Name: 레이저에 의해 폐 결핵 병 변에서 약의 공간 정량화 캡처 서 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LCM-LC/MS) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 학습하세요 레이저 포획 현미절단 및 LC/MS 분석을 활용한 폐 결핵 병변 내 약물 공간 정량화 방법을. 이 기술은 특정 조직 구조 내 약물 농도를 정밀 측정하여 결핵 약물 개발 연구에 활용됩니다.

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우리 폴 오 브라이언, 감사 미 나 Marizel와 동물 실험에 대 한 이자벨 프리먼, Jacquie 곤잘레스 NIH/NIAID에서 다니엘 이너 원고에 대 한 레이저 캡처 기정 Jansy Sarathy 이전 토끼 조직의 감마 방사선에 대 한 생각과 조언입니다. 이 작품은 법안에서 자금에 의해 지원 되었다 고 멜 린다 게이츠 재단 (OPP1174780)와 공유 하는 NIH 계측 1S10OD018072를 부여 합니다. 우리 감사 Eliseo A. Eugenin Leica LMD 6500 현미경에 대 한 액세스를 제공 하 고 전문 지식 및 조언을 공유. 구입, 그리고 지속적인 지원, LMD 6500는 국립 정신 건강 연구소 그랜트, MH096625, 신경 성 질환의 국가 학회 및 치기, NS105584, PHRI (E.A.E)에 자금와 GSK 기여 (E.A.E)에 의해 투자 되었다.

