Name: 성인 귀 피부에 대 한 전체 실장 Confocal 현미경 검사 법: 신경-혈관 분기 Morphogenesis 및 면역 세포 분포를 연구 하는 모델 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 학습하세요 성인 마우스 귀 피부의 전체 실장 공초점 현미경 검사법으로 말초 신경과 혈관의 분기 형태 발생 및 면역 세포 분포를 시각화하는 방법입니다. 이 기술은 신경혈관 구조와 면역 상호작용 연구에 활용됩니다.

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우리 실험실 관리 K. 길 감사, 기술 지원, 제이 호킨스와 직원의 국립 보건원 (NIH) 건물 50 동물 마우스 관심과 R. 리드와 지원에 대 한 시설과 관리 지원에 대 한 F. Baldrey. 공유 감사 미 링크를 사와 M. Udey에 또한 그들의 귀 피부 해 부 프로토콜, 편집 도움말 및 줄기 세포 연구실의 구성원에 대 한 명. 화상 및 기술 도움말 및 사려깊은 토론에 대 한 신경-혈관 생물학. 토니 야 마자 키 과학 진흥 (JSP) NIH-KAITOKU에 대 한 일본 사회에 의해 지원 되었다. 이 작품은 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소 (HL005702-11 사원)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다

이 섹션에서 모든 실험 국가 심 혼, 폐 및 혈액 연구소 (NHLBI) 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인에서 수행 했다.
1. 성인 마우스 귀 피부 컬렉션
<ol><li>닫힌된 챔버에 이산화탄소 (CO2) 노출 성인 쥐를 안락사 고 자 궁 탈으로는 안락사를 확인 합니다. 참고: 실험 안락사 방법에 대 한 국립 보건원 (NIH) 지침을 따릅니다.</li>
	<li>베이스에서 귀 부하 고 35 x 10 m m2 2 mL의 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)를 포함 하는 배양 접시에. 짧게가 위로 머리카락을 잘라.</li>
	<li>후부 피부와 개입 연골에서 신중 하 게 멀리 앞쪽 피부 껍질. 참고: 연골 앞쪽 피부를 연결합니다.</li>
	<li>뒷부분을 전송 하 고 잘 24에 별도로 앞쪽 피부 플레이트 차가운 신선한 4 %paraformaldehyde (PFA) 잘 당 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 포함 1 mL. 4%에서 후부와 앞쪽 피부를 평평 하 게 PFA.</li>
	<li>1 시간에 4 ° C에서 연골 후부와 앞쪽 피부를 해결할.</li>
	<li>부드러운 실 온에서 믹서에 혼합 된 PBS의 1 mL에 3 시간 5 분 대 한 사후와 앞쪽 피부를 씻어.</li>
	<li>35 x 10 m m2 페 트리 접시의 아래쪽 연골 후부와 앞쪽 피부를 전송 합니다. 접혀 있는 지방 및 결합 조직에는 기본 지역 차단. 고급 곡선된 겸 자 사용 하 여 앞쪽 피부에서 연골을 벗기다.</li>
	<li>조심 스럽게 후부 피부 좋은 곡선된 핀셋을 사용 하 여 내부에서 결합 조직, 지방 조직, 머리카락을 제거. PBS와 젖은 피부 유지.</li>
</ol>2. 전체 마운트 Immunohistochemical 마우스 귀 피부 얼룩
참고: 다음 섹션에서 모든 실험 NIH 실험실 안전 지침에 따라 수행 했다.
<ol><li>블로킹 버퍼를 준비 합니다. 필터 10% 열 비활성화 염소 혈 청 (HIGS) 희석 PBS에 0.2% 트라이 톤 X-100 (TX-100) 블로킹 버퍼, 또는 10% 당나귀 혈 청 (DS)에 희석 PBS 0.2%와 0.45 μ m 필터 단위를 사용 하 여 TX 100 차단 버퍼.</li>
	<li>뒷부분을 전송 하 고 앞쪽 피부는 24 잘 포함 1 mL 10 %HIGS 차단 버퍼 또는 잘 당 10 %DS 블로킹 버퍼의 접시. 부드러운 실 온에서 믹서에 혼합으로 30 분 동안 피부를 품 어.</li>
	<li>블로킹 버퍼에 1 차 항 체 (테이블의 재료)를 diluting 하 여 1 차적인 항 체 솔루션을 준비 (중 10 %HIGS 또는 10 %DS). 참고: 전체 mout immunohistochemical 분석 성인 귀 피부 팬 신경 마커 신경 관련 클래스 III β-tubulin에 항 체 (Tuj1, 토끼 polyclonal IgG 또는 마우스 monocloncal IgG2a, 2 µ g/mL의 최종 농도에서 1: 500 희석) 팬-내 피 세포 마커 혈소판 내 피 성장 세포 접착 분자 1 (PECAM-1, 단일 클로 널 햄스터 IgG, 1:300 희석 3.3 µ g/mL의 최종 농도에), myelin 칼 집 마커 myelin 기본적인 단백질 (MBP, polyclonal IgG, 1: 200 희석에 토끼는 5 µ g/mL의 최종 농도) 및 염증 성 골수성 세포 마커 CD11b (단일 클로 널 IgG2b, 1시 50분을 쥐 20 µ g/mL의 최종 농도에 희석) 그림 1 과 그림 2에 표시 했다. 피부 혈관 평활 근 세포 마커 α 부드러운 근육 걸 (αSMA) 이차 항 체 (2.6) 함께 대 한 Cy3 활용 된 항 체와 알을 품는. 우리 자신에 의해 테스트 1 차 항 체는 테이블의 자료에 나와 있었다. 다른 종에서 파생 된 여러 기본 항 체 동시에 혼합 수 있습니다.</li>
