 분 세포 현 탁 액을 원심 하 고 상쾌한 삭제.</li>
	<li>미리 데워 진된 내 피 기저 매체 (EBM)-2의 5 mL에 셀 resuspend-microvascular (MV) 매체 (Lonza) 펜/strep/ampho 같은 50 mL 원심 분리기 튜브에 보충.</li>
	<li>플레이트 세포 현 탁 액 중 1.5% 젤라틴 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 5% CO2와 37 ° C에서 하룻밤 코팅 T-25 셀 문화 술병에.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2에서 24 h에 대 한 셀을 품 어, 약 5 mL PBS의 신중 하 게 두 번 셀을 세척 하 고 신선한 매체의 5 mL을 추가.</li>
	<li>중간 갱신의 48 h 간격으로 80-90 %confluency (일반적으로 5-7 일)까지 37 ° C, 5% CO2 에서 세포를 배양.</li>
</ol>3입니다. FACS 정렬 내 피 세포의
참고: 어떤 시점에서 예를 들어 단일 시 관에 있는 세포의 외피에 얼룩 절차를 제한 하 여 세포 손실을 방지 하려고.
<ol><li>Accutase (약 10 분)의 1 mL로 세포를 분리 하 고 미리 따뜻하게 (37 ° C) EBM-2-MV 매체의 4 개 mL를 추가.</li>
	<li>장치 (범위 10-25 µ m)를 계산 하는 자동화 된 셀을 사용 하 여 셀 수를 결정 합니다.</li>
	<li>RT에서 250 x g 4 분에 대 한 세포 현 탁 액을 원심 하 고 상쾌한 삭제.</li>
	<li>미리 따뜻하게 FACS-버퍼에 셀 resuspend (1x PBS, 2.5% 소 혈 청 알 부 민 [BSA], 5 mM EDTA pH 8.0, 10 µ M Y-27632) 세포 수 (5 x 106/mL)에 따르면.</li>
	<li>추가 셀 수/FACS-버퍼 볼륨에 따라 항 체 FACS 얼룩: CD31 FITC (100 µ L/mL = 1/10), CD144/혈관 내 피 (VE)-cadherin-PE (100 µ L/mL = 1/10), CD105 APC (25 µ L/mL = 1/40), 혼합 및 빛;에서 보호 하는 RT에 7 분 동안 품 어 부드럽게 터치 하 고 (총 보육 시간 15 분)에 대 한 또 다른 8 분 동안 품 어.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 레이블이 지정 된 셀 서 스 펜 션에 FACS 버퍼의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>RT에서 250 x g 4 분 centrifuge 고 상쾌한 삭제.</li>
	<li>FACS 버퍼의 2 개 mL를 추가 하 여 두 번 씻어 RT에 250g x 4 분에 대 한 후속 원심 분리를 실시 하 고 상쾌한 삭제.</li>
	<li>미리 따뜻하게 EBM-2-MV-펜/strep/ampho의 500 µ L 셀 및 FACS 정렬 악기에 전송 셀 resuspend.<ol>
<li>FACS 장비 냉각 하는 경우 내 피 세포 신속 하 게 정렬 과정에서 죽을 것 이다. 따라서, RT에서 내 피 세포의 분류를 수행 하 고 즉시 전송 수집된 셀 37 ° C 배양 기에 나중. 참고: FACS 장비는 일반적으로 살 균!</li>
	</ol>
</li>
	<li>정렬/수집 트리플-긍정적인 세포 세포 문화 요리 (예를 들어, 미리 코팅 하룻밤 1.5% 젤라틴-PBS는 24-잘 접시)에 직접 미리 데워 진된 신선한 매체 (EBM-2-MV-펜/strep/ampho)의 0.5 mL으로 가득 합니다. 참고: 현미경을 사용 하 여 정렬 한 후 세포 현 탁 액을 확인 합니다. 경우 셀 클러스터 함께, 천천히 그들을 혼합 하거나 매체를 추가 하 여 셀 문화 접시에도 세포 분포를 얻을 하려고 합니다.</li>
	<li>48 h 간격 중간 갱신의 90-100 %confluency 세포를 배양 하 고 원하는 문화 접시 크기를 셀 확장 (24-잘 접시 → 12 잘 판 → 3.5 cm 접시 → T-25 → T-75).</li>
</ol>4. 수확 및 순수 내 피 세포의 특성
<ol><li>90-100 %confluency 세포를 수확 하 고 적절 한 방법 (예를 들어, FACS, cytochemistry, 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량), 또는 내 피 세포 기능 분석 실험7,8) 특징.</li>
	<li>격리 된 셀 중 특성화 방법 선택을 분석 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in health and disease.</a> Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).</li>
<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+life%2C+disease+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li>
<li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in cancer and other diseases.</a> Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).</li>
<li>McDonald, D. M., Choyke, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+angiogenesis%3A+from+microscope+to+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic.</a> Nat Med. 9 (6), 713-725 (2003).</li>
<li>Hurwitz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bevacizumab+plus+irinotecan%2C+fluorouracil%2C+and+leucovorin+for+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin for metastatic colorectal cancer.</a> N Engl J Med. 350 (23), 2335-2342 (2004).</li>
<li>Naschberger, E., Schellerer, V. S., Rau, T. T., Croner, R. S., Stürzl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from human tumors.</a> Methods Mol Biol. 731, 209-218 (2011).</li>