모든 동물 연구 관리 및 승인 기관 동물 관리에서 국립 보건원의 실험 동물의 사용 및 사용 위원회의 NIAID (NIH), 베 데스 다, 메릴랜드에 대 한 가이드에 따라 수행 했다
1. 동물 실험 및 조직 컬렉션
이 섹션은 프로토콜의 동물 절차 및 Biosafety 수준 3 (BSL3) 조건 하에서 샘플 컬렉션을 설명합니다. 토끼에서 프로토콜 되었습니다 결핵균 에 어로 졸 감염 절차 및 약물 관리의 상세한 프로토콜 기술 이전11,12.
<ol><li>뉴질랜드 백색 토끼 (남녀 4-5 개월에) M. 결핵 HN878 감염 앞11에서 설명한 코 전용에 어로 졸 시스템을 사용 하 여.</li>
	<li>기본 루트를 통해 선택한 마약 (여기에 제시 된 예에서 Ethambutol)를 관리 하 고 2, 6, 및 24 시간 관리 다음에 동물을 안락사. 첫째, 5 mg/kg에서 35 mg/kg 및 Xylazine에서 케 타 민의 근육 주사로 토끼를 anesthetize. 10 분 기다립니다 고 적절 한 anesthetization 꼬리를 꼬 집 고 부드럽게 눈을 감동 합니다. 아무 반응 인 경우에 1 mL/4.5 k g 2 mL의 멸 균 식 염 수에 pentobarbital 및 phenytoin ( 재료의 표참조)의 정 맥 행정에 의해 안락사. 참고: 이러한 timepoints 최적의 Ethambutol pharmacokinetic 프로 파일 커버 하 고 다른 연구 약물에 대 한 조정/최적화 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>가슴 구멍에서 폐를 제거, resect uninvolved 폐 조직 (앞에서 설명한3) 주변에 포함 된 큰 괴 사 성 육아 종을 포함 하는 폐 생 검 겸 자가 위, 또는 메스 사용. 괴 사 성 육아 종을 표시에 베이 지 컬러와 일반적으로 약간 주변 레드/핑크 색 폐에서 내 다. 쉽게 cryosectioning 촉진 하 biopsies 2 x 1.5 x 1.5 c m 보다 큰 인지 확인 합니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 용지함의 기지와 직접 접촉에서 사전 분류 cryomold 트레이 원하는 절단 표면에 생을 놓습니다. 동결, 후이 평평한 표면에서 cryosections 삭감 될 것 이다 제공할 것입니다.</li>
	<li>액체 질소 증기에 생을 고정 합니다. 액체 질소와 2 인치는 깊이를 스티로폼 컨테이너와 금속 와이어 튜브 랙 배치. 랙 평평한 표면 조직 트레이 배치 됩니다 제공 하는 액체 질소의 표면 위에 내 다 한다. 스티로폼 용기에 다시 뚜껑을 배치 하 고 10 분 완전히 동결에 대 한 조직을 두십시오.</li>
	<li>조직 트레이 제거, 신속 하 게 알루미늄 필름에 포장 및 개별적으로 레이블이 resealable 비닐 봉투 및 도장 장소. -80 ° C 냉동 고 스토리지에 대 한 전송. 참고: 단계 1.1-1.6 BSL3 조건 (모든 동물 작품을 포함 한 감염된 장기 및 조직의 처리)에서 수행 됩니다. 감마 비추는 BSL3 제약 이외의 처리를 3 Megarads에서 폐 생 검. 레이저 캡처 기정 unsterilized 조직에 시설 안전 프로토콜 승인 하는 경우에 BLS3 내에서 수행할 수 있습니다. 그러나,이 프로토콜의 나머지 다운스트림 처리를 BSL-2 시설에 설명합니다.</li>
</ol>2. 조직 단면
<ol><li>원하는 절삭 온도 cryostat를 설정 합니다. cryostat에 감마 방사선 폐 생 검-80 ° C 저장에서 전송 하 고 equilibrate 조직 온도를 30 분 동안 둡니다. 참고:-22 ° C-20은 결핵 병 변 biopsies에 적합 합니다.</li>
	<li>핀셋을 사용 하는 척을 조직의 기본 준수를 최적의 절삭 온도 접착제 (OCT)의 작은 금액을 사용 하 여 cryostat 척을 생 수정. 평평한 표면 (그는 cryomold의 접촉)는 절단을 위한 노출된 표면 조직을 방향을 정하십시오. 이 후속 질량 분석 분석을 방해할 수 있습니다 대로 OCT 조직 표면 오염 하지 않습니다 확인 합니다.</li>
	<li>25 µ m 두께에 3 개의 직물 단면도 잘라내어 애완 동물 멤브레인 슬라이드에 탑재. 부드럽게 조직 섹션을 막 터치 하 고 제거 합니다. 너무 많은 압력을 적용 하는 경우 얇은 막 찢 어 수 있습니다.<ol>
<li>장착이 되 고 조직 단면도의 청구와 가난한 접착 애완 동물 멤브레인에 발생 이전 슬라이드의 과도 한 처리를 하지 마십시오. 막 슬라이드 thaw 장착 및 성공적인 접착 막에 조직의 활성화를 위해 상 온에서 보관 됩니다 확인 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>cryostat에서 슬라이드를 제거 하 고 3 분 동안 건조를 허용 합니다. LCM-LC/MS/MS 즉시 수행 되지 것입니다, 경우는 작은 밀폐 밀폐 가능한 봉투에 전송-80 ° C 저장까지 해 부에 필요한 슬라이드 봉인.</li>