	<li>후부 및 앞쪽 피부 기본 항 체 솔루션의 150 µ L을 포함 하는 새로운 잘 전송. 부드러운 하룻밤 4 ° C에서 믹서에 혼합 된 피부를 품 어.</li>
	<li>다음 날, 24 잘 플레이트에 새로운 우물을 후부와 앞쪽 피부를 전송 하거나 1 차 항 체를 포함 하는 블로킹 버퍼 발음. PBS 0.2% TX 100 세척 버퍼 또는 2% 0.2% TX 100 세척 버퍼 PBS에 희석 DS에에서 HIGS 희석 중 2%의 1 mL를 추가 합니다. 3 변화 세척 버퍼 부드러운 실 온에서 믹서에 혼합과 마다 15 분의 피부를 씻어.</li>
	<li>이차 항 체 솔루션 (재료의 테이블)을 준비 합니다. 블로킹 버퍼에서 이차 항 체 희석 (중 10 %HIGS 또는 10 %DS)와 필터 차단 버퍼 0.22 μ m polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 주사기 필터를 통해 2 차 항 체를 포함 하는 1 mL 주사기에 연결. 참고: 알 렉 사 488 또는 633 활용 된 염소-토끼 IgG (H + L) 또는 Tuj1, 알 렉 사 647 활용 된 염소 항 햄스터 IgG (H + L) PECAM-1, 알 렉 사 488 활용 된 염소-토끼 IgG (H + L), MBP에 IgG2a 마우스 및 알 렉 사 594 활용 된 쥐 IgG (H + L) CD11b 사용 했다 8 µ g/mL의 최종 농도에서 1: 250 희석으로 피부는 Cy3 활용 된 αSMA 항 체 (2-3 µ g/mL의 최종 농도에서 1: 500 희석) 조합에서이 2 차 항 체와 함께 알을 품는.</li>
	<li>블로킹 버퍼에서 이차 항 체의 집계 된 입자를 제거 하는 10 분 13000 x g에서 솔루션 원심 참고: 다른 형광 활용된 2 차 항 체 종에서 파생 된 동시에 혼합 수 있습니다.</li>
	<li>잘 포함 하는 2 차 항 체 솔루션의 150 µ L를 후부와 앞쪽 피부를 전송 합니다. 랩 24 잘 접시 알루미늄 호 일을 빛을 피하기 위해 1 시간 실 온에서 믹서에 부드럽게 혼합과 피부를 품 어에.</li>
	<li>24 잘 플레이트에 새로운 우물을 후부와 앞쪽 피부를 전송 하거나 피펫으로 여 이차 항 체 솔루션을 완벽 하 게 발음 합니다. 2 %HIGS 세척 버퍼 또는 2 %DS 세척 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>24 잘 접시 알루미늄 호 일에 포장 하 고 실 온에서 믹서에 부드러운 혼합으로 15 분 마다 세척 버퍼의 3 변화 씻어.</li>
</ol>3. 슬라이드에서 귀 피부 장착
<ol><li>35 x 10 m m2 페 트리 접시의 하단에는 피부를 놓습니다. 조심 스럽게 제거 머리카락, 지방 조직, 결합 조직, 먼지, 그리고 섬유의 광범위 한 사진 표백을 최소화 하기 위해 낮은 조명 stereomicroscope 아래 고급 곡선된 겸 자 사용 하 여 피부 안쪽에서. PBS와 젖은 피부 유지.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 접착제 현미경 슬라이드를 피부를 전송 합니다. 내부는 후부와 앞쪽 피부 장소 슬라이드에 직면. 집게를 사용 하 여 피부를 평평 하 게.</li>
	<li>Photobleaching를 방지 하 고 보존 형광 신호를 액체 방지 페이드 장착 매체에 피부를 탑재 합니다. 없음 기포 또는 피부 주위에 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>신중 하 게 피부 샘플에 coverslip로 커버 하 고 장착 미디어 회사를 얻을 수 있도록 실내 온도에서 어두운 하룻밤에 탑재 된 피부 샘플 슬라이드를 저장 합니다. 매니큐어와 슬라이드에 coverslip 봉인 하 고 장기 저장을 위한 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
</ol>4. confocal 현미경 검사 법
<ol><li>Fluorophores에 대 한 적절 한 레이저를 설정 합니다. 3 레이저 소스 (아르곤 488 nm, DPSS 561 nm와 HeNe 633 nm)와 confocal 현미경은이 실험에 사용 됩니다.</li>
	<li>동시에 방지 하 고 모든 중복을 줄이기 위해 트리플 스테인드 샘플 흥분 순차적 검사 도구를 사용 합니다. 참고: 이미지 순차 스캔 모드를 사용 하 여 순차적으로 이동 합니다.</li>
	<li>10 X 목표 아래 이미지입니다. 타일 검사 도구를 사용 하 여 전체 귀 피부를 잡으려고. Z-스택 설정 하 고 z-위치 귀 피부의 전체 두께 다루고 있는지 확인 하십시오.</li>
</ol>

