Name: 단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: 배우세요 405 nm 레이저 공초점 현미경을 이용한 국소적 DNA 이중가닥 절단 유도 및 DNA 복구 인자 역학 정량화 방법을. U2OS 세포에서 형광 단백질의 실시간 모집을 관찰하여 DNA 손상 응답 기전을 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 자연 과학 및 공학 연구 위원회 캐나다의 [검색 부여 5026 오전]와 암 연구 학회 [오전에 21531]에서 과학자 장학금의 다음 세대에 의해 지원 되었다. 장-프랑수아 Lucier는 통계 분석에 피지 파이썬 스크립트 및 조언의 우수한 품질 관리를 제공 하는 감사 합니다. 우리는 경우 고정 솔루션 제조 법에 대 한 박사 스테파니 A. Yazinski 감사합니다. 우리는 레이저 전력 측정에 대 한 폴 뤼도 Karsenti를 감사합니다.

1입니다. 셀의 사전 민감성
<ol><li>마이크로-방사선 실험 전에 24 h 씨 1 x DMEM 포함 10% FBS 8 잘 문화에서 405 nm 레이저 빛와 우수한 이미징의 극대 투과율을 보장 하기 위해 170 µ m 두께 coverslip 모양의 유리/폴리머 바닥으로 슬라이드에 잘 당 40000 U2OS 셀 레이저 스캐닝과 더불어 confocal 현미경을 거꾸로. 8 잘 microslide를 사용 하는 경우 모든 후속 및 프로토콜의 세척 단계에 대 한 잘 당 미디어 솔루션의 500 µ L을 사용 합니다. 주: 그들의 평면 형태 때문 잘 준수, 그리고 큰 핵, U2OS 세포 촉진 단백질 모집 마이크로 반구 사이트에서의 검색 하지만 필요에 따라 다른 부착 셀 형식을 사용할 수 있습니다. 셀 이상적으로 이어야 한다 약 80%의 수를 늘리기 위해 마이크로 조사 시 confluency 반구 실험 당 세포. 매우 높은 합류 세포 주기9의 S와 G2 단계는 동종 재결합 등 특정 복구 경로 교란 할 수 있다 세포 주기 변경 될 수 있습니다.</li>
	<li>5% CO2, 37 ° C에서 하룻밤 셀을 품 어 그리고 다음 사전 (1.3 단계) 세포를 민감하게 BrdU 또는 (단계 1.4) BBET (Hoechst 33342). 참고: 라이브 모집 관심 (POI) 병 변 DNA 단백질의 관찰, transfect 또는 transduce 셀 시드 후 형광 단백질 및 POI 24 h 사이의 융합을 운반 하는 플라스 미드 DNA. 24 h 이후-transfection/변환, 사전 민감하게 하 고 마이크로 비추는 세포 DNA 손상 사이트에서 실시간으로 POI의 모집 모니터링.</li>
	<li>DSBs 박람회 405 nm 레이저에 의해 생성 된의 수를 증가, 마이크로 조사 이전 24 시간에 대 한 미디어 BrdU의 10 µ M을 추가 합니다. 마이크로-방사선, micropipette를 사용 하 여 앞서 405 nm 레이저 셀의 최대 노출을 보장 하기 위해 페 놀 레드 없이 매체와 두 번 셀 린스.</li>
	<li>또는, 37 ° c.에 셀 문화 인큐베이터에 적절 한 매체에서 10 µ g/mL에서 BBET와 15 분에 대 한 세포 치료 치료 후, 페 놀 레드 마이크로 조사 전에 없이 매체와 두 번 씻어.</li>
</ol>2입니다. 셀의 마이크로-방사선.
<ol><li>적합 한 레이저 스캔 하는 confocal 현미경을 선택 합니다. </li><li><ol><li></li></ol></li><li> <ol><li><ol><li></ol></li><li><li> </li></ol></li><li> </li><li> </li><li><ol><li></li></ol></li></ol><ol><li> </li><li> </li></ol><ol><li></li><li><ol><li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57410/57410eq1v2.jpg"> </li></ol></li><li><ol><li></li></ol></li></ol><ol><li> <ol><li><ol><li></li><li><li><li></li><li></ol></li><li></ol></li><li> </li><li><li><li><li><li><li><li><li> </li><li><li> </li><li><li><li><li></li><li> </li></ol>