	<li>10-12 µ m와 thaw-마운트 되며 고 오신 (H &amp; E) 얼룩 및 참조에 대 한 표준 유리 슬라이드에 인접 한 부분을 잘라. 추가 섹션 (결핵균 (MTB)를 시각화에 대 한 Ziehl-Niellsen) 같은 다른 원하는 histochemistry 얼룩에 대 한이 시간에서 잘릴 수 있다.</li>
</ol>3입니다. 서
<ol><li>-80 ° C 저장에서 슬라이드를 포함 하는 봉인된 봉투를 제거 하 고 5 분 동안 실내 온도 도달할 수 있도록. 참고: 차가운 슬라이드 즉시 실험실 분위기에 노출은, 조직을 응축, 코팅 될 것입니다 그리고 약물의 공간 무결성이 손상 될 수 있습니다.</li>
	<li>현미경 및 레이저 (레이저 필요 합니다 5-10 분 워밍업 절단 수 시작 하기 전에). 플랫 캡 0.20 mL PCR 튜브 홀더 로드.</li>
	<li>가방에서 슬라이드를 제거 하 고 평판 스캐너를 사용 하 여 애완 동물 슬라이드에 조직 단면도의 광학 이미지.</li>
	<li>슬라이드 슬라이드 홀더 (조직 면이 아래로)에 놓고 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 관심사의 특정 육아 지역에 별도 컬렉션 튜브를 할당 합니다. 일반적으로, 이러한 'uninvolved 폐,' '세포 육아 종,' 되며 'caseum' (괴 사 성 센터), 하지만 수 있습니다 육아/생의 특정 병에 따라 다릅니다.</li>
	<li>현미경 목표 X 5를 사용 하 여 조직에 초점. 이 확대는 두 세포 괴 사 성 육아 분야를 포함 하는 조직에 대 한 좋은 개요를 제공 해야 합니다. 소프트웨어에서 조직 아래 위치로 이동 하려면 'caseum'를 지정 하는 튜브를 선택 합니다.</li>
	<li>해 부에 원하는 매개 변수를 입력 합니다. 25 µ m 두께 폐 섹션에 대 한 일반적인 설정은 레이저 전원 30, 15, 속도 및 조리개 35 (임의의 단위) 합니다. 그러나, 이러한 사용 하는 현미경 및 레이저의 나이 인해 전력 감소 잠재력에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>' 자유 그리기 ' 도구를 선택 하 고, 마우스 또는 터치 스크린 펜을 사용 하 여, 원하는 지역의 해 부에 대 한 개요. 지역의 표면 영역에에서 표시 됩니다. 500000 µ m2 (0.5 m m2) 쉽게 해 부를 촉진 하기 위해 선택된 영역을 유지. 해 부를 반복 하 여 튜브 모자에 총에서 3 백만 µ m2 (3 m m2)가 수집.<ol>
<li>경우에, 해 부 지역 (예를 들면 때문에 정적 매력) 주변 막에 붙어 남아 고 컬렉션 모자에 빠지지 수 있습니다. 선택 하 고 소프트웨어 내에서 수동으로 제거 하 여 총 누적 노출 영역에서이 영역을 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>'세포 병 변'에 대 한 모자를 선택 하 고 3 백만 µ m2 단계 3.7에서에서 설명한 동일한 프로세스를 사용 하 여 조직의 수집.</li>
	<li>'Uninvolved 폐'에 대 한 모자를 선택 하 고 3 백만 µ m2 단계 3.7에서에서 설명한 동일한 프로세스를 사용 하 여 조직의 수집. 참고 uninvolved 폐 조직 bronchioles 및 치조 공간 포함. 주의 주의를 해 부에 대 한 정의 된 조직 영역에서 제외.</li>
	<li>캡 홀더를 제거 하 고 신중 하 게 unclip, 인감 및 레이블 각 튜브. 항공 장애 등 공기 흐름 장애는 오프닝에서에서부터 주변에서 해 부 조직을 보호 합니다. 즉시, 해 부 조직 분석 또는-80 ° C에서 저장 하 고 처리 및 LCMS 분석 하기 전에 해 동.</li>
</ol>4. 추출 및 LCMS 분석
<ol><li>1:1 이기/메탄올 Ethambutol d-10 내부 표준 포함의 추출 솔루션을 준비 합니다. 내부 표준, 사용 분석 약물의 안정적인 분류 형태 (중수소 라는 EMB이이 데모에서 사용)와 같은 동위 원소를 피하기 위해 충분 한 질량 변화와 크로스를 선택할 때 실정이 약물 및 표준 (일반적으로 최소 4 daltons) 사이 이야기 . 참고: homogenate 표준을 만들고 하는 매우 제한 된 제어 조직 때문에 어렵습니다 각 각각 조직 유형의 homogenate에서 표준 만들기. 아군된 homogenate 샘플에서 표준 만들기 하는 대신 표준 빈 조직과 함께 하 고 추출 화합물을 테스트를 추가 하 여 만들 수 있습니다. 연구 샘플 조직 단면도의 대상 볼륨을 일치 하는 homogenate에서 제어 조직의 볼륨 주어진된 농도에 있을 것 이라고 테스트 화합물의 금액와 직접 결합 된다.</li>
