정상적인 대 장 암과 대 장 암-향상 된 프로토콜에서 인간의 내 피 세포의 고립

이 세포 분리 프로토콜의 전반적인 목표는 종양과 해당 정상 결장 모두에서 결장직장 암종을 앓고 있는 환자로부터 순수하고 생존 가능한 내피 세포를 얻는 것입니다. 이 방법은 결장직장 종양 형성에 대한 혈관 시스템의 영향을 추정하고 분석하는 것과 같은 종양 생물학 및 혈관 신생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 결장직장암 환자로부터 순수하고 생존 가능한 인간 내피 세포를 얻는 데 상대적으로 높은 성공률을 가질 수 있다는 것입니다.

결장직장암 환자로부터 조직 표본을 얻으려면 새 메스를 사용하여 약 1g의 조직 조각을 얻습니다. 그런 다음 멸균 집게를 사용하여 항생제가 든 40ml의 얼음처럼 차가운 HBSS 완충액에 담긴 신선한 조직 조각을 50ml 원심분리기 튜브에 옮깁니다. 그런 다음 별도의 멸균 집게를 사용하여 암종과 정상 조직을 한 원심분리기 튜브에서 다른 원심분리기 튜브로 순차적으로 옮기고 40ml의 얼음처럼 차가운 HBSS 완충액에 항생제를 4회 세척합니다.

모든 지방, 비종양 조직 또는 잠재적으로 괴사성 조직 부분을 제거하려면 멸균 집게를 사용하고 조직 조각을 멸균 세포 배양 페트리 접시로 옮깁니다. 그런 다음 항생제가 첨가된 HBSS 완충액 3-5ml를 첨가하여 조직 조각을 촉촉하게 만듭니다. 그런 다음 새 메스를 사용하여 조직 조각을 다듬습니다.

그런 다음 구부러진 칼날이 있는 메스를 사용하여 남은 조직을 작은 조각으로 다집니다. 다진 조직 조각을 예열된 세포 배양 배지로 채워진 조직 해리 튜브로 옮깁니다. 조직의 해리기를 사용하여 다진 조직 조각을 해리하고, 제조업체의 지침에 따라 인체 조직용 종양 해리 키트를 사용합니다.

첫 번째 중요한 단계는 올바른 크기와 조직 유형의 조직 조각을 얻기 위해 수술 표본을 올바르게 처리하고 미세 해부하는 것입니다. 조직 조각을 해리한 후 중력의 300배인 실온에서 1분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 혈청학 피펫을 사용하여 예열된 DMEM Low 배지 10ml를 MACS 튜브에 추가합니다.

다음으로, 50ml 원심분리기 튜브 위에 100마이크로미터 기공 크기가 설정된 셀 스트레이너에 튜브의 세포 현탁액을 붓습니다. MACS 튜브에 10ml의 DMEM Low 배지를 추가로 피펫팅하여 원심분리기 튜브의 스트레이너를 통해 튜브의 추가 세포를 플러시합니다. 전체 세포 현탁액이 여과되면 추가로 10ml의 DMEM Low 배지로 세포 여과기를 세척합니다.

세포 현탁액을 실온에서 300배 중력으로 7분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 원심분리가 끝나면 상층액을 버립니다. 그런 다음 동일한 50ml 원심분리기 튜브에 예열된 EBM-2-MV 배지를 보충한 5ml의 항생제에 세포 펠릿을 용해시킵니다.

배양 플라스크에서 코팅 용액을 제거하고 세포 현탁액을 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소로 유지되는 T-25 배양 플라스크로 직접 옮깁니다. 농도가 약 80-90%에 도달하면 1ml의 Accutase를 첨가하여 플라스크의 세포를 분리합니다. 그런 다음 Accutase와 함께 세포를 10분 동안 그대로 둡니다.

다음으로, 37도로 유지되는 EBM-2-MV 배지 4ml를 세포에 추가합니다. 그런 다음 10-25마이크로미터 범위의 자동 세포 계수 장치를 사용하여 세포를 계수합니다. 두 번째로 중요한 단계는 셀을 분할해야 하는 모든 단계입니다.

정확한 시점을 추정하려면 경험이 필요합니다. 분열이 너무 이르면 세포가 죽습니다. 분열이 너무 늦어지면 내피 세포가 노화되거나 섬유아세포의 과다 증식이 문제가 됩니다.