<li>Schellerer, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+of+human+colorectal+cancer+and+healthy+colon+reveal+phenotypic+differences+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells of human colorectal cancer and healthy colon reveal phenotypic differences in culture.</a> Lab Invest. 87 (11), 1159-1170 (2007).</li>
<li>Naschberger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matricellular+protein+SPARCL1+regulates+tumor+microenvironment-dependent+endothelial+cell+heterogeneity+in+colorectal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Matricellular protein SPARCL1 regulates tumor microenvironment-dependent endothelial cell heterogeneity in colorectal carcinoma.</a> J Clin Invest. 126 (11), 4187-4204 (2016).</li>
<li>St Croix, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+expressed+in+human+tumor+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes expressed in human tumor endothelium.</a> Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).</li>
<li>Christian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosialin+%28Tem1%29+is+a+marker+of+tumor-associated+myofibroblasts+and+tumor+vessel-associated+mural+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Endosialin (Tem1) is a marker of tumor-associated myofibroblasts and tumor vessel-associated mural cells.</a> Am J Pathol. 172 (2), 486-494 (2008).</li>
<li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+breast+tumor-derived+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells.</a> Oncol Rep. 15 (2), 381-386 (2006).</li>
<li>Miebach, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microvascular+endothelial+cells+from+gliomas+of+different+WHO+grades%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades.</a> J Neurooncol. 76 (1), 39-48 (2006).</li>
<li>Richard, L., Velasco, P., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+immunomagnetic+protocol+for+the+selective+isolation+and+long-term+culture+of+human+dermal+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple immunomagnetic protocol for the selective isolation and long-term culture of human dermal microvascular endothelial cells.</a> Exp Cell Res. 240 (1), 1-6 (1998).</li>
<li>Nourse, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+induces+differentiation+of+functional+endothelium+from+human+embryonic+stem+cells%3A+implications+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">VEGF induces differentiation of functional endothelium from human embryonic stem cells: implications for tissue engineering.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (1), 80-89 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

주로, 세 가지 다른 방법 인간의 단단한 조직, 즉 (1) immunomagnetic 농축, (2) 레이저 기정, 및 (3) FACS-정렬 EC 분수의 순수 하 고 유력한 자문위와 TECs 격리 하기 위해 지금까지 고용 되었다 있다. 대부분의 출판물에서 기계 해체에 의해 단일 세포 현 탁 액의 세대 후의 세포 immunomagnetic 농축 사용된11,,1213이었다. 예를 들어 immunomagnetic 정화의 인간의 피부 microvascular EC (HDMEC) 전자 selectin 항 체에 의해 후에 종양 괴 사 인자 (TNF)-신생아 속하고13 에서 α 치료 glioma에서 인간의 EC의 격리에 대 한 조직에 의해 보고 되었습니다 소화, percoll 그라데이션, 그리고 안티-CD31/CD105 VE cadherin 항 체12를 사용 하 여 선택 또는 인간에서 안티 CD105 항 체에 의해 유 방 암11. 프로토콜을 레이저 서 또는 FACS 정렬 고용 덜 자주 보고 되었습니다. 레이저 기정 사용 되었다, 예를 들어 잠재적인 팬-종양을 식별 하기 위해 EC에서 내 피 세포 마커 (대금)에서 파생 된 인간 대 장 암 세포의 분석 해 부9후 즉시. FACS 정렬 안티-CD31-항 체를 사용 하 여 성공적으로 시연 했다 EC 분수의 격리에 대 한 미 분화 인간 배아에서 줄기 세포14.