	<li>노출 영역 및 조직 단면도의 두께에 따라 대상된 조직 볼륨을 계산 하 고 표준 및 QC 샘플에 추가 되는 homogenate의 볼륨을 사용 하 여 homogenate에 대 한 필요한 희석 비율을 결정. 계산 25 µ m 두께와 homogenate의 2 µ L 볼륨 3 백만 µ m2 (3 m m2) 해 부 대상 지역에 대 한 아래 설명 됩니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq4.jpg">
</li>
	<li>제어 조직의 50 밀리 그램 무게 희석 PBS 버퍼를 추가 하 여 homogenate 재고를 준비 하는 조직 밀도 1g/mL의 가정 (26.67 homogenate 희석 요소를 사용 하 여 단계에서 계산한 4.2, 희석제는 1.283 mL). 구슬 구슬 균질 화기에 1750 rpm에서 5 분간 폐 조직 및 PBS 버퍼 구타에 의해 균질. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq6.jpg">
</li>
	<li>1:1 이기/물 솔루션 급상승 표준 곡선을 만드는 데에 1 mg/mL 마약 주식 농도 희석. 급상승 스파이크 볼륨 및 대상 조직 볼륨에 따라 표준 농도 결정 합니다. 그림된 예제를 100 ng/mL 10 µ L 스파이크 볼륨을 사용 하 여 표준입니다. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq8.jpg">
</li>
	<li>Microdissected 조직-80 ° C 저장에서 포함 된 튜브를 제거 하 고 5 분 동안 실내 온도 도달할 수 있도록.</li>
	<li>Microdissected 조직을 포함 하는 튜브를 1:1 이기/물 솔루션의 10 µ L 및 PBS 버퍼의 2 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>표준 곡선 및 품질 관리 관, 대 한 솔루션 제어 폐 homogenate의 2 µ L 요동의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>각 튜브를 추출 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>소용돌이, 5 분 동안 각 관 5 분 동안 sonicate 고 영화와 조직의 각 튜브에 펠 릿을 형성 하기 위하여 5 분 동안 5000 RPM에서 원심.</li>
	<li>96-잘 깊은 잘 격판덮개에 상쾌한의 50 µ L를 전송 및 각 잘에서 이온된 수의 추가 50 µ L로 희석.</li>
	<li>Ethambutol Ethambutol-d10 내부 표준 (앞에서 설명한 세부12)에 대 한 최적화 된 악기 매개 변수를 사용 하 여 LC/MS/MS 분석을 수행 합니다.</li>
	<li>희석 비율을 사용 하 여 조직의 각 샘플에 대 한 해 부 정확한 금액에 대 한 수정. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq9.jpg">
</li>
</ol>5. 방법 유효성 검사
<ol><li>1 부 폐, 2 부분 PBS, 3-4 강철 구슬을 결합 하 여 제어 폐 조직에는 homogenate을 만듭니다. 비드 균질 화기를 사용 하 여 1750 rpm에서 5 분간 폐 조직 및 PBS 버퍼를 이길.</li>
	<li>990 µ L homogenate를 만드는 1 분 10000 ng/mL (10mg/mL)와 소용돌이의 최종 농도에 1mg/mL Ethambutol DMSO 재고의 10 µ L을 추가 하 여는 homogenate 스파이크.</li>
	<li>cryomold에는 homogenate을 붓는 고 빠르게 5 분에 대 한 드라이 아이스에 냉동 하 여 냉동된 homogenate 블록을 만듭니다.</li>
	<li>2.1-2.5 단계에 설명 된 대로 homogenate 블록에서 25 µ m 두꺼운 섹션을 준비 합니다.</li>
	<li>3.2-3.10 단계에 지정 된 대상 조직 영역 해 부.</li>
	<li>Microdissected 조직을 포함 하는 관에 10 µ L 1:1 이기/물과 PBS 버퍼의 2 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>각 튜브를 추출 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다. 단계 4.9-4.12 표준 곡선을 만들고 조직 homogenate 블록에 약물 농도 결정 합니다.</li>
	<li>아래 수식을 사용 하 여 추출 효율을 계산: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq10.jpg">
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

