단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

이 절차의 전반적인 목표는 광범위하게 사용 가능한 405 나노미터 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 국소화된 DNA 이중 가닥 절단을 생성하고 이러한 병변에서 DNA 복구 인자의 역학을 정량화하기 위한 자동화된 절차를 제공하는 것입니다. 이 방법은 주어진 단백질이 이중 가닥 DNA 절단에 동원되는지 여부를 결정하고 DNA 병변에서 축적을 조절하는 신호 경로를 설명하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 일반적으로 사용 가능한 컨포칼 현미경 시스템을 사용하여 DNA 손상을 국부적으로 유도합니다.

이를 통해 거의 모든 실험실에서 DNA 손상 반응의 동역학을 연구할 수 있습니다. 형광 표지된 단백질의 실시간 동원을 모니터링하는 경우, 일시적인 transfection을 수행하거나 관심 단백질을 발현하는 안정적인 세포주를 선택하여 형광 리포터와 융합합니다. 마이크로 방사선 조사 실험 24 시간 전에, 씨 40, 170 미크론 두꺼운 coverslip 같이 유리제 중합체 바닥과 더불어 8 우물 배양 활주에서, 10%FBS를 포함하는 DMEM 1X에 있는 우물 당 000의 U2OS 세포

섭씨 37도에서 5%CO2로 밤새 세포를 배양합니다. 405 나노미터 레이저에 노출되어 생성되는 이중 가닥 절단의 수를 늘리려면 적절한 배지에서 밀리리터당 10마이크로그램으로 BBET를 셀에 추가합니다. 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에서 15분 동안 세포를 처리합니다.

마이크로 방사선 조사 전에 마이크로피펫을 사용하여 페놀 레드가 없는 배지로 세포를 두 번 헹구어 세포가 405 나노미터 레이저에 최대한 노출되도록 합니다. 405 나노미터 레이저가 장착된 모든 컨포칼 현미경을 이 방법에는 사용할 수 있습니다. 사용자는 생리학적 수준의 DNA 손상을 달성하기 위해 시스템을 신중하게 보정해야 합니다.

자세한 프로토콜에서 이 작업을 수행하는 방법을 설명합니다. 405 나노미터 레이저가 장착된 적절한 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 선택하십시오. 현미경과 환경 챔버를 켭니다.

세포가 잘 분포된 필드를 선택하고, 초점을 조정하고, 위치를 등록하여 면역형광 프로토콜 이후 이미지 획득을 용이하게 합니다. 라이브 이미징을 위해 형광 표지된 단백질을 사용하는 경우, 미세 방사선 조사 후 단백질 동원의 동역학을 모니터링하기 위해 손상 전 기준점 역할을 할 이미지를 하나 이상 획득합니다. BBET 표지 세포를 사용하는 면역형광 실험의 경우, 불필요한 DNA 손상을 방지하기 위해 세포를 시각화하기에 충분한 최저 레이저 출력에서 405 나노미터 레이저를 사용하여 세포에 대한 초점을 조정합니다.

형광 표지된 관심 단백질을 발현하는 세포를 사용하는 경우, 대표적인 형광 강도를 가진 초점면을 선택하십시오. 시스템의 광표백 후 형광 회수 모듈을 사용하여 미세 조사 단계를 위한 현미경을 구성합니다. 현미경 시스템의 FRAP 모듈을 사용하여 미세 조사될 관심 영역을 선택합니다.

이 작업이 완료되면 세포를 미세 조사합니다. 일반적으로 염색질 관련 인자는 2분 이내에 이중 가닥 절단으로 동원됩니다. 뉴클레아제에 의한 단절의 절제는 단일 가닥 DNA를 생성하고, 미세 방사선 조사 후 10분 후에 검출 가능한 상동 재조합 인자의 모집을 촉진합니다.

미세 조사 후, 면역 형광을 위해 샘플을 처리하기 전에 필요한 기간 동안 5%CO2로 섭씨 37도의 인큐베이터에 멀티웰 슬라이드를 다시 넣습니다. 또는 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 실시간 타임랩스 이미징을 즉시 진행하십시오. 분석을 시작하려면 피지에서 획득한 이미지를 엽니다.

micro-irradiation analysis suite의 풀다운 플러그인 메뉴에서 Damage Analyzer를 선택합니다. 시간 단위와 프레임 사이의 시간 간격을 정의한 다음 StackReg 알고리즘을 사용하여 이미지 시리즈를 등록합니다. 프롬프트에 따라 각 마이크로 조사된 세포에서 배경 관심 영역 또는 ROI를 정의합니다.

또한 각 미세 방사선 조사 세포에서 조사되지 않은 ROI와 조사된 ROI를 정의합니다. 전체 타임랩스 시리즈에 걸쳐 모든 ROI 데이터가 수집되면 결과가 포함된 플러그인에서 만든 파일을 쉼표로 구분된 파일로 저장합니다. 이 파일에는 각 시점과 각 ROI에 대한 평균 intensity의 측정값이 포함되어 있습니다.

모든 미세조사된 세포에 대해 플러그인을 사용하여 분석을 수행하고, 시간 경과에 따른 미세조사된 영역에서의 상대적 농축을 그래프로 표시합니다. 이 단계는 최소 15-30개의 셀에 대해 반복되어야 하며 각 데이터 포인트에 대한 평균 보강 및 평균의 표준 오차를 계산하고 표시해야 합니다. 마이크로피펫을 사용하여 멀티웰 현미경 슬라이드의 웰에서 매체를 조심스럽게 제거합니다.