<ol><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+confocal+microscopy+for+vascular+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).</li>
<li>Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemical+analysis+for+embryonic+limb+skin+vasculature%3A+a+model+system+to+study+vascular+branching+morphogenesis+in+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Myeloid+Progenitors+Differentiate+into+Pericytes+through+TGF-beta+Signaling+in+Developing+Skin+Vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature.</a> Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).</li>
<li>Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel-dependent+recruitment+of+sympathetic+axons%3A+looking+for+innervation+in+all+the+right+places%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places.</a> J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+CXCL12+and+VEGF-A+regulate+the+patterning+of+arterial+vessel+branching+in+developing+limb+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin.</a> Dev Cell. 24, 359-371 (2013).</li>
<li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. , e51749(2014).</li>
<li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+Whole+Mount%3A+A+Novel+Processing+and+Imaging+Protocol+for+Thick%2C+Three-dimensional+Tissue+Cross-sections+of+Skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Liakath-Ali, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+skin+phenotypes+revealed+by+a+genome-wide+mouse+reverse+genetic+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen.</a> Nat Commun. 5, 3540(2014).</li>
<li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).</li>
<li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Dis%22%5BJournal%5D)">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).</li>
<li>Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of atopic dermatitis.</a> J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).</li>
<li>Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoriasis%3A+what+we+have+learned+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Psoriasis: what we have learned from mouse models.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).</li>
<li>Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+challenges+of+chronic+wounds%3A+searching+for+an+optimal+animal+model+to+recapitulate+their+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity.</a> Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).</li>
<li>O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24615439">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> ILAR J. 54, 259-272 (2014).</li>
<li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Mount+Adult+Ear+Skin+Imaging+Reveals+Defective+Neuro-Vascular++Branching+Morphogenesis+in+Obese+and+Type+2+Diabetic+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models.</a> Sci Rep. 8, (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 성인 귀 피부 신경-혈관 구조와 면역 세포 분포의 분석에 대 한 전체-마운트 immunonohistochemical 영상을 설명합니다. 우리는이 방법은 장점이 수많은 실험 연구자 분기 morphogenesis 주변 신경 및 혈관의 패턴화와 면역 세포와 머리를 포함 하 여 피부 구성의 3 차원 분포 연구에 대 한 생각 모 공입니다. 화상의 결과 추가 정량 분석에 대 한 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 측정할 수 있습니다.
귀 피부의 적절 한 준비는이 프로토콜의 성공을 위해 중요. 첫째, 귀 피부 해야 될 신중 하 게 해 부 마우스 euthanizing 후 곧. 귀 피부의 후부 부분은 연골에서 벗 겨 한다. 다음, 연골 해야 될 벗 겨 앞쪽 피부에서 얼룩이 지기 전에. 둘째, 결합 조직, 지방 조직, 및 머리카락 제거 되어야 한다 하 고 철저 하 게 부드럽게 장착 하기 전에. 피부 표면에 주변 신경의 존재로 인해 주의 제거 신경의 손상을 방지 하려면 필요 합니다. 셋째,...