이러한 접근 방법은 서로 다른 장점과 단점을 고려해 야 할 수 있다. Immunomagnetic 기반 접근 방식에 대 한 장점은 정교한 장비는 필수, 선택 언제 든 지 수행할 수 있습니다 및 셀 농축은 FACS 정렬에 비해 빠른 (약 15 분) (약 1 시간). 시간이 더 긴 기간에 대 한 매트릭스의 부족 anoikis에 의해 EC의 세포 죽음을 유도 수 있습니다. 따라서, FACS 버퍼에로 키 니 아 제 억제 물 Y-27632의 추가 셀 anoikis15를 방지 하기 위해 고용 되었다.
Immunomagnetic 농축의 단점은 선택의 여러 라운드는 순도 99% 이상 달성 하는 데 필요한입니다. 또한, 풍부 사이 세포 배양이 세포 복구, 문화 유물 문화 유도 지원의 나이 증가 필요 합니다. 서 레이저는 셀 수 있는 이점 사용 즉시 문화 유도 유물 감소 하지만 인접 조직 영역10에서 세포에 의해 오염 위험을 포함. 또한, 기정 하지 모든 실험실에서 설정 됩니다. FACS 정렬-기반 접근 방법의 단점 포함, 레이저 서, 장비는 정교 하 고 비용 많이 비슷합니다. 따라서,이 장비 하지 액세스할 수 있습니다 언제 든 지. 임상 설정에서 어디 관심의 조직 가용성은 정확 하 게 계획 될 수 없습니다,이 더 불리를 추가할 수 있습니다.
그러나, FACS 정렬의 주요 장점은 EC 분수 병렬로 여러 항 체에 의해 표시 될 수 있습니다. 따라서, 엄격한 제어 전략을 사용할 수 있습니다 고 순도 보장 합니다. 경험을 바탕으로, 이전 맥 기반 프로토콜 선택의 여러 라운드를 고용 했다 달리 필요 했다 아니 다시는 EC 분수의 정렬. 이 결과 향상 된 세포 생존 능력 분석의 연장된 시간 창 활성화에 FACS 접근에 3 주를 6 주 (맥 접근)에서 순도까지 크게 감소 재배 시간 이끌어 냈다. 마지막으로, FACS 정렬-기반 전략을 사용 하 여, 전반적인 절연 성공률의 개선 될 수 (12.5% 증가)를 달성. 결론적으로, FACS 정렬 기준 동시에 전략 고용 3 항 체 결합된 기계 및 효소 조직 소화에 의해 조직 다이제스트 TECs의 격리에 대 한 선택의 방법으로이 프로토콜에 설정 된 수많은 장점을 했다 그리고 인간의 대 장 암 및 콜론에서 자문위입니다.

종양 microenvironment (TME)와 내 피 세포 (EC), pericytes, 섬유 아 세포, 평활 근 세포, 면역 세포 등 세포의 구성 된 종양 기질 종양 세포의 가까운 상호 작용으로 정의 됩니다. 이러한 세포 구획 간의 통신 기질, 또는 직접 셀 접촉 paracrine 요인 (예, 신생 성장 인자, cytokines)에 의해 구동 수 있습니다. Stromal 구획 육성 하거나 중화 종양 개시 또는 특정 TME 설립에 따라 진행.
선박 시스템으로 연결 하는 종양의 능력 진행 및 질병의 전이 핵심입니다. 선박 시스템 종양을 주로 산소와 영양소의 공급 뿐만 아니라 폐기물1,2,3의 제거에 액세스할 수 있습니다. EC, 혈관의 안쪽 표면 구성 되며 따라서이 과정에 적극적으로 참여 하는 중요 한 세포 구성 성분. 그것은 잘 알려진 종양 내 피 세포 (TEC) 그들의 해당 정상 내 피 세포 (NEC) 혈관 트리, 선박 시키는 방해 계층 등의 많은 기능에 의해 다른 또는 성숙의 감소 된 수에 의해 exemplified 감소 pericytes/벽화 EC4에 느슨하게 연결 된 셀입니다.