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<li>Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+endogenous+protein+tagging+for+RESOLFT+super-resolution+microscopy+of+living+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells.</a> Scientific Reports. 5 (9592), (2015).</li>
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<li>Dinant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+multiple+DNA+repair+pathways+by+sub-nuclear+damage+induction+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods.</a> Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+laser+systems+to+study+cellular+responses+to+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Research. 37 (9), e68(2009).</li>
<li>Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Laser+Micro-irradiation+for+Examination+of+Single+and+Double+Strand+Break+Repair+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).</li>
<li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).</li>
<li>Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback-regulated+poly%28ADP-ribosyl%29ation+by+PARP-1+is+required+for+rapid+response+to+DNA+damage+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).</li>
<li>Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+proteomics+reveals+a+%CE%B3H2AX-53BP1+interaction+in+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).</li>
<li>Soultanakis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+detection+of+8-oxoguanine+in+nuclear+and+mitochondrial+DNA+of+cultured+cells+using+a+recombinant+Fab+and+confocal+scanning+laser+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

위에서 설명한 방법을 사용 하 여, 405 nm 레이저 마이크로-방사선 사전 BBET 또는 BrdU 응 셀의는 DSBs를 포함 하 여 부착 인간 세포의 핵 내 DNA 변의 지역화 된 세대 수 있습니다. 이러한 DSBs에서 DDR의 활동은 진 핵 세포9,,1819에 다른 방법으로 생성 된 비슷합니다. 마이크로 반구 사이트에서 DSB 절제 리드 ssDNA 세대 RPA32를 대상으로 항 체 또는 RPA32 GFP 융합을 사용 하 여 다음 수 있습니다. Chromatin 관련 요인, 다른 한편으로, 있을 수 있습니다 참고로 γ-H2A.X를 사용 하 여. 일부 염색 질 관련 요인 만큼 γ-H2A.X 초기 DSB에서 확산 되지 않을 수 있습니다 고 punctate foci ssDNA 의무적인 단백질 foci에서 있을 수 있습니다로 표시 됩니다.
<p class="jo...

세포는 DNA 손상의 그들의 게놈 무결성을 위협 하는 내 인 성 및 외 인 소스에 지속적으로 노출 됩니다. DDR 신호 경로 검색 하 고, 신호, DNA 게놈 안정성을 유지 하기 위해 장애 복구의 앙상블입니다. DNA 이중 가닥 틈 (DSBs), DDR 2 무료 플랫폼에서 주로 발생: γ-H2A.X 라는 chromatin와 일반적으로 ssDNA 묶는 복잡 한 RPA1,2코팅 절제 단일 가닥 DNA (ssDNA) 지역.
UV 레이저 마이크로-방사선 사전 티 미 딘 아날로그 5-브로 모-2' deoxyuridine (BrdU) 또는 bisbenzimide ethoxide trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) DNA 염료 감 응 전지의 단일 가닥 나누기 (를 포함 하 여 DNA 변의 혼합물을 만듭니다. SSBs) 및 DSBs chromatin와 ssDNA 플랫폼3,4에 지역화 된 DDR 유도 하. 이전 작품 모집 게놈 DSB에서 이러한 두 가지 플랫폼을 유지 보수 요인의 고 에너지 자외선 레이저 (335-365 nm) 경우2,5와 결합을 사용 하 여 차별 수 있습니다 보여주었다. 높은 에너지 레이저와 전용된 UV-A 전송 목적 405 nm 레이저 confocal 현미경 레이저 스캔 보다 훨씬 덜 학문과 제약 설정에 널리 그들을 만드는 필요한 현미경 같은 레이저 장비는 비용이 많이 드는 라인입니다. 단백질 모집 및 마이크로 반구 사이트에서 exchange의 연구는 또한 게놈 유지 보수 요인의 동적 동작을 설명 하는 데 필요한 힘 드는 수동 이미지 분석에 의해 배제 됩니다.
여기, 우리가 BrdU 또는 BBET 핵 산 얼룩과 셀의 사전 sensitization 마이크로 방사선 일반적인 confocal 현미경에 405 nm 레이저 수 게놈 DNA 병 변에서 유지 보수 요소 역학의 모니터링을 사용 하 여 다음을 보여줍니다. 향상 된 해상도 대 한 필드와 deconvolution의 큰 깊이 z 스태킹 함께 플랫폼 마커로 γ-H2A.X 또는 RPA 복잡 한 소 단위를 사용 하면 차별 요소는 로컬로 채용 DSBs 그 확산 실험 초기 병 변 주변 대형 chromatin 도메인입니다. 명료한 내 핵 구획에 따라 하위이 분류 마이크로 반구 사이트에 보충 하는 새롭거나 단백질의 잠재적인 역할을 수정 하는 데 도움이 됩니다. 또한, 편리한 프로토콜을 제공 하며 빠르게 오픈-소스 소프트웨어 피지 (ImageJ 배포)6,,78을 사용 하 여 게놈 유지 보수 요인의 역학을 분석 하는 파이프라인 최적화. 현재 마이크로 조사 방법에이 수정이 가능한 거의 모든 실험실 설정에서 DDR의 연구를 렌더링합니다.