피부는 3 개의 층으로 이루어져: 표 피, 진 피 및 hypodermis. 그것은 줄기 세포 유지 보수, 차별화, 및 개발으로 재생, tumorigenesis, 및 성인에서 염증 morphogenesis 공부를 모델 시스템으로 사용 되었습니다. 피부 나가도록 풍부한 이며 innervated 주변 신경 및 혈관 시스템의 개발은 잘 조정 되도록 합니다.
우리는 이전 여러 라벨 그대로 주변 신경 및 혈관 그들의 세포질 구성 요소1,2,3, 를 포함 하 여 공부를 함께 전체-마운트 배아 피부 이미징 기술을 증명 하고있다 4: 감각 축 삭, 공감 축 삭, Schwann 신경 세포, 내 피 세포, pericytes, 및 혈관에 혈관 부드러운 근육 세포 (VSMCs). 신생, 동안 기본 모 세관 네트워크 집중적인 혈관 개장 겪 습와 계층적 혈관 분기 네트워크로 개발. 개발 진 피 하거나 hypodermis 동맥 말 초 감각 신경 및 혈관 분기 다음 동맥에 인접 한 양식. 계층적 혈관 네트워크는 철저 하 게 VSMCs 덮여, 후 교감 신경 따라 확장 하 고 큰 직경 혈관1,,56을 자극. 개발 신경 및 혈관 시스템 사이 가까운 협회에 중요성에도 불구 하 고 주요 질문 성인에서 다양 한 병 적인 상황에서 신경-혈관 네트워크에 어떻게 해결 되었습니다. 3-차원 고해상도 영상 해부학 인식할 수 분기 morphogenesis 및 패터 닝 pathogenesis 감사 필요가 있다.
성인 마우스 피부에서 신경 및 혈관 morphogenesis 조직 섹션 얼룩에 의해 일반적으로 분석 된다. 다른 연구 주변 신경 및 혈관, 모 낭, 피지 선 땀 샘, 및 arrector pili 근육7,,89시각화 하 피부 전체 마운트 이미지를 사용 했습니다. 그러나, 성인 피부 두께 전체 깊이에 피부를 분석 하기 어려운 하 게 했다.
현재 연구에서 우리는 이러한 과제를 극복 하기 위해 성인 귀 피부의 새로운 고해상도 전체 마운트 이미징 개발. 귀 피부는 쉽게 액세스할 수 해 부 및 피부 이후 전체 마운트 이미징에 대 한 그것의 전체 깊이 통해. 따라서, 포괄적인 부 량 측정, 피부에 주변 신경 및 혈관 시스템의 3 차원 구조를 비교에 적용 될 수 있는 간단 하 고 매우 재현 방법입니다. 우리는 큰 직경 혈관 주변 감각 및 교감 신경의 맞춤 성인 피부에서 유지 됩니다 설명 했다. 이 프로토콜의 목표는 분기 morphogenesis, 및 주변 신경 및 혈관, 뿐만 아니라 염증 등 다양 한 조건에서 성인 마우스 모델에서 세포 수준에서 면역 세포 분포의 패턴을 시각화 하 고 재생입니다.