다음으로, 250배 중력의 실온에서 4분 동안 세포를 원심분리하고 실행이 끝나면 상등액을 배출합니다. 다음으로, 예열된 FACS 완충액에 세포 펠릿을 용해시킵니다. 그런 다음 FACS 염색 항체를 세포에 추가합니다.

섞은 후 실온에서 총 15분 동안 배양합니다. 이 잠복기의 절반이 지나면 튜브를 한 번 튕깁니다. 혈청학 피펫을 사용하여 라벨링된 세포 현탁액에 2ml의 FACS 완충액을 추가합니다.

그런 다음 세포 현탁액을 실온에서 250배 중력으로 4분 동안 원심분리하고 원심분리가 끝난 후 상층액을 디캔팅합니다. 그런 다음 2ml의 FACS 완충액을 첨가하여 세포 펠릿을 용해시키고 세포 현탁액을 실온에서 250배 중력으로 4분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 항생제가 보충된 EBM-2-MV 배지 500마이크로리터에 펠릿을 재현탁합니다.

그런 다음 셀을 FACS 분류 기기로 옮깁니다. 삼중 양성 세포를 식별하고 신선하고 예열된 EBM-2-MV 배지로 채워진 24웰 배양 접시에 씨를 뿌립니다. 다음 48시간 동안 세포를 배양한 다음 배지를 갱신합니다.

5-10일 만에 합류점이 90-100%에 도달할 때까지 2일마다 매체를 계속 교체하십시오. 그런 다음 원하는 배양 접시에 따라 세포 집단을 확장합니다. 그런 다음 합류점에 도달하면 수확하고 특성화를 진행합니다.

먼저, 얻어진 종양 표본을 해리하고 세포 배양 접시에 파종합니다. 비부착성 세포는 씻겨내고, 부착성 세포는 FACS 분류 전에 80-90% 포화도까지 배양합니다. 다음으로, 면역 표지된 생존 가능한 종양과 정상 내피 세포의 집단을 확인하기 위해 FACS 분석을 수행합니다.

이를 위해 정상 세포와 종양 내피 세포의 형광 결합 항체 특이적 삼중 표지를 수행하여 FACS를 통해 분류합니다. 분류된 전체 세포 집단 중 평균 3.6%와 5.6%가 각각 종양 세포와 정상 내피 세포입니다. 다음으로, 내피 세포 마커의 발현을 확인하기 위해 얻은 정상 및 종양 내피 세포를 면역세포화학(immunocytochemistry)에 적용합니다.

여기 이미지는 CD31 양성 정상 및 종양 내피 세포를 보여줍니다. 그런 다음 RNA를 내피 세포의 CD31 양성 집단에서 분리하고 RT-qPCR을 실시하여 다른 내피 세포 특이적 마커를 식별합니다. 그래프에서 CD105, VE-cadherin 및 von Willebrand 인자와 같은 내피 세포 마커의 발현도 검출되지만 잠재적으로 오염될 수 있는 세포 집단의 마커 발현은 부족하여 분리된 내피 세포 배양의 순도를 나타냅니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 약 3주 안에 완료할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 FACS 분류 분석을 위해 세포를 언제 어떤 비율로 분할할 수 있는지 추정하기 위해 1차 내피 세포 배양에 대한 경험이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 기술의 의미는 결장직장암의 치료로 확장되는데, 그 이유는 세포 배양을 사용하여 결장직장암에서 종양 형성, 치료 반응 또는 내성의 메커니즘을 확인할 수 있기 때문입니다.

우리는 인간 고형 종양에서 정말 순수하고 생존 가능한 내피 세포를 확립하는 데 문제가 있음을 지적하는 문헌의 여러 보고서를 읽었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 조직 미세해부 또는 FACS 분류 분석을 위한 처리 단계 또는 내피 세포의 추가 분할에는 정확한 시점을 추정하기 위한 경험이 필요하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 이 절차를 시도하는 동안 먼저 수술, 병리학 및 종양 등록과 함께 기능적 협력 네트워크를 구축하는 것이 중요합니다.

또한, 1차 내피 세포 배양은 취약하기 때문에 이러한 세포를 다루기 위해 운동 훈련을 받아야 합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 인간 결장직장 암종 및 해당 정상 결장에서 내피 세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.