<table><tbody><tr><td>Olympus FLUOVIEW FV3000 공진 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FluoView FV3000 소프트웨어(버전 2.1)</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>405nm 레이저</td><td>코히런트</td><td></td><td>방사선 소스</td></tr><tr><td>현미경 인큐베이터 AIO-UNO-OLYUS-1</td><td>Okolab</td><td>OKO-UNO-1</td><td></td></tr><tr><td>60X /1.4 대물렌즈</td><td>올림푸스</td><td></td><td>오일 침수 목표</td></tr><tr><td>8-웰 배양 슬라이드가 커버글라스 (X-웰)에 표시됩니다.</td><td>Sarstedt</td><td>94.6190.802</td><td></td></tr><tr><td>U2OS 골육종 인간 세포주</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td>안정 세포주&nbsp;</td></tr><tr><td>4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>주의 독성</td></tr><tr><td>5-브로모-2&프라임;-데옥시우리딘&nbsp;( BrdU)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59-14-3</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>주의 독성</td></tr><tr><td>Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 0.1%&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>TRX777.100</td><td></td></tr><tr><td>트윈-20&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>설탕&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>JetPRIME 트랜스펙션 시약&nbsp;</td><td>Polyplus</td><td>114-07</td><td></td></tr><tr><td>ProLong 다이아몬드 안티페이드 마운턴트와 DAPI&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1X, + 페놀 레드</td><td>Wisent&nbsp;</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1X, - 페놀 레드</td><td>Wisent</td><td>319-051-CL</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 세럼 (FBS)</td><td>Wisent&nbsp;</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>마우스 anti-RPA32 항체</td><td>Abcam</td><td>ab2175</td><td>1:500 for IF</td></tr><tr><td>Rabbit anti-&gamma;-H2A. X 항체</td><td>세포 신호&nbsp;</td><td>9718S</td><td>1:500 IF</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-53BP1 항체</td><td>세포 신호&nbsp;</td><td>4937S</td><td>1:500 IF</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-PRP19 항체</td><td>Abcam</td><td>ab27692</td><td>1:500 IF</td></tr><tr><td>염소 anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647</td><td>세포 신호전달&nbsp;</td><td>4414S</td><td>1:250 IF</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스&nbsp; IgG 알렉사 플루어 488&nbsp;</td><td>세포 신호&nbsp;</td><td>4408S</td><td>1:250 IF</td></tr><tr><td>피지 이미지 분석 오픈 소스 소프트웨어&nbsp;</td><td></td><td></td><td>https://fiji.sc</td></tr><tr><td>1918-K 파워 미터&nbsp; 918D-SL-0D3 센서 포함</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

단백질 dna 장애 405 nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

DNA 손상 응답 (DDR) 사용 하 여 단백질의 과다 검출, 신호, 및 DNA 장애 복구. 이 응답을 묘사 하는 것이 게놈 유지 관리 메커니즘을 이해 중요 합니다. 모집 및 병 변에서 단백질의 교류는 매우 동적, 이후 자신의 연구 신속 하 고 공간 구분 방식으로 DNA 손상을 생성 하는 기능을 필요 합니다. 여기, 우리는 로컬로 사용 하 여 일반적으로 사용 가능한 레이저 검사 confocal 현미경 405 nm 레이저 라인을 갖춘 인간 세포에 DNA 손상을 유도 하는 절차를 설명 합니다. 레이저 줄무늬에서 면역 형광 검사 (IF) 또는 실시간으로 평가 될 수 있다 게놈 정비의 축적 단백질 형광 기자와 태그를 사용 합니다. Phosphorylated 히스톤 H2A를 사용 하 여. (Γ-H2A.X) X 복제 단백질 A (RPA) 표식, 메서드를 인접 chromatin에서 확산에서 로컬로 보충 요인 차별을 충분 한 해상도 제공 합니다. 우리는 더 효율적으로 DNA에서 단백질 relocalization의 활동을 모니터링에 ImageJ 기반 스크립트 손상 사이트 제공 합니다. 이러한 상세는 크게 DDR 역학의 연구를 단순화합니다.