<table><tbody><tr><td>10 x 인산염 완충 식염수</td><td>KD Medical</td><td>RGE-3210</td><td>PBS, Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Hank' 제외 s 균형 잡힌 소금 용액</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>HBSS, Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td>PFA, 고정제, PBS에 희석</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>세제</td></tr><tr><td>Normal 염소 세럼</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td>차단/세척 버퍼</td></tr><tr><td>구성 요소 Normal 당나귀 혈청</td><td>Jackson Immuno research</td><td>017-000-121</td><td>차단/세척 버퍼의 구성</td></tr><tr><td>요소 곡선형 미세 핀셋</td><td>Dumont</td><td>RS-5047</td><td></td></tr><tr><td>곡선형 핀셋</td><td>Integra Miltex Vantage</td><td>V918-782, V918-784</td><td></td></tr><tr><td>필터 유닛 0.45 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>157-0045</td><td>여과용</td></tr><tr><td>1 mL 주사기</td><td>Coviden</td><td>8881501400</td><td>용 여과</td></tr><tr><td>주사기 필터 유닛 0.22 mm</td><td>Millex-GV</td><td>SLGVR04NL</td><td>여과용</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36934</td><td>페이드 방지 마운팅 매체</td></tr><tr><td>매니큐어</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72180</td><td>밀봉용</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>그래픽 편집기 소프트웨어</td></tr><tr><td>Illustrator CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>그래픽 편집기 소프트웨어</td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>이미지 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (CD31) 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB1398Z</td><td>Hamster IgG, 혈관 내피 세포 마커, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (CD31) 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>553369</td><td>Rat IgG2a kappa, 혈관 내피 세포 마커, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-&#945;SMA 항체 conjugated with cy-3</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>Mouse IgG2a, 혈관 평활근 세포 마커, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-EphB1 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9319</td><td>염소 다클론, 정맥 내피 세포 마커, 1:100</td></tr><tr><td>Anti-neuron-specific Class III &#946;-tubulin (Tuj1)</td><td>Abcam</td><td>AB18207</td><td>Tuj1, 토끼 다클론 IgG, 범축삭 마커, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Tuj1 항체</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>마우스 IgG2a, 범 축삭 마커, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-MBP 항체</td><td>Abcam</td><td>AB40390</td><td>Rabbit polyclonal IgG, 수초화 마커, 1:200</td></tr><tr><td>항티로신 하이드록실라제 항체</td><td>Chemicon</td><td>AB152</td><td>토끼 다클론성, 교감신경 마커, 1:500</td></tr><tr><td>항-페리페린 항체</td><td>Chemicon</td><td>AB1530</td><td>Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-CD11b antibody</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA74G</td><td>Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophage), 1:50</td></tr><tr><td>Anti-CD45 antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0451-85</td><td>Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-CD3 antibody</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1477T</td><td>Rat IgG1, 면역 세포 마커, 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD45R (B220) 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0452</td><td>Rat IgG2a kappa, 염증 세포 마커, 1:200</td></tr><tr><td>Anti-GFP 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11122</td><td>Rabbit polyclonal, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-GFP 항체</td><td>Abcam</td><td>Ab13970</td><td>Chicken polyclonal, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-&#946;-gal 항체</td><td>Cappel</td><td>55976</td><td>토끼 다클론성, 1:5000</td></tr><tr><td>Anti-RFP 항체</td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td>토끼 다클론성, 1:300</td></tr><tr><td>염소 항토끼 IgG(H+L) Alexa 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td>토끼 다클론 2차 항체, 1:250</td></tr><tr><td>염소 항햄스터 IgG(H+L) Alexa 647</td><td>Jackson Immuno research</td><td>127-605-160</td><td>햄스터 다클론 2차 항체, 1:250</td></tr><tr><td>염소 항 쥐 IgG (H + L) Alexa 594</td><td>Jackson Immuno 연구</td><td>112-585-167</td><td>쥐 polyclonal 2 차 항체, 1:250</td></tr><tr><td>염소 항 마우스 IgG2a Alexa 633</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21136</td><td>마우스 IgG2a 2 차 항체, 1:250</td></tr></tbody></table>