공간 해결 정량화 폐 결핵 병 변 내 약물의 약물 노출에 다른 병 변 구획 내에서 거주 하는 세균성 인구에 살 균 농도 도달 여부를 확인 하기 위해 필요 합니다. 여기에 설명 된 LCM-LC/MS 메서드는 총에서만 1-3 조직 단면도 사용 하 여 박테리아-부유한 caseum를 포함 하 여 모든 병 변 구획 내에서 안티-결핵 약물의 절대 정량화를 수 있습니다. 전통적인 조직 균질 및 LC/MS 방법 조직에 마약 정량화 종종 특정 병 변 구획을 해결 하려면 공간 특이성 부족 이며, 경우에 상당한 잠재력을 교차 오염 휴대 하 고 수동 추출 과정에서 괴 사 성 병 변 지역입니다.
LCM-LC/MS 접근 이미징 기술과 질량 분석을 기반으로 몇 가지 주요 장점이 있습니다. 이 중 기본 방법의 완전히 양적 기능과 해결 컬럼에 분리를 통해 내 생 종 방해 억제 약물 인 LC/MS 분석의 추가 감도 있습니다. 그러나, MALDI-MSI 자세한 마약 유통에 관한 공간 정보를 제공 합니다. MALD...

공간을 해결 하 고 마약 수준 계량 능력 결핵 약물 농도1살 균에서 폐 병 변 내의 박테리아 모집단에 도달 여부를 결정 하기 위한 중요 한 요구 사항입니다. 특별 한 중요성의 일반적으로 이십시오의 가장 높은 수를 포함 하 고 마약 vascularization의 부재 때문에 액세스할 수 있습니다 (caseum 라고) 하는 병 변의 괴 핵심으로 약물 침투를 결정 이다.
삭제 폐 병 변의 균질 화를 포함 하는 병 변 침투를 평가 하기 위해 전통적인 방법 뒤에 용 매 추출 및 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LC/MS) 분석, 매우 민감하고의 마약에 대 한 선택적 관심입니다. 그러나,이 메서드는 원래 무 균된 조직의 크기를 제한 하는 불 쌍 한 공간 정보를 제공 합니다. 질량 분석 기반 이미징 등 방법을 매트릭스 보조 레이저 탈 착 이온화 (MALDI)2,3, desorption 분무 이온화 (DESI)4 또는 표면 추출 액체 강화 된5, 6 높은 공간 해결 이미징 기능을 제공 하지만 직접 정량화는 매우 도전적인 또는 이기종 이온 억제 효과 및 다양 한 셀에서 분석의 다른 추출 효율 불가능 한 수 또는 조직의 종류7. 또한, 가장 직접적인 조직 MS 이미징 접근은 본질적으로 생 종 이온화와 조직에서 약물의 낮은 용 매 추출 효율에 대 한 경쟁의 컬럼에 분리의 부족 때문에 LC/MS 보다 덜 민감한.
레이저 캡처 기정 (LCM) LC/MS 분석을 함께 정기적으로 격리 및 proteomic 연구8,9 에 대 한 뚜렷한 조직 지역 특성화에 적용 되었으며 최근 약물 정량화에 대 한 활용에 복용 동물 조직10. 여기 선물이 적용 LCM (LCM-LC/MS) LC/MS 분석을 결합해 독특한 육아 구획 내에서 안티-결핵 약물을 계량 하는 최적화 된 프로토콜. 레이저 캡처 서 과정에서 UV 레이저는 현미경 목표는 사용자에 의해 정의 된 경로 따라 원하는 조직 영역을 분리 하 고 조직 섹션에를 통해 집중 된다. 중력 지원 lcm (이 연구에 사용 하는 기법), 조직 섹션 얇은 고분자 막 슬라이드 (PET 또는 펜)에 탑재 되 고 조직 슬라이드 아래 sited 컬렉션 튜브 캡에 캡처됩니다. 마약 삭제 조직에서 추출 되 고 표준 LC/MS 접근을 사용 하 여 계량. 수집 하는 데 필요한 조직의 양은 궁극적으로 조직에 존재 하는 약물의 예상된 농도 및 LC/MS 방법의 감도에서 결정 됩니다. 대부분의 약물 치료 수준에서 약을 복용 하 고 조직의 일상적인 트리플 4 극 자 질량 분석기, 3 백만 µ m2 (3 m m2)를 사용 하 여 분석의 분석에 대 한 표면적은 충분 합니다.
이 프로토콜 공간 프로 파일링의 강력한 조합을 설명 하 고 전체 정량화 LCM-LC/MS, 결핵 육아의 모든 구획 내에서 절대 약물 농도 제공 제공. 기술은 또한 중요 한 약물 발견과 개발 정보를 제공 하 많은 다른 병에 걸리는 조직에 약물 농도 결정에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>뉴질랜드 흰 토끼</td><td>Covance</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamine) 100 mg / mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine) 100 mg / mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (펜토 바르비탈 나트륨 및 페니토인 나트륨) 용액</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A456-212</td><td></td></tr><tr><td>Formic Acid (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Water (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>W6212</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL flat-cap PCR tubes</td><td>Corning</td><td>07-200-392</td><td></td></tr><tr><td>스틸 프레임, PET-멤브레인</td><td>Leica</td><td>11505151</td><td></td></tr><tr><td>프리미엄 서리 현미경 슬라이드</td><td>Fisher</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>96 딥 웰 플레이트 2.0ML PP RB</td><td>Fisher</td><td>NC0363259</td><td></td></tr><tr><td>Zorbax SB-C8 컬럼 (4.6 by 50 mm; 입자 크기, 3.5 &mu; m)</td> <td>애질런트</td><td>820631-001D</td><td></td></tr> <tr><td>"지퍼" 밀봉 샘플 백</td><td>Fisher</td><td>01-816-1B</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM1850 cryostat</td><td>Leica</td><td>Discontinued</td><td>Leica CM1860은 현재 모델</td></tr><tr>입니다.<td>레이저 미세해부 시스템 6500</td><td>Leica</td><td>단종</td><td>Leica LMD 6은 현재 모델인</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity II, HPLC</td><td>, Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>API 4000, QTRAP 질량 분석기</td><td>, Sciex</td><td></td><td></td></tr>입니다.</tbody></table>

