레이저에 의해 폐 결핵 병 변에서 약의 공간 정량화 캡처 서 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LCM-LC/MS)

이 분석 기술의 전반적인 목표는 결핵 폐 병변 조직 구획 내에서 항결핵 약물 에탐부톨을 정량화하여 살균 약물 농도에 도달하고 있는지 여부를 확인하는 것입니다. 이 방법은 투여된 약물이 모든 육아종 조직 구획 내에서 살균 농도로 박테리아 집단에 도달하는지 여부를 결정함으로써 결핵 약물 발견 및 개발 분야의 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특정 조직 구조 및 세포 집단 내에서 높은 공간적 세부 사항에서 약물 농도를 완전히 정량화할 수 있다는 것입니다.

이 방법의 시각적 시연은 조직 오염 가능성과 멤브레인 슬라이드의 취약한 특성으로 인해 조직 절단 및 장착 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 조직 채취로 이 절차를 시작합니다. 조직 절편을 수행하려면 먼저 저온 유지 장치를 원하는 절단 온도로 설정하십시오.

감마선 조사된 폐 생검을 영하 80도의 보관 장소에서 저온 유지 장치로 옮기고 조직 온도를 평형을 유지하기 위해 30분 동안 그대로 둡니다. 핀셋을 사용하여 소량의 최적 절단 온도 접착제를 사용하여 조직 바닥을 척에 부착하여 생체 검사를 저온 유지 장치 척에 고정합니다. 평평한 표면이 절단을 위해 노출된 표면이 되도록 조직의 방향을 지정합니다.

OCT가 조직 표면을 오염시키지 않도록 하면 후속 질량 분석 분석을 방해할 수 있습니다. 25미크론 두께로 3개의 조직 절편을 절단하고 PET 멤브레인 슬라이드에 장착합니다. 멤브레인을 조직 섹션에 부드럽게 터치하고 섹션을 제거합니다.

너무 많은 압력이 가해지면 얇은 멤브레인이 찢어질 수 있습니다. PET 멤브레인이 충전되지 않고 조직 부분의 접착력을 감소시키지 않도록 장착하기 전에 슬라이드를 과도하게 취급하지 마십시오. 멤브레인 슬라이드를 실온에서 유지하여 해동 장착되고 조직이 멤브레인에 성공적으로 접착될 수 있도록 합니다.

저온 유지 장치에서 슬라이드를 제거하고 슬라이드를 3분 동안 자연 건조시킵니다. LCM-LC-MS/MS가 즉시 수행되지 않을 경우 슬라이드를 작은 밀폐 밀봉 가능한 백에 밀봉하고 해부에 필요할 때까지 섭씨 영하 80도의 보관소로 옮깁니다. 인접한 부분을 10-12미크론으로 절단하고 헤마톡실린 및 에오신 염색을 위해 표준 유리 슬라이드에 해동 장착합니다.

이때 원하는 다른 조직화학적 염색을 위해 추가 절편을 절단할 수 있습니다. 영하 80도의 보관소에서 슬라이드가 들어 있는 밀봉된 백을 제거하고 5분 동안 실온에 도달하도록 합니다. 콜드 슬라이드가 실험실 대기에 즉시 노출되면 조직이 응결로 코팅되고 약물의 공간적 무결성이 손상될 수 있습니다.

현미경과 레이저를 켭니다. 레이저는 절단을 시작하기 전에 예열하는 데 5분에서 10분이 걸립니다. 플랫 캡 0.20ml PCR 튜브를 홀더에 넣습니다.

가방에서 슬라이드를 꺼낸 후 평판 스캐너를 사용하여 PET 슬라이드의 조직 부분에 대한 광학 이미지를 촬영합니다. 슬라이드를 티슈 면이 아래를 향하도록 슬라이드 홀더에 놓습니다. 현미경 소프트웨어를 사용하여 관심 있는 특정 육아종 영역에 별도의 수집 튜브를 할당합니다.

일반적으로 이들은 관련이 없는 폐, 세포 육아종 및 케이스움이지만 육아종 생검의 특정 병리학에 따라 달라질 수 있습니다. 5X 현미경 대물렌즈를 사용하여 조직에 초점을 맞춥니다. 이 배율은 세포 및 괴사성 육아종 영역을 모두 포함하는 조직에 대한 좋은 개요를 제공해야 합니다.

소프트웨어에서 tube로 지정된 caseum을 선택하여 조직 아래의 위치로 이동합니다. 원하는 해부 매개변수를 입력합니다. 25미크론 두께의 폐 절편에 대한 일반적인 설정은 레이저 출력 30, 속도 15 및 조리개 35입니다.

그러나 이는 사용된 현미경과 레이저의 수명으로 인한 잠재적인 출력 감소에 따라 다릅니다. 자유 그리기 도구를 선택하고 마우스 또는 터치스크린 펜을 사용하여 원하는 해부 영역의 윤곽을 그립니다. 영역의 표면적이 소프트웨어에 표시됩니다.