마이크로-방사선, 다음 세포 게놈 정비 단백질1,12의 특성에 따라 특정 기간 동안 복구할 수 있습니다. DSBs는 RPA 및 다른 게놈 유지 보수 요인9급속 하 게 코팅 되어 있는 ssDNA의 제한 된 영역을 만드는 세포 주기의 S와 G2 단계 nucleases에 의해 가장 광대 하 게 처리 됩니다. SsDNA 지역이 광범위 하 게 모집 및 다른 DDR 요인13의 교환에 DDR 동안 수정 되는 염색 질으로 둘러싸여 있습니다. 마이크로 반구 지역에 단백질 모집 경우 모니터링할 수 있습니다 (그림 1A). 일반적으로, 염색 질 관련 요인 (예, γ-H2A.X, 53BP1, 등)는 이전 (1-5 분)에...

DNA 손상 복구 속도 론을 공부 하 고 정의 된 하위 핵 지역에서 병 변 유발 하는 시스템이 필요 합니다. 레이저 검사 confocal 현미경 405 nm 레이저 장비를 사용 하 여 지역화 된 이중 가닥 나누기를 만들고 이러한 병 변에서 수리 요인의 역학을 계량 하는 자동화 된 절차를 제공 하는 방법을 설명 합니다.

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

이 절차의 전반적인 목표는 광범위하게 사용 가능한 405 나노미터 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 국소화된 DNA 이중 가닥 절단을 생성하고 이러한 병변에서 DNA 복구 인자의 역학을 정량화하기 위한 자동화된 절차를 제공하는 것입니다. 이 방법은 주어진 단백질이 이중 가닥 DNA 절단에 동원되는지 여부를 결정하고 DNA 병변에서 축적을 조절하는 신호 경로를 설명하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 일반적으로 사용 가능한 컨포칼 현미경 시스템을 사용하여 DNA 손상을 국부적으로 유도합니다.이를 통해 거의 모든 실험실에서 DNA 손상 반응의 동역학을 연구할 수 있습니다. 형광 표지된 단백질의 실시간 동원을 모니터링하는 경우, 일시적인 transfection을 수행하거나 관심 단백질을 발현하는 안정적인 세포주를 선택하여 형광 리포터와 융합합니다. 마이크로 방사선 조사 실험 24 시간 전에, 씨 40, 170 미크론 두꺼운 coverslip 같이 유리제 중합체 바닥과 더불어 8 우물 배양 활주에서, 10%FBS를 포함하는 DMEM 1X에 있는 우물 당 000의 U2OS 세포.섭씨 37도에서 5%CO2로 밤새 세포를 배양합니다. 405 나노미터 레이저에 노출되어 생성되는 이중 가닥 절단의 수를 늘리려면 적절한 배지에서 밀리리터당 10마이크로그램으로 BBET를 셀에 추가합니다. 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에서 15분 동안 세포를 처리합니다.마이크로 방사선 조사 전에 마이크로피펫을 사용하여 페놀 레드가 없는 배지로 세포를 두 번 헹구어 세포가 405 나노미터 레이저에 최대한 노출되도록 합니다. 405 나노미터 레이저가 장착된 모든 컨포칼 현미경을 이 방법에는 사용할 수 있습니다. 사용자는 생리학적 수준의 DNA 손상을 달성하기 위해 시스템을 신중하게 보정해야 합니다.자세한 프로토콜에서 이 작업을 수행하는 방법을 설명합니다. 405 나노미터 레이저가 장착된 적절한 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 선택하십시오. 현미경과 환경 챔버를 켭니다.세포가 잘 분포된 필드를 선택하고, 초점을 조정하고, 위치를 등록하여 면역형광 프로토콜 이후 이미지 획득을 용이하게 합니다. 라이브 이미징을 위해 형광 표지된 단백질을 사용하는 경우, 미세 방사선 조사 후 단백질 동원의 동역학을 모니터링하기 위해 손상 전 기준점 역할을 할 이미지를 하나 이상 획득합니다. BBET 표지 세포를 사용하는 면역형광 실험의 경우, 불필요한 DNA 손

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

레이저는 자주 DNA 손상에 대한 세포 반응의 연구에 사용된다. 그러나, 이들은 그 공간, 주파수 및 복제 충돌 포크 거의없는 것을 특징으로 병변을 생성한다. 여기서, 우리는 레이저의 국소 interstrand 가교 이러한 매개 변수의 결정을 가능하게하는 방법을 설명한다.