레이저에 의해 폐 결핵 병 변에서 약의 공간 정량화 캡처 서 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (lcm-lc/ms)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

결핵은 여전히 병 적 상태와 사망률 전세계의 주요 원인. 기존 약물 regimens 개선 및 새로운 치료제의 개발 시급히 필요 됩니다. 도달 하 고 저조한 나가도록 괴 지역 (caseum) 폐 육아의 박테리아 살 균 약 복용된 결핵 약의 능력은 성공적인 치료 적 개입에 대 한 중요 합니다. 효과적인 치료 regimens 따라서 유리한 caseum 침투 특성을 가진 약물을 포함 해야 합니다. 생물 조직에 마약 수준 측정을 위한 현재 LC/MS 방법 제한 된 해상도 기능, 그 안에 발견 같은 작은 조직 구획 내에서 절대 약물 농도 정확 하 게 결정 하 고 어려운 괴 사 성 육아입니다. 여기 우리는 LC/MS 정량화와 병 적 별개 조직 영역의 레이저 캡처 기정 (LCM)를 결합 하는 프로토콜을 제시. 이 기술은 육아 caseum, 세포 병 변 및 uninvolved 폐 조직 내 약물의 절대 정량화 하며, 따라서, 정확 하 게 살 균 농도 달성 되 고 있는지 여부를 결정 합니다. 결핵 연구, 뿐만 아니라 기술 병 조직에 약물의 공간 해결 정량화에 대 한 많은 잠재적인 응용 프로그램을 하고있다.

LCM-LC/MS 접근에 대 한 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 감마-방사선에 의해 조직 살 균, 후 (조직 단면 이후)에서 모든 후속 단계 BSL3 조건 이상으로 일어난다. 그림 2 조직 격리 LCM 전후 생 섹션 병 변이 보여준다. 결핵 병 변 괴과 세포 분야를 쉽게 식별 하 고 광학 이미지 (인접 조직 조직학 얼룩이 섹션을 참조 하십시오 요구) 없이 혼자의 검사에 의해 분리 될 수 있습니다. 해 부 과정 생성 주변 조직에 최소한의 소란와 함께 깨끗 한 컷 하 고 해 부 3 백만 µ m2 (3 m m2) 병 변에서 각 지역의 총에서 약 1 시간 걸립니다.
추출 효율과 LCM-LC/MS 방법의 안정성은 Ethambut...

여기, 우리는 공간 계량 폐 결핵 육아 내 마약 배포판에 레이저 캡처 서 LC/MS 분석과 함께 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 접근은 광범위 한 적응성 높은 공간 세부 사항에서 조직 내의 약물 농도 측정 하는 있다.

레이저에 의해 폐 결핵 병 변에서 약의 공간 정량화 캡처 서 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