따라서, TECs 발암 연구에 귀중 한 셀룰러 도구입니다. TECs 주로 종양 성장과 진행3육성로 간주 됐다. 따라서, TECs 모니터링을 허용 하는 바이오 센서 및 시작, 포스터, 또는 tumorigenesis 중화 하는 병원 성 프로세스의 id로 사용할 수 있습니다. 또한, 그들은5클리닉 치료 대상입니다. 따라서, 격리 TECs 및 해당 자문위도 사용할 수 있습니다 도구로 응답 또는 안티-신생 치료에 저항을의 메커니즘을 이해 하.
과거에는, 우리가 이러한 셀6,7 을 프로토콜 개발과 TECs는 뿐만 아니라 다른 자문위, 하지만 또한 그들은8에서 파생 했다 TME 다릅니다 서로 확인. 이 접근 방식을 통해 보였다 TECs 특정 TMEs에 종양 성장과 진행에 적극적으로 중화 수 있습니다 SPARCL1 같은 안티-신생 종양 진압 단백질의 분 비에 의해. 이 TECs 인간 대 장 암 (CRC)8에서 prognostically 유리한 TME의 설립에 적극적으로 기여 하는 것을 나타냅니다.
이전 연구 단단한 종양에서 인간의 TECs 격리 하려고 했습니다. 이러한 연구의 중요 한 목표를 했다, 예를 들어, 새로운 종양 내 피 세포 마커 (대금)9의 식별. TECs 레이저 서 변경 피하기 위하여 적용 된 후의 즉각적인 사용 또는 문화에 TEC 표현 형의 손실의 전략. 그러나, 후속 연구 식별이 접근10의 심각한 단점으로 벽 세포의 오염 인구. 연구소는 순수 하 고, 가능한 TECs 인간의 CRC 환자6,7에서 격리를 허용 하는 프로토콜 개발 처음 이다. 격리 된 EC 문화의 순도 보장 TECs의 여러 자기 셀 선택 (MAC) 라운드와 접근 선정 되었다. 그러나,이 방법은 비교적 긴 재배 기간 평균 (6 주), 문화 유도의 위험을 증가 하는 필요 합니다. 따라서, 다음 단계에서 목표는 수술과 수확의 첫 번째 순수 문화 사이 재배 시간을 줄이기 위해 이었다. 이 목표를 달성 하기 위해, 초기 종양의 결합 된 기계 및 효소 기반 조직 분리를 채용 하는 향상 된 프로토콜 다음 형광 활성화 된 세포 (FACS) 정렬-개발 되었다 트리플 레이블 EC의 정렬. 이 감소 격리 시간 평균 3 주, 순수 TEC와 NEC 문화 증가 생존 기능 연구와 결과. 높은 성공률을 인간의 조직에서 실행 가능한 순수 TEC와 NEC 문화의 격리 환자가 특정 약물 개별된 치료 regimens의 개발 하는 동안 테스트에 대 한 새로운도 열 수 있습니다. 격리 접근은 다음 단락에서 상세 하다.

<table><tbody><tr><td>HBSS 1x</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14175-053</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>암포테리신 B</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>메스, 일회용</td><td>Feather</td><td>No. 23</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS 옥토 해리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-937</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C-tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>인간 종양 해리 키트</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2-MV BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer, 100 &micro; m</td><td>팔콘</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase&nbsp;</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수기, 자동</td><td>Coulter Counter</td><td>Z1</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>CD31-FITC</td><td>BD Pharmingen 555445</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD144/VE-cadherin-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>560410</td><td></td></tr><tr><td>CD105-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>소 가죽에서 추출한 젤라틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>FACS-분류 장치</td><td>Beckman Coulter</td><td>MoFlo XDP</td><td></td></tr></tbody></table>