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

레이저 microirradiation는 살아있는 세포에서 DNA 수리의 연구에 대 한 유용한 도구입니다. 다양 한 DNA 병 변 유발 하 UVA 레이저의 사용에 대 한 방법론 접근 표시 됩니다. 우리 지역 microirradiation; 정상적인 세포 주기를 유지 하는 방법을 최적화합니다 따라서, 비친된 세포 유사 분열을 통해 진행합니다.

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

이 프로토콜의 목표 레이저 microirradiation를 사용 하 여 다른 유형의 DNA 손상, 비교적 간단한 가닥 나누기 등 복잡 한 손상, DNA 손상 신호 및 복구 요소에서 어셈블리 피해 사이트 vivo에서 공부를 유도 하는 방법을 설명 하는 것입니다. .

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

공초점 형광 현미경 검사 법 및 레이저 마이크로 조사 제공 도구 DNA 손상 유도 및 선택한 하위 핵 분야에서 DNA 수 선 단백질의 응답을 모니터링. 이 기술은 크게 손상 감지, 신호, 및 채용의 우리의 지식의 전진 했다. 이 원고에서는 단일 및 이중 가닥 브레이크 수리 검사 이러한 기술을 보여 줍니다.

단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

이 프로토콜은 레이저 미세 조사에 의한 DNA 수리 단백질 모집 측정과 같은 하류 현미경 연구를 위한 S상 세포를 효율적으로 식별하는 비침습적 방법을 설명합니다.

S 단계 동안 DNA 모집을 연구하는 레이저 미세 조사

본 연구에서는 각막 상피 상처 치유 중 HSP27의 기능을 평가하기 위해 열 충격 단백질 27(HSP27) 특이적 소형 간섭 RNA를 사용하는 프로토콜을 제시합니다. RNA 간섭은 다양한 세포 유형에서 단백질 기능을 조사하기 위해 유전자 발현을 효과적으로 knockdown하는 가장 좋은 방법입니다.

각막 상피 ​​창상 치유 기간 동안 열 충격 단백질 27의 기능의 RNA 간섭 기반 조사

표적 DNA 손상은 DNA 손상제를 삼중 형성 올리고뉴클레오티드(TFO)에 묶음으로써 달성할 수 있습니다. 변형된 TFO를 사용하여, DNA 손상 특이적 단백질 결합, 및 DNA 토폴로지 변형은 본원에 기술된 변형된 염색질 면역침전 분석 및 DNA 슈퍼코일링 분석의 활용에 의해 인간 세포에서 연구될 수 있다.

도구 나선 왜곡, 사이트 별 DNA Interstrand 가교의 처리에 건축 단백질 HMGB1의 역할을 연구하는

CRISPR 관련 단백질 Cpf1은 원하는 위치에서 이중 가닥 DNA를 절단하여 끈적 거리는 말단을 생성하도록 특별히 고안된 CRISPR RNA (crRNA)에 의해 유도 될 수 있습니다. 이 특성을 바탕으로 DNA 어셈블리 표준 (C-Brick)이 수립되었으며 여기에 그 사용법을 자세히 설명하는 프로토콜이 설명되어 있습니다.

Cpf1을 이용한 C-Brick DNA 표준 어셈블리 프로토콜

우리는 micrococcal nuclease (MNase) 융합 단백질로 게놈 전체 단백질 바인딩 사이트를 매핑하기위한 염색질 immunoprecipitation (ChIP) - 직교 방식 높은 처리량 시퀀싱 (ChEC - seq)와 결합 염색질 내생 절단을 설명합니다.

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

RNA 합성을 측정 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. 5-Bromouridine 셀에 추가 하 고 합성된 RNA에 통합 됩니다. RNA 합성은 반전 녹음 방송 및 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 이라는 분석과 RNA의 5-Bromouridine-타겟 immunoprecipitation 다음 라벨, 직후 RNA 추출에 의해 측정 됩니다.

5-Bromouridine 라벨 및 Immunoprecipitation를 사용 하 여 RNA 합성의 조사

배우세요 405 nm 레이저 공초점 현미경을 이용한 국소적 DNA 이중가닥 절단 유도 및 DNA 복구 인자 역학 정량화 방법을. U2OS 세포에서 형광 단백질의 실시간 모집을 관찰하여 DNA 손상 응답 기전을 연구할 수 있습니다.

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

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