이 분석 기술의 전반적인 목표는 결핵 폐 병변 조직 구획 내에서 항결핵 약물 에탐부톨을 정량화하여 살균 약물 농도에 도달하고 있는지 여부를 확인하는 것입니다. 이 방법은 투여된 약물이 모든 육아종 조직 구획 내에서 살균 농도로 박테리아 집단에 도달하는지 여부를 결정함으로써 결핵 약물 발견 및 개발 분야의 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특정 조직 구조 및 세포 집단 내에서 높은 공간적 세부 사항에서 약물 농도를 완전히 정량화할 수 있다는 것입니다.이 방법의 시각적 시연은 조직 오염 가능성과 멤브레인 슬라이드의 취약한 특성으로 인해 조직 절단 및 장착 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 조직 채취로 이 절차를 시작합니다. 조직 절편을 수행하려면 먼저 저온 유지 장치를 원하는 절단 온도로 설정하십시오.감마선 조사된 폐 생검을 영하 80도의 보관 장소에서 저온 유지 장치로 옮기고 조직 온도를 평형을 유지하기 위해 30분 동안 그대로 둡니다. 핀셋을 사용하여 소량의 최적 절단 온도 접착제를 사용하여 조직 바닥을 척에 부착하여 생체 검사를 저온 유지 장치 척에 고정합니다. 평평한 표면이 절단을 위해 노출된 표면이 되도록 조직의 방향을 지정합니다.OCT가 조직 표면을 오염시키지 않도록 하면 후속 질량 분석 분석을 방해할 수 있습니다. 25미크론 두께로 3개의 조직 절편을 절단하고 PET 멤브레인 슬라이드에 장착합니다. 멤브레인을 조직 섹션에 부드럽게 터치하고 섹션을 제거합니다.너무 많은 압력이 가해지면 얇은 멤브레인이 찢어질 수 있습니다. PET 멤브레인이 충전되지 않고 조직 부분의 접착력을 감소시키지 않도록 장착하기 전에 슬라이드를 과도하게 취급하지 마십시오. 멤브레인 슬라이드를 실온에서 유지하여 해동 장착되고 조직이 멤브레인에 성공적으로 접착될 수 있도록 합니다.저온 유지 장치에서 슬라이드를 제거하고 슬라이드를 3분 동안 자연 건조시킵니다. LCM-LC-MS/MS가 즉시 수행되지 않을 경우 슬라이드를 작은 밀폐 밀봉 가능한 백에 밀봉하고 해부에 필요할 때까지 섭씨 영하 80도의 보관소로 옮깁니다. 인접한 부분을 10-12미크론으로 절단하고 헤마톡실린 및 에오신 염색을 위해 표준 유리 슬라이드에 해동 장착합니다.이때 원하는 다른 조직화학적 염색을 위해 추가 절편을 절단할 수 있습니다. 영하 80도의 보관소에서 슬라이드가 들어 있는 밀봉된 백을 제거하고 5분 동안 실온에 도달하도록 합니다. 콜드 슬라이드가 실험실 대기에 즉시 노출되면 조직이 응결로 코팅되고 약물의 공간적 무결성이 손상될 수 있습니다.현미경과 레이저를 켭니다. 레이저는 절단을 시작하기 전에 예열하는 데 5분에서 10분이 걸립니다. 플랫 캡 0.20ml PCR 튜브를 홀더에 넣습니다.가방에서 슬라이드를 꺼낸 후 평판 스캐너를 사용하여 PET 슬라이드의 조직 부분에 대한 광학 이미지를 촬영합니다. 슬라이드를 티슈 면이 아래를 향하도록 슬라이드 홀더에 놓습니다. 현미경 소프트웨어를 사용하여 관심 있는 특정 육아종 영역에 별도의 수집 튜브를 할당합니다.일반적으로 이들은 관련이 없는 폐, 세포 육아종 및 케이스움이지만 육아종 생검의 특정 병리학에 따라 달라질 수 있습니다. 5X 현미경 대물렌즈를 사용하여 조직에 초점을 맞춥니다. 이 배율은 세포 및 괴사성 육아종 영역을 모두 포함하는 조직에 대한 좋은 개요를 제공해야 합니다.소프트웨어에서 tube로 지정된 caseum을 선택하여 조직 아래의 위치로 이동합니다. 원하는 해부 매개변수를 입력합니다. 25미크론 두께의 폐 절편에 대한 일반적인 설정은 레이저 출력 30, 속도 15 및 조리개 35입니다.그러나 이는 사용된 현미경과 레이저의 수명으로 인한 잠재적인 출력 감소에 따라 다릅니다. 자유 그리기 도구를 선택하고 마우스 또는 터치스크린 펜을 사용하여 원하는 해부 영역의 윤곽을 그립니다. 영역의 표면적이 소프트웨어에 표시됩니다.더 쉽게 해부할 수 있도록 선택한 영역을 500, 000제곱 미크론 미만으로 유지하십시오. 튜브 캡에 총 300만 제곱 미크론이 수집될 때까지 해부를 반복합니다. 경우에 따라 절개된 영역이 주변 멤브레인에 달라붙어 수집 캡으로 떨어지지 않을 수 있습니다.누적 표면적 총계에서 이러한 영역을 제거하려면, 소프트웨어 내에서 수동으로 선택하고 제거합니다. 