성인 귀 피부에 대 한 전체 실장 confocal 현미경 검사 법: 신경-혈관 분기 morphogenesis 및 면역 세포 분포를 연구 하는 모델 시스템

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

여기, 우리는 전체 산 성인 귀 피부 세포 수준에서 면역 세포 분포 뿐 아니라 포괄적인 3 차원 신경-혈관 분기 morphogenesis 패턴화, 공부 하 기술 이미징의 프로토콜 제시. 성인 조직에 주변 신경 및 혈관 해 부 구조 분석 기능 신경-혈관 배선 및 상처 치유 등의 병 적인 상태에 신경-혈관 변성의 이해에 몇 가지 통찰력을 제공합니다. 매우 유익한 모델 시스템으로 우리 해 부에 쉽게 접근할 수 있는 성인 귀 피부에 우리의 연구를 집중 했다. 전체 피부, 말 초 신경 (감각 축 삭, 공감 축 삭, Schwann 세포), 혈관 (내 피 세포와 혈관 평활 근 세포에서에서 세포 구성 성분의 정확한 묘사를 제공 하는 우리의 간단 하 고 재현 가능한 프로토콜 ), 그리고 선 동적인 세포. 우리는이 프로토콜 주변 신경 및 혈관에 있는 형태학 적 이상 뿐만 아니라 다른 병 적인 조건 하에서 성인 귀 피부에 염증을 조사 하는 방법을 포장 됩니다 믿습니다.

성인 마우스 후부 귀 피부 (그림 1A)와 귀 앞쪽 피부 (그림 1B) 했다 αSMA (레드), Tuj1 (녹색), 항 체와 함께 immunostained 및 PECAM-1 (파란색). 후부 피부 immunostained 신경-면역 배포 CD11b (적색) 및 MBP (녹색), Tuj1 (파란색)와 (그림 2A)에 항 체를 사용 하 여 공부를 했다. CD11b의+ 염증 세포, 대 식 세포를 포함 하 여 단일 세포 해상도 (그림 2B)에서 발견 되었다.
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여기, 분기 morphogenesis 면역 세포 분포 뿐만 아니라 주변 신경 및 혈관의 패턴을 시각화 수 있습니다 전체 성인 마우스 귀 피부에 높은 해상도 전체 마운트 이미징 방법을 설명 합니다.

