간단 하 고 빠른, 양적 분석 결과에 플라스 미드 DNA-단백질 Crosslinks의 측정 수리에 포유류 세포로 페

이 프로토콜의 목표는 플라스 미드 DNA에 정의 된 DNA-단백질 crosslinks의 수리 계량. Lesioned 플라스 미드는 받는 사람 포유류 세포 선 및 여러 시간 포인트 후 transfection에 수확 하는 저 분자 무게에 페. DNA 복구 속도 스트랜드 특정 뇌관 연장 정량 뒤를 사용 하 여 정량.

이 trans-Pacific primer extension QPCR 에세이의 전반적인 목표는 포유류 세포로의 transfection 후 plasmid DNA에 가교된 부가물의 복구를 정량적으로 평가하는 것입니다. 이 방법은 DNA 복구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. DNA 단백질 가교 결합의 복구에 어떤 경로가 관여하는지 등.

이 기술은 DNA 손상 반응을 더 잘 이해할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. DNA 단백질 가교 결합의 복구와 다른 유형의 DNA 손상이 없는 것을 선택적으로 연구할 수 있기 때문입니다. 이 방법은 DNA 단백질 가교 결합의 복구에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 유형의 DNA 손상에도 적용할 수 있습니다.

abasic 부위 및 기타 중합 효소 차단 부가물과 같은. 이 기술의 주요 장점은 부가물 함유 플라스미드의 복구를 빠르면 2시간 이내에 감지할 수 있다는 것입니다. 처음에는 주택 세포 재활성화를 사용하여 복구를 연구하려고 했지만 이러한 분석은 복구를 직접 측정하지 않거나 복구 효율성을 과대 평가할 수 있습니다.

특히 RNA 중합효소가 불완전한 복구 산물을 읽을 수 있는 경우. 이 방법의 시각적 시연은 정제 및 가닥 특이적 프라이머 확장 단계를 시각화하기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 올리고뉴클레오티드를 함유한 80피코몰을 함유한 용액 20마이크로리터와 10x 리가아제 완충액 5마이크로리터를 혼합합니다.

그리고 10 단위의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 함유하는 용액 1마이크로리터를 추가합니다. 최종 부피를 50마이크로리터로 조정하고 섭씨 37도에서 30분 동안 수조에서 튜브를 배양합니다. 다음으로 얼음에 대한 프라이머 확장 반응을 구성합니다.

열 순환기에서 프로그램을 설정하고 실행을 시작합니다. 배양 후 다른 시약, 효소 및 완충액을 추가하여 총 부피를 375마이크로리터로 조정합니다. 그런 다음 밤새 섭씨 37도의 수조에서 반응을 배양합니다.

페닐-클로로포름 혼합물을 50:50의 비율로 준비하려면 동일한 부피의 페놀과 클로로포름을 첨가하십시오. 그런 다음 두 구성 요소를 모두 혼합하고 21, 130G의 탁상용 원심 분리기에서 5분 동안 회전시킵니다. 스핀이 끝난 후 375마이크로리터의 유기층을 프라이머 확장 반응에 추가합니다. 섞다.

그리고 다시 21, 130G에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 최상층을 조심스럽게 피펫팅합니다. 그리고 아세트산 암모늄과 최종 농도 0.3 어금니까지 혼합합니다.

그런 다음 100% 에탄올 두 부피를 첨가하십시오. 혼합물을 섭씨 영하 20도에서 최소 30분에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 일단 배양 기간이 끝나면, 15, 10 분 동안 4 섭씨 온도에 000 분당 회전수로 표본을 분리기

그런 다음 상등액을 버리고 펠릿을 70% 에탄올로 세척합니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 15, 000RPM의 탁상용 원심분리기에서 샘플을 다시 회전시킵니다. 원심분리 후 상등액을 버리고 펠릿을 100마이크로리터의 물에 용해시킵니다.

50 마이크로리터의 DNA를 34 마이크로리터의 물과 16 마이크로리터의 6x 겔 로딩 염료와 결합합니다. 1x TAE 버퍼에서 2볼트/센티미터로 밀리리터당 0.5마이크로그램의 브롬화 에티듐이 포함된 10cm, 0.8% 저용융 아가로스 겔에서 샘플을 6시간 동안 실행합니다. 그런 다음 면도날을 사용하여 초강력 코일의 DNA를 절제합니다.

그리고 젤 조각의 무게를 잰다. 다음으로, 10mg의 젤 슬라이스를 분해하기 위해 1마이크로리터의 베타-아가라제 반응 완충액을 추가합니다. 그런 다음 슬라이스를 섭씨 65도에서 10분 동안 배양한 다음 열 순환기에서 섭씨 42도에서 냉각합니다.

젤 조각이 용해되어 섭씨 42도까지 냉각되면 베타 아가라제 10개를 넣고 열 순환기에서 섭씨 42도에서 1시간 동안 그대로 둡니다. 1 시간 후 용해 된 젤 슬라이스의 부피를 측정하고 아세트산 암모늄을 최종 농도 0.3 몰에 첨가하고 얼음에서 15 분 동안 배양합니다. 외피 후에, 15, 실내 온도에 15 분 동안 000 G에 혼합물을 원심 분리하십시오.