정상적인 대 장 암과 대 장 암-향상 된 프로토콜에서 인간의 내 피 세포의 고립

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

1 차 셀 인간의 carcinomas에서 격리는 질병 개발 및 진행에 기여 하는 병원 성 메커니즘을 식별 귀중 한 도구입니다. 내 피 세포 (EC), 혈관의 안쪽 표면을 구성 직접 종양, 산소 공급, 영양 공급, 및 폐기물을 제거에 참여 하 고 그로 인하여 눈에 띄게 종양의 헌법에 관련 된 특히, microenvironment (TME)입니다. 종양 내 피 세포 (TECs) 종양 및 stromal 세포 간의 통신에 의해 설립 intratumoral microenvironment의 바이오 세포 센서로 사용할 수 있습니다. TECs 또한 치료의 대상으로 제공합니다. 따라서, 문화 이러한 세포 응답 또는 안티-신생 치료에 저항 메커니즘에 연구 수 있습니다. 최근, TECs 인간 대 장 암 (CRC)에서 전시 메모리 효과에서 파생 된 그들은 특정 TME에 따라 절연 발견 했다. 또한, 이러한 TECs 적극적으로 기여할 특정 TME의 설립에 다른 요인의 분 비에 의해. 예를 들어 prognostically 유리한 Th1 TME에 TECs 안티 신생 종양 진압 인자 분 비 단백질, 시스테인 같은 1 (SPARCL1)에서 풍부 하 고 산 성 분 비. SPARCL1 선박 항상성 조절 하 고 억제 하는 종양 세포 증식 및 마이그레이션. 따라서, 순수 하 고, 가능한 TECs 인간의 단단한 종양에서 고립의 문화 tumorigenesis에 혈관 시스템의 역할에 대 한 기능 연구를 위한 유용한 도구가 있습니다. 여기, CRC로 서 정상적인 콜론에서 기본 EC의 격리에 대 한 새로운 최신 프로토콜을 설명 합니다. 소화 기계 및 효소 조직, immunolabeling, 및 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)를 기반으로 하는 기술-트리플-긍정적인 세포 (CD31, VE cadherin CD105)의 정렬. 이 프로토콜을 가능한 TEC 또는 정상적인 내 피 세포 (NEC) 문화 수 FACS 정렬 대상이 62.12%의 성공률와 함께 결 조직 으로부터 분리 (41 순수 EC 문화 66 조직 샘플에서). 따라서,이 프로토콜 정상적인 결 장 및 CRC에서 인간의 EC 문화를 분리 하는 강력한 접근 방식을 제공 합니다.

NEC와 결합 된 기계/enzymatical 조직 분리, 뒤에 후속 CD31/CD105/VE cadherin-기반 FACS-정렬에 의해 인간의 CRC에서 TEC의 절연 설명 여기 (그림 1A). 이 프로토콜을 이전 맥 기반 프로토콜7에 비해 순수 하 고, 가능한 내 피 세포의 첫 번째 수확까지 시간 단축된 창으로 향상 된 프로토콜을 나타냅니다.
NEC와 TEC 다음 단계를 사용 하 여 인간의 CRC에서 고립 되었다: (1) 결합 된 기계 및 효소 조직 분리 하 여 단일 세포 현 탁 액의 생성 및 80-90 %confluency (그림 1), 이러한 세포의 성장 (2) 트리플 EC의 라벨 CD31/CD105/VE-cadherin 형광 색소 결합 항 체, 고 (3) FACS 각각 트리플-긍정적인 세포 (그림 2A)의 정렬. 메모의 중요 한 단계 격리 절차의 성공과 세포의 생존을 위해 신속 하 게 절차의 대상이 수술 표본은 격리 (단일 세포 현 탁 액의 세대 &lt; 절제 후 1 시간). FACS 정렬, 12500 TEC의 평균을 사용 하 여 (n = 12) 및 17800 NEC (n = 12, 그림 2B, 왼쪽) 3.6의 평균 및 총 세포 인구 (그림 2B, 오른쪽)의 5.6%를 대표 하는 격리 될 수. 그 후, 셀 T-75 (통로 1 나) 및 수확 하거나 추가 처리에 대 한 분석까지 확장 했다. 이전 맥 기반 프로토콜을 사용 하 여 메모의 49.6%의 평균 절연 성공을 달성 했다 (n = n에서 58 순수 TECs = 117 환자8) 순수 EC와 문화 사용할 수 평균 수술 후 6 주. 여기 설명 새로운 FACS 기반 프로토콜을 사용 하 여, 최초의 순수 EC 문화 가져온 평균는 격리 62.1%의 성공률와 함께 수술 후 3 주 (n = n에서 얻은 순수한 41 EC 문화 = 66 단일 세포 FACS 정렬 대상이 정지). 따라서, 12.5%에 의해 격리 율의 증가 3 주에 6에서의 재배 시간 감소와 동시에 달성 했다. 재배 시간이 감소 향상 된 세포 생존 능력을 지도 하 고 덜 노출 설립 문화의 잠재적인 문화 종속의 유도에 의해 동반 하는 수명 연장.