성인 귀 피부에 대 한 전체 실장 Confocal 현미경 검사 법: 신경-혈관 분기 Morphogenesis 및 면역 세포 분포를 연구 하는 모델 시스템

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

이 절차의 전반적인 목표는 말초 신경 및 혈관의 분지 형태 형성 및 패턴화, 면역 세포 분포를 시각화하는 것입니다. 이 방법은 염증뿐만 아니라 말초 신경과 혈관의 형태학적 이상을 조명하여 신경생물학, 혈관 생물학 및 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 강점은 피부의 말초 신경, 혈관 및 면역 세포의 세포 구성 요소를 전체 깊이에 걸쳐 시각화할 수 있고 신경계와 혈관계의 3차원 구조를 비교할 수 있다는 것입니다.이 방법은 정상 및 병리학적 조건에서 청소년 마우스에서 성인 마우스에 이르는 신경 혈관 구조 및 면역 세포 분포에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 성체 쥐를 안락사시킨 후, 귀 밑부분을 절개하고 HBSS 2밀리리터가 들어 있는 35 x 10mm 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 가위를 사용하여 머리카락을 짧게 다듬습니다.중간에 있는 연골에서 뒤쪽과 앞쪽 피부를 조심스럽게 벗겨냅니다. 피부의 각 부분을 웰당 PBS에 1ml의 얼음처럼 차가운 신선한 4% PFA가 들어 있는 24웰 플레이트로 개별적으로 옮깁니다. 그런 다음 PFA로 피부를 평평하게 만듭니다.그런 다음 연골이 있는 뒤쪽과 앞쪽 피부를 섭씨 4도에서 1시간 동안 고정합니다. 그런 다음 PBS 1ml를 사용하여 실온에서 부드럽게 섞으면서 5분 동안 피부를 세 번 씻습니다. 연골이 있는 피부를 35x10mm 페트리 접시의 바닥으로 옮깁니다.가늘고 구부러진 집게를 사용하여 앞쪽 피부에서 연골을 벗겨냅니다. 그런 다음 접혀 있고 지방 조직과 결합 조직이 있는 기저 부위를 잘라냅니다. 같은 집게를 사용하여 뒤쪽 피부 안쪽의 털, 지방 조직 및 결합 조직을 조심스럽게 제거합니다.PBS를 사용하여 피부를 촉촉하게 유지하십시오. 전체 마운트 면역조직화학적 염색을 수행하려면 웰당 1ml의 10% 열 비활성화 혈청 차단 버퍼가 포함된 24웰 플레이트로 후방 및 전방 피부를 옮깁니다. 실온에서 30분 동안 부드럽게 섞어 피부를 배양합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 블로킹 버퍼에서 1차 항체를 희석하고, 블로킹 버퍼에 있는 1차 항체 150마이크로리터를 웰에 추가합니다. 그런 다음 후방 및 전방 피부를 1차 항체가 포함된 새로운 웰로 이식합니다. 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 부드럽게 섞어 피부를 배양합니다.다음 날, 피부를 새로운 웰로 옮기거나 1차 항체를 흡인시킨 후, 0.2%Triton X-

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 전체 마운트 immunohistochemistry를 소개하고 레이저 마우스 배아 사지 피부에 복잡한 혈관 네트워크 형성을 분석하는 데 여러 상표와 공촛점 현미경을 검사합니다.

배아 림브 스킨 Vasculature에 대한 전체 마운트 Immunohistochemical 분석 : 엠브료에 혈관 분기 Morphogenesis를 공부하는 모델 시스템

세포 외 기질은 상처 치유, 염증과 종양 발생시 상당한 개조를 겪는다. 우리는 섬유의 역학뿐만 아니라 표면 형광 또는 이광자 현미경을 사용하여 높은 공간 및 시간 해상도를 가진 메쉬 형상의 매트릭스 성분을 시각화하는 신규의 intravital 면역 형광 현미경 방식을 제시한다.

표면 형광을 가진 조직 매트릭스 구성 요소 및 두 개의 광자 현미경의 장기의 intravital 면역 형광 이미징

이러한 모낭과 신경 엔딩으로 - - 공간 조직의 독특한 패턴을 전시 포유류의 피부 구조의 다양한 배열을 포함합니다. 플랫 마운트로 피부를 분석하는 것은 피부 구조의 전체 두께의 고해상도 이미지를 생성하기 위해이 조직의 2 차원 적 형상을 이용한다.