기다리지 않고 용액을 두 번 변경하여 즉시 500마이크로리터의 IF 세척 용액으로 세포를 세척하십시오. 그런 다음 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 IF 추출 전후 용액을 사용하여 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 15-30초 동안 손으로 부드럽게 휘젓어 대부분의 세포질 및 핵질 단백질을 제거하고 염색질 및 DNA 관련 인자의 신호를 최대화하는 추출 전 단계를 수행합니다.

다음으로, 500마이크로리터의 IF 세척액으로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 IF 고정 용액을 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 500마이크로리터의 IF 세척액으로 두 번 세척한 후, 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 IF 추출 전후 용액을 넣고 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.

슬라이드를 손으로 부드럽게 휘둘러 투과화 단계를 수행합니다. 500마이크로리터의 IF 세척액으로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 IF 차단 용액으로 실온에서 최소 30분 동안 배양합니다.

마이크로피펫을 사용하여 차단 용액을 제거하고 250마이크로리터의 1차 항체 용액을 추가합니다. 그런 다음 섭씨 4도의 가습실에서 밤새 세포를 배양합니다. 다음날, 500마이크로리터의 IF 세척액에 5분 동안 세포를 부드럽게 저어 넣어 4회 세척합니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 1시간 동안 세포를 가습된 챔버에서 차단 용액에 희석된 250마이크로리터의 2차 항체로 배양합니다. 형광 표지된 2차 항체를 추가할 때 빛으로부터 샘플을 보호합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 IF 세척 용액에 5분씩 세포를 4회씩 부드럽게 저어 넣습니다.

핵을 염색하기 위해 1밀리리터당 1마이크로그램의 DAPI를 포함하는 500마이크로리터의 1X PBS에서 실온에서 5분 동안 세포를 배양합니다. 500마이크로리터의 1X PBS로 세포를 두 번 세척한 후 이미징을 위해 500마이크로리터의 1X PBS 용액에 세포를 그대로 둡니다. 격자 슬라이드 또는 등록된 스테이지 위치를 사용하여 잘 특성화된 DNA 손상 마커를 사용하여 미세 조사된 세포를 찾습니다.

레이저 스캐닝 컨포칼 현미경의 적절한 설정을 사용하여 모든 관련 채널에서 멀티웰 배양 슬라이드를 이미지화합니다. 사전 감작된 세포에 대한 레이저 미세 조사는 DNA 이중 가닥 절단의 생성으로 이어지며, 이는 뉴클레아제에 의해 절제되어 단일 가닥 DNA를 생성합니다. 큰 염색질 도메인으로 퍼진 단백질 또는 변형은 미세 조사 후 2분 이내에 넓은 줄무늬로 나타납니다.

이는 인산화된 히스톤 변이체 H2A를 표적으로 하는 항체에서 관찰된 패턴에 의해 예시됩니다. X. 단일 가닥 DNA는 복제 단백질 A에 대한 항체를 사용하여 나중에 반점 초점으로 시각화 할 수 있습니다.이 방법을 사용하면 53BP1이 큰 염색질 도메인에 모집되는 반면 PRP19 E3 유비퀴틴 리가제는 RPA 코딩 단일 가닥 DNA에 모집되는 것이 분명합니다. 형광 리포터로 태그된 단백질을 인코딩하는 플라스미드의 transfection과 micro-radiation을 통해 DNA 병변에 대한 단백질 동원을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다.

EGFP를 발현하는 플라스미드로 transfection된 BRDU pre-sensitized 세포 또는 GFP에 융합된 RPA32에 대한 미세 조사는 EGFP 단독이 아닌 RPA32-GFP가 이중 가닥 DNA 절단의 절제에 의해 생성된 단일 가닥 DNA로 빠르게 모집됨을 보여줍니다. 이 그래프는 미세 조사 분석 Fiji 플러그인으로 분석된 15개의 독립 세포로부터 미세 조사 유전자 자리에서 시간 경과에 따른 RPA32 GFP 신호 농축의 정량화를 보여줍니다. 이 기술을 마스터하면 형광 표지된 단백질을 발현하는 10-15개의 개별 세포에 대한 실시간 이미징을 위해 약 4시간 내에 완료할 수 있으며, 미세 방사선 조사 유전자좌에서 단백질 모집을 모니터링하기 위해 면역 형광을 사용할 경우 2일 이내에 완료할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 레이저 스캐닝 현미경을 구성하고 이를 사용하여 세포를 미세 조사하고 실시간 및 고정 세포 모두에서 손상 부위에 대한 DNA 복구 인자의 모집을 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 여기에 설명된 조건은 이중 가닥 절단뿐만 아니라 다른 유형의 병변도 생성한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 그러나 사용자는 미세 조사 및 사전 감작 방법을 변경하여 연구와 관련된 특정 유형의 병변을 생성할 수 있습니다.

이러한 절차에 따라, 확립된 DNA 손상 반응 인자의 고갈은 관심 단백질에서 특정 도메인의 돌연변이이며, DNA 파괴에서 이러한 인자의 모집 메커니즘에 대한 추가적인 통찰력을 제공하기 위해 수행될 수 있습니다. 레이저와 파라포름알데히드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 개인 보호 장비를 착용하고 필요할 때 화학 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.