EC 순도 CD31-cytochemistry(그림 3)에 의해 처음 실시 됐다. 문화 CD31-부정적인 세포 (그림 3A, TEC와 NEC) 없는 경우에, 그들은 반전 녹음 방송 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (실시간 정량 Pcr) (그림 3B) 입력 자세한 셀을 받게 했다. EC (CD31, CD105, VE cadherin 및 폰 Willebrand 요인 [vWF]), 백혈구 (CD45), 상피 세포 (cytokeratin [CK]-20), 그리고 부드러운 근육 세포/섬유 아 세포 (desmin)에 대 한 셀 형 특정 뇌관 사용 되었다 (그림 3B). 입력, 0.1-의 범위에서 다른 셀으로 EC 문화의 잠재적인 오염 2%, 셀 유형에 따라이 정량 기반 셀을 사용 하 여 검색 된8될 수 있습니다.
특히, 우리는 이전 그들의 해당 선관위 문화7에 비해 TEC 문화에 vWF 단백질 식의 특혜 손실 보고. 이러한 연구 결과 새로 설립된 된 격리 프로토콜 확인 수 (그림 3C, 의미 Ct 손실 NEC-TEC 0.687, p = = 0.173, t-검정 한 쌍). 성공적으로 이러한 품질 컨트롤을 전달 하는 문화 mycoplasma 감염에 대 한 테스트 하 고 이후 추가 실험을 위해 사용 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57400/57400fig1.jpg"> 그림 1 : 순수한 내 피 세포 FACS 정렬 하 여 인간의 정상적인 결 장 및 CRC에서 격리 될 수 있습니다. (A) 흐름 차트 EC 격리 프로세스의 필수 단계. (B) 지방 조직 (노란색), 다른 비 tumorous 부분, 또는 잠재적으로 괴 사 성 조직 부분 (브라운) 수술 표본 (왼쪽 및 가운데 패널)에서 제거 되었습니다 및 종양 조직 분리 (이전 2-3 m m 옆 길이의 조각으로 분해 했다 오른쪽 패널)입니다. (C) 단일 셀 서 스 펜 션 검색 후 조직 분리 (왼쪽된 패널) 셀 문화 요리에서 24 h에 대 한 알을 품는. 그 후, 비 부착 한 세포는 PBS (중간 패널)을 사용 하 여 부드러운 세탁에 의해 제거 되었다 및 셀 FACS 정렬 전에 80-90 %confluency 성장 했다 (오른쪽 패널). 하단 패널 (C)의 이미지는 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 인수 했다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57400/57400fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57400/57400fig2.jpg"> 그림 2 : 단일 세포 현 탁 액의 3.6-5.6%의 평균 인간의 CRC 환자에서 분리 된 그리고 트리플 긍정 적 FACS에 의해 정렬 (A) 선관위와 TEC FACS 정렬 안티 CD31-CD105,-VE cadherin 항 체와 세포의 트리플 라벨을 사용 하 여 했다. 12500 TECs의 (B) 평균 (n = 12) 및 17800 자문위 (n = 12) 인간의 정상적인 결 장 또는 CRC FACS 정렬 (CD31, CD105 및 VE cadherin 양성 세포, 왼쪽 패널), 나타내는 평균 3.6 5.6% (오른쪽 패널)의 요약 셀을 사용 하 여에서 고립 될 수 있다 고용 인구입니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57400/57400fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57400/57400fig3.jpg"> 그림 3 : 전형적인 내 피 세포 마커를 표현 하는 NEC와 인간의 CRC에서 TEC. 정상적인 결 장 내 피 세포 (NEC, n = 10)와 종양 내 피 세포 (TEC, n = 10) 인간 CRC는 CD31 (EC 마커)-, CD105 (EC 마커)-, VE cadherin (EC 마커)-, vWF (EC 마커)-긍정적인 및 CK20 (CRC 셀 표식)-, desmin (섬유/SMC 마커)-, CD45 ( 백혈구 마커)-(A) CD31-immunocytochemistry에 의해 결정으로 부정적인 (긍정적인 세포 = 빨강) 및 (B) 실시간 정량 (점선 아래 데이터 포인트는 부정적인 것을 감지 하는 샘플). (C) vWF 식으로 같은 환자에서 해당 TEC/NEC 샘플에 대 한 실시간 정량 Pcr에 의해 결정. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57400/57400fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