마우스의 피부와 모낭 패터닝 및 감각 축삭 형태학의 분석에의 응용의 평면 마운트 이미징

우리는 세 가지 그대로 인공 회전 (정점, 중,베이스)로 코르티 성인 기관을 분리하는 방법을 제시한다. 또한 형광 태그 항체 면역 염색을위한 절차를 보여준다. 함께 이들 기술은 달팽이관 검색된 유모 세포,지지 세포 및 다른 세포 유형의 연구를 허용한다.

전체 마운트 해부 및 성인 마우스 달팽이관의 면역 형광

염증 부위에서 이펙터 CD4 T 세포의 삽입 운동을 제어하는​​ 메카니즘은 상대적으로 알려져 있지 않다. 우리는 시각화 현장에서 이러한 세포의 동적 거동의 연구를 허용 염증 귀 진피의 시험 관내 -primed CD4 T 세포에서 조작하는 비 침습적 방법을 제시한다.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

여기에서는 스티릴 피리디늄 염료로 염색 및 탈색하는 동안 마우스, 귀 피부, 모낭을 신경 분포시키는 말뚝 말단의 살아있는 피침형 감각 말단을 이미징하기 위한 새로운 준비에 대해 설명합니다.

의 헤어 난포 피침 엔딩에서 생활 신경 터미널 라벨의 광학 모니터링<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 마우스 귀 피부

이 프로토콜은 자석 클램프를 사용하여 마우스 귀 피부에 허혈 - 재관류 (IR) 모델의 유도를 설명합니다. 맞춤 제작 된 생체 내에 이미징 모델을 사용하여, 우리는 생체 내 염증 반응 후 재관류에서 공부합니다. 이러한 기술의 발달 배후의 이론적 근거는 백혈구 IR 피부 손상에 반응하는 방법에 대한 이해를 확장하는 것이다.

면역 반응의 생체 내에 다중 광자 이미징을위한 마우스 귀 피부에 유도 허혈 - 재관류 손상

털이없는 SKH1 - 시간의 시간 마우스의 귀 모델은 검토 미세 혈관 침대에서 사전 수술 준비없이 미세과 광독성 혈전 유도의 생체 내에 형광 현미경을 할 수 있습니다. 따라서 털이 마우스의 귀는 미세 혈관 혈전 형성, 혈전 진화 및 혈전 용해시 복잡한 상호 작용을 연구하는 생체 모델의 우수합니다.

털이 마우스의 귓불에서 생체 내에 현미경 및 혈전 유도

병아리는 다양한 연구를 위해 비용 효율적이고 접근 가능하며 널리 이용 가능한 모델 유기체입니다. 여기에서는 조류 내이 발달 및 재생의 기초가되는 분자 메커니즘을 이해하기 위해 일련의 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다.

조류 내이 발달을 연구하는 Ovo 및 Ex Ovo 방법에서

이 프로토콜은 도립 컨포칼 현미경을 사용하여 생체 내 이미징을 단순화하는 새로운 도구를 제공합니다.

도립 컨포칼 현미경에서 상피 조직 역학의 장기 모니터링을 위한 간소화된 생체 내 이미징 접근 방식

생쥐 내이 조직의 초보 사용자를 위한 이 프로토콜은 단면 면역 염색을 위한 다양한 발달 단계에서 생쥐 내이를 처리하는 단계를 포괄적으로 자세히 설명합니다.

냉동 절제 및 면역 염색 마우스 내이 조직: 배아에서 성체 단계까지

학습하세요 성인 마우스 귀 피부의 전체 실장 공초점 현미경 검사법으로 말초 신경과 혈관의 분기 형태 발생 및 면역 세포 분포를 시각화하는 방법입니다. 이 기술은 신경혈관 구조와 면역 상호작용 연구에 활용됩니다.

성인 귀 피부에 대 한 전체 실장 Confocal 현미경 검사 법: 신경-혈관 분기 Morphogenesis 및 면역 세포 분포를 연구 하는 모델 시스템

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