더 쉽게 해부할 수 있도록 선택한 영역을 500, 000제곱 미크론 미만으로 유지하십시오. 튜브 캡에 총 300만 제곱 미크론이 수집될 때까지 해부를 반복합니다. 경우에 따라 절개된 영역이 주변 멤브레인에 달라붙어 수집 캡으로 떨어지지 않을 수 있습니다.

누적 표면적 총계에서 이러한 영역을 제거하려면, 소프트웨어 내에서 수동으로 선택하고 제거합니다. 다음으로, 세포 병변에 대한 캡을 선택하고 동일한 프로세스를 사용하여 300만 평방 미크론의 조직을 수집합니다. 침범되지 않은 폐에 대한 캡을 선택하고 동일한 프로세스를 사용하여 300만 평방 미크론의 조직을 수집합니다.

관련되지 않은 폐 조직에는 많은 세기관지와 폐포 공간이 포함되어 있습니다. 해부를 위해 정의된 조직 영역에서 이러한 항목을 제외하도록 주의하십시오. 캡 홀더를 제거하고 각 튜브를 조심스럽게 풀고 밀봉하고 라벨을 붙입니다.

절개된 조직을 주변 공기 방해로부터 보호하십시오. 절개된 조직을 즉시 분석하거나 영하 80도에서 보관하고 처리 및 LC/MS 분석 전에 해동합니다. 조직 밀도가 밀리리터당 1g이라고 가정하고 대조 조직의 무게를 50mg으로 측정하고 PBS 완충액을 추가하여 희석하여 균질화 스톡을 준비합니다.

비드 균질화기에서 1750rpm으로 5분 동안 폐 조직과 PBS 완충액을 비드 박동하여 조직을 균질화합니다. 다음으로, 밀리리터당 1밀리그램의 의약품을 일대일 아세토니트릴/물에 희석하여 표준 곡선 스파이킹 솔루션을 만듭니다. 스파이크 부피와 타겟 조직 부피를 기준으로 스파이크 표준 농도를 결정합니다.

예시된 예는 100마이크로리터 스파이크 부피를 사용하는 밀리리터당 100나노그램 표준에 대한 것입니다. 미세 해부된 조직이 들어 있는 튜브를 영하 80도의 온도에서 제거하고 5분 동안 실온에 도달하도록 합니다. 10마이크로리터의 일대일 아세토니트릴/물 용액과 2마이크로리터의 PBS 완충액을 미세절부된 조직이 들어 있는 튜브에 추가합니다.

표준 곡선 및 품질 관리 튜브의 경우 2마이크로리터의 제어 폐 균질산염에 10마이크로리터의 스파이킹 용액을 추가합니다. 각 튜브에 50마이크로리터의 추출 용액을 추가합니다. 각 튜브를 5분 동안 소용돌이치십시오.

그런 다음 5분 동안 초음파 처리하십시오. 다음으로, 5, 5 분 동안 000 rpm에 관을 각 관에 있는 영화 그리고 조직의 펠릿을 형성하기 위하여 관을 분리기. 원심분리 후 50마이크로리터의 상등액을 96웰 딥 웰 플레이트로 옮기고 각 웰에 추가로 50마이크로리터의 탈이온수로 희석합니다.

마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 LC-MS/MS 분석 및 분석법 검증을 수행합니다. LCM-LC/MS 방법은 에탐부톨 스파이크 조직 균질액에서 레이저 미세절부 영역을 분석하여 처음 검증되었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 이 방법은 재현성이 높았으며 우수한 약물 회수율을 보여주었습니다.

여러 폐 조직에서 LCM-LC/MS로 측정한 에탐부톨 농도는 확립된 LC/MS 접근법에 의해 결정된 농도와 직접 비교하여 추가로 검증되었습니다. 등가 농도는 두 기술 모두에 의해 검출되었습니다. 비관련(uninvolved lung parenchyma), 세포 병변 테두리(cellular lesion rim) 및 괴사성 caseum(necrotic caseum) 내의 절대 에탐부톨 농도는 LCM-LC/MS에 의해 결정되었습니다.

Mycobacterium tuberculosis 살균 수준은 모든 병변 구획에서 도달했습니다. 대식세포에서 세포외 복제간균의 99%와 세포내 간균의 99%를 죽이는 데 필요한 최소 농도가 표시됩니다. 이 동영상을 시청한 후에는 조직을 미세해부하고 정의된 폐 육아종 구조 내에서 약물 수준을 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 기술을 통해 항균제 연구 분야의 연구자들은 투여된 약물이 살균 농도로 표적 병원체 집단에 도달하고 있는지 여부를 정확하고 정량적으로 평가할 수 있습니다. 이 접근법은 다양한 조직 및 질병 상태에 광범위하게 적용할 수 있습니다.