종양 내 피 세포는 종양 microenvironment의 중요 한 결정 요인 및 질병의 과정. 여기, 인간 대 장 암 및 마약 테스트 및 병 인 연구에 사용 될 일반 콜론에서 순수 하 고 가능한 내 피 세포의 고립에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

이 세포 분리 프로토콜의 전반적인 목표는 종양과 해당 정상 결장 모두에서 결장직장 암종을 앓고 있는 환자로부터 순수하고 생존 가능한 내피 세포를 얻는 것입니다. 이 방법은 결장직장 종양 형성에 대한 혈관 시스템의 영향을 추정하고 분석하는 것과 같은 종양 생물학 및 혈관 신생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 결장직장암 환자로부터 순수하고 생존 가능한 인간 내피 세포를 얻는 데 상대적으로 높은 성공률을 가질 수 있다는 것입니다.결장직장암 환자로부터 조직 표본을 얻으려면 새 메스를 사용하여 약 1g의 조직 조각을 얻습니다. 그런 다음 멸균 집게를 사용하여 항생제가 든 40ml의 얼음처럼 차가운 HBSS 완충액에 담긴 신선한 조직 조각을 50ml 원심분리기 튜브에 옮깁니다. 그런 다음 별도의 멸균 집게를 사용하여 암종과 정상 조직을 한 원심분리기 튜브에서 다른 원심분리기 튜브로 순차적으로 옮기고 40ml의 얼음처럼 차가운 HBSS 완충액에 항생제를 4회 세척합니다.모든 지방, 비종양 조직 또는 잠재적으로 괴사성 조직 부분을 제거하려면 멸균 집게를 사용하고 조직 조각을 멸균 세포 배양 페트리 접시로 옮깁니다. 그런 다음 항생제가 첨가된 HBSS 완충액 3-5ml를 첨가하여 조직 조각을 촉촉하게 만듭니다. 그런 다음 새 메스를 사용하여 조직 조각을 다듬습니다.그런 다음 구부러진 칼날이 있는 메스를 사용하여 남은 조직을 작은 조각으로 다집니다. 다진 조직 조각을 예열된 세포 배양 배지로 채워진 조직 해리 튜브로 옮깁니다. 조직의 해리기를 사용하여 다진 조직 조각을 해리하고, 제조업체의 지침에 따라 인체 조직용 종양 해리 키트를 사용합니다.첫 번째 중요한 단계는 올바른 크기와 조직 유형의 조직 조각을 얻기 위해 수술 표본을 올바르게 처리하고 미세 해부하는 것입니다. 조직 조각을 해리한 후 중력의 300배인 실온에서 1분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 혈청학 피펫을 사용하여 예열된 DMEM Low 배지 10ml를 MACS 튜브에 추가합니다.다음으로, 50ml 원심분리기 튜브 위에 100마이크로미터 기공 크기가 설정된 셀 스트레이너에 튜브의 세포 현탁액을 붓습니다. MACS 튜브에 10ml의 DMEM Low 배지를 추가로 피펫팅하여 원심분리기 튜브의 스트레이너를 통해 튜브의 추가 세포를 플러시합니다. 전체 세포 현탁액이 여과되면 추가로 10ml의 DMEM Low 배지로 세포 여과기를 세척합니다.세포 현탁액을 실온에서 300배 중력으로 7분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 원심분리가 끝나면 상층액을 버립니다. 그런 다음 동일한 50ml 원심분리기 튜브에 예열된 EBM-2-MV 배지를 보충한 5ml의 항생제에 세포 펠릿을 용해시킵니다.배양 플라스크에서 코팅 용액을 제거하고 세포 현탁액을 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소로 유지되는 T-25 배양 플라스크로 직접 옮깁니다. 농도가 약 80-90%에 도달하면 1ml의 Accutase를 첨가하여 플라스크의 세포를 분리합니다. 그런 다음 Accutase와 함께 세포를 10분 동안 그대로 둡니다.다음으로, 37도로 유지되는 EBM-2-MV 배지 4ml를 세포에 추가합니다. 그런 다음 10-25마이크로미터 범위의 자동 세포 계수 장치를 사용하여 세포를 계수합니다. 두 번째로 중요한 단계는 셀을 분할해야 하는 모든 단계입니다.정확한 시점을 추정하려면 경험이 필요합니다. 분열이 너무 이르면 세포가 죽습니다. 분열이 너무 늦어지면 내피 세포가 노화되거나 섬유아세포의 과다 증식이 문제가 됩니다.다음으로, 250배 중력의 실온에서 4분 동안 세포를 원심분리하고 실행이 끝나면 상등액을 배출합니다. 