다음으로, 세포 병변에 대한 캡을 선택하고 동일한 프로세스를 사용하여 300만 평방 미크론의 조직을 수집합니다. 침범되지 않은 폐에 대한 캡을 선택하고 동일한 프로세스를 사용하여 300만 평방 미크론의 조직을 수집합니다.관련되지 않은 폐 조직에는 많은 세기관지와 폐포 공간이 포함되어 있습니다. 해부를 위해 정의된 조직 영역에서 이러한 항목을 제외하도록 주의하십시오. 캡 홀더를 제거하고 각 튜브를 조심스럽게 풀고 밀봉하고 라벨을 붙입니다.절개된 조직을 주변 공기 방해로부터 보호하십시오. 절개된 조직을 즉시 분석하거나 영하 80도에서 보관하고 처리 및 LC/MS 분석 전에 해동합니다. 조직 밀도가 밀리리터당 1g이라고 가정하고 대조 조직의 무게를 50mg으로 측정하고 PBS 완충액을 추가하여 희석하여 균질화 스톡을 준비합니다.비드 균질화기에서 1750rpm으로 5분 동안 폐 조직과 PBS 완충액을 비드 박동하여 조직을 균질화합니다. 다음으로, 밀리리터당 1밀리그램의 의약품을 일대일 아세토니트릴/물에 희석하여 표준 곡선 스파이킹 솔루션을 만듭니다. 스파이크 부피와 타겟 조직 부피를 기준으로 스파이크 표준 농도를 결정합니다.예시된 예는 100마이크로리터 스파이크 부피를 사용하는 밀리리터당 100나노그램 표준에 대한 것입니다. 미세 해부된 조직이 들어 있는 튜브를 영하 80도의 온도에서 제거하고 5분 동안 실온에 도달하도록 합니다. 10마이크로리터의 일대일 아세토니트릴/물 용액과 2마이크로리터의 PBS 완충액을 미세절부된 조직이 들어 있는 튜브에 추가합니다.표준 곡선 및 품질 관리 튜브의 경우 2마이크로리터의 제어 폐 균질산염에 10마이크로리터의 스파이킹 용액을 추가합니다. 각 튜브에 50마이크로리터의 추출 용액을 추가합니다. 각 튜브를 5분 동안 소용돌이치십시오.그런 다음 5분 동안 초음파 처리하십시오. 다음으로, 5, 5 분 동안 000 rpm에 관을 각 관에 있는 영화 그리고 조직의 펠릿을 형성하기 위하여 관을 분리기. 원심분리 후 50마이크로리터의 상등액을 96웰 딥 웰 플레이트로 옮기고 각 웰에 추가로 50마이크로리터의 탈이온수로 희석합니다.마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 LC-MS/MS 분석 및 분석법 검증을 수행합니다. LCM-LC/MS 방법은 에탐부톨 스파이크 조직 균질액에서 레이저 미세절부 영역을 분석하여 처음 검증되었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 이 방법은 재현성이 높았으며 우수한 약물 회수율을 보여주었습니다.여러 폐 조직에서 LCM-LC/MS로 측정한 에탐부톨 농도는 확립된 LC/MS 접근법에 의해 결정된 농도와 직접 비교하여 추가로 검증되었습니다. 등가 농도는 두 기술 모두에 의해 검출되었습니다. 비관련(uninvolved lung parenchyma), 세포 병변 테두리(cellular lesion rim) 및 괴사성 caseum(necrotic caseum) 내의 절대 에탐부톨 농도는 LCM-LC/MS에 의해 결정되었습니다.Mycobacterium tuberculosis 살균 수준은 모든 병변 구획에서 도달했습니다. 대식세포에서 세포외 복제간균의 99%와 세포내 간균의 99%를 죽이는 데 필요한 최소 농도가 표시됩니다. 이 동영상을 시청한 후에는 조직을 미세해부하고 정의된 폐 육아종 구조 내에서 약물 수준을 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 기술을 통해 항균제 연구 분야의 연구자들은 투여된 약물이 살균 농도로 표적 병원체 집단에 도달하고 있는지 여부를 정확하고 정량적으로 평가할 수 있습니다. 이 접근법은 다양한 조직 및 질병 상태에 광범위하게 적용할 수 있습니다.

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Research

연구

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Medicine

의학

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종양 미세환경의 미세스케일 프로테오믹 분석을 위한 산업화된 인공 지능 유도 레이저 미세 해부

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