그런 다음 슈퍼 natant를 수집하고 두 부피의 이소프로판올을 피펫으로 넣고 혼합합니다. 그런 다음 혼합물을 밤새 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 다음 날, 정제된 슈퍼코일 DNA를 섭씨 4도에서 10분 동안 15, 000RPM의 탁상용 원심분리기에서 원심분리합니다.

슈퍼 오염 물질을 제거하고 펠릿을 40 마이크로 리터의 물에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 15마이크로리터의 DNA를 함유한 용액 12피코몰과 36피코몰의 옥소구아닌 글리코실라제 용액을 완충액에 결합하고 최종 부피를 30마이크로리터로 조정합니다. 그런 다음 혼합물을 섭씨 37도의 수조에서 30분 동안 배양합니다.

transfection 하루 전에 6웰 배양 플레이트에 세포를 파종합니다. 다음 날 1.5마이크로그램의 가교 플라스미드와 300마이크로리터의 무혈청 배양 배지를 하나의 튜브에 혼합하여 1마이크로리터의 DNA를 0시간 부호 포인트로 저장합니다. 다른 튜브에서 12마이크로리터의 트랜스펙션 시약과 300마이크로리터의 무혈청 배지를 혼합합니다.

그런 다음 300마이크로리터의 가교 결합된 DNA를 동일한 부피의 희석된 transfection 시약과 결합합니다. 그리고 층류 후드에서 실온에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후 두 우물 각각에 250 마이크로 리터의 복합체를 추가하고 섭씨 37도에서 배양합니다.

최소 1 시간 후, 매체를 제거하고 0.1 몰 EDTA와 함께 0.6 % 나트륨 도데 실 설페이트 용액 1 밀리리터를 첨가하고 실온에서 10-15 분 동안 배양합니다. 그런 다음 고무 경찰관으로 긁어서 세포를 분리하고 1.5ml 마이크로퓨지 튜브로 옮깁니다. 다음으로 200마이크로리터의 5몰 염화나트륨 용액을 1몰의 최종 농도에 추가하고 튜브를 5번 뒤집습니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날 섭씨 4도에서 30분 동안 21, 130G에서 샘플을 원심분리합니다. 원심분리 후 슈퍼 네이턴트를 수집합니다.

그리고 0.3 어금니의 최종 농도에 아세트산 암모늄을 첨가하고 100 % 에탄올을 두 부피로 혼합하여 첨가하여 DNA를 침전시킵니다. 혼합물을 섭씨 영하 20도에서 최소 30분 동안 보관하십시오. 50마이크로리터의 물에 에탄올 침전 및 회수된 DNA 샘플의 재현탁 후, 0시간 샘플을 500마이크로리터의 물에 희석하고 비형질주입 및 형질주입된 샘플을 사용하여 PCR 반응을 구성합니다.

그런 다음 열 순환기에서 프로그램을 설정하고 실행을 시작합니다. 이 트랜스 특이적 프라이머 확장 단계는 손상된 가닥의 증폭을 제공하기 때문에 매우 중요합니다. 사용하지 않으면 델타 CT 값이 1보다 작아 낮은 수준의 DPC 복구를 감지하기 어렵습니다.

8 사이클을 완료 한 후 두 번째 프라이머 100 피코몰을 추가합니다. 그런 다음 transfection되지 않은 샘플과 transfection된 샘플에서 증폭되지 않은 DNA 1마이크로리터를 2x 마스터 믹스, 물 및 두 프라이머 100피코몰과 60마이크로리터의 최종 부피로 혼합합니다. 96웰 PCR 플레이트에 샘플을 세 번 로드합니다.

30 사이클 동안 정량 PCR을 수행하고 각 3회 샘플에 대한 사이클 임계값의 평균을 구합니다. 이 연구에서는 복구된 플라스미드 DNA의 비율을 계산하기 위해 가닥 특이적 프라이머 확장의 유무에 관계없이 QPCR을 수행합니다. 프라이머-확장 샘플과 비-프라이머 확장 샘플 사이의 사이클 임계값 차이를 델타 CT.As 이라고 하며, SSPE-QPCR을 투여한 수리된 샘플은 복구되지 않은 샘플보다 더 큰 델타 CT를 갖습니다.

델타 CT 값에서 계산된 복구율의 대표 데이터에 따르면 형질주입 3시간 후 회수된 샘플은 66%가 복구된 반면 8시간 후 회수된 샘플은 93%가 복구되었습니다. 단백질 가교 효율이 각각 높고 낮은 두 대조군 샘플에서 계산된 백분율 배경 값이 여기에 나와 있습니다. 대조군에 존재하는 낮은 퍼센트의 배경은 효율적으로 가교된 기질만 transfection에 사용되는 이유를 나타냅니다.

이 기술을 숙달하면 2-3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 이 분석에서 배경을 빼기 위해 시간 0 샘플을 채취하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 염기서열 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 다음과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 포유류 세포에서 부가물 함유 플라스미드의 복구를 준비, transfection 및 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 페놀, 클로로포름 및 브롬화 에티듐으로 작업하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 그리고 장갑을 끼고 흄 후드를 착용하고 작업하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 합니다.