다음으로, 예열된 FACS 완충액에 세포 펠릿을 용해시킵니다. 그런 다음 FACS 염색 항체를 세포에 추가합니다.섞은 후 실온에서 총 15분 동안 배양합니다. 이 잠복기의 절반이 지나면 튜브를 한 번 튕깁니다. 혈청학 피펫을 사용하여 라벨링된 세포 현탁액에 2ml의 FACS 완충액을 추가합니다.그런 다음 세포 현탁액을 실온에서 250배 중력으로 4분 동안 원심분리하고 원심분리가 끝난 후 상층액을 디캔팅합니다. 그런 다음 2ml의 FACS 완충액을 첨가하여 세포 펠릿을 용해시키고 세포 현탁액을 실온에서 250배 중력으로 4분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 항생제가 보충된 EBM-2-MV 배지 500마이크로리터에 펠릿을 재현탁합니다.그런 다음 셀을 FACS 분류 기기로 옮깁니다. 삼중 양성 세포를 식별하고 신선하고 예열된 EBM-2-MV 배지로 채워진 24웰 배양 접시에 씨를 뿌립니다. 다음 48시간 동안 세포를 배양한 다음 배지를 갱신합니다.5-10일 만에 합류점이 90-100%에 도달할 때까지 2일마다 매체를 계속 교체하십시오. 그런 다음 원하는 배양 접시에 따라 세포 집단을 확장합니다. 그런 다음 합류점에 도달하면 수확하고 특성화를 진행합니다.먼저, 얻어진 종양 표본을 해리하고 세포 배양 접시에 파종합니다. 비부착성 세포는 씻겨내고, 부착성 세포는 FACS 분류 전에 80-90% 포화도까지 배양합니다. 다음으로, 면역 표지된 생존 가능한 종양과 정상 내피 세포의 집단을 확인하기 위해 FACS 분석을 수행합니다.이를 위해 정상 세포와 종양 내피 세포의 형광 결합 항체 특이적 삼중 표지를 수행하여 FACS를 통해 분류합니다. 분류된 전체 세포 집단 중 평균 3.6%와 5.6%가 각각 종양 세포와 정상 내피 세포입니다. 다음으로, 내피 세포 마커의 발현을 확인하기 위해 얻은 정상 및 종양 내피 세포를 면역세포화학(immunocytochemistry)에 적용합니다.여기 이미지는 CD31 양성 정상 및 종양 내피 세포를 보여줍니다. 그런 다음 RNA를 내피 세포의 CD31 양성 집단에서 분리하고 RT-qPCR을 실시하여 다른 내피 세포 특이적 마커를 식별합니다. 그래프에서 CD105, VE-cadherin 및 von Willebrand 인자와 같은 내피 세포 마커의 발현도 검출되지만 잠재적으로 오염될 수 있는 세포 집단의 마커 발현은 부족하여 분리된 내피 세포 배양의 순도를 나타냅니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 약 3주 안에 완료할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 FACS 분류 분석을 위해 세포를 언제 어떤 비율로 분할할 수 있는지 추정하기 위해 1차 내피 세포 배양에 대한 경험이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 기술의 의미는 결장직장암의 치료로 확장되는데, 그 이유는 세포 배양을 사용하여 결장직장암에서 종양 형성, 치료 반응 또는 내성의 메커니즘을 확인할 수 있기 때문입니다.우리는 인간 고형 종양에서 정말 순수하고 생존 가능한 내피 세포를 확립하는 데 문제가 있음을 지적하는 문헌의 여러 보고서를 읽었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 조직 미세해부 또는 FACS 분류 분석을 위한 처리 단계 또는 내피 세포의 추가 분할에는 정확한 시점을 추정하기 위한 경험이 필요하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 이 절차를 시도하는 동안 먼저 수술, 병리학 및 종양 등록과 함께 기능적 협력 네트워크를 구축하는 것이 중요합니다.또한, 1차 내피 세포 배양은 취약하기 때문에 이러한 세포를 다루기 위해 운동 훈련을 받아야 합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 인간 결장직장 암종 및 해당 정상 결장에서 내피 세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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이 기사에서는 신생아 마우스에서 일차 폐 내피 세포를 분리하고 배양했습니다.

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