Name: 라이브 창 꼬마 선 충 에 Lysosomal Alkalinization 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: 배우세요 C. elegans의 장 리소좀 산성도 손실을 cDCFDA 염료로 평가하는 방법을. 이 간단하고 재현 가능한 기술은 오토파지 연구에서 리소좀 기능과 단백질 분해를 이해하는 데 도움을 줍니다.

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우리는 긴장, 자연과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC), 꼬마 유전학 센터 및 캐나다 재단 혁신 (CFI)에 대 한 자금에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 우리 박사 Exing 왕 (부 교수 감독, 광학 이미징 시설 뿐만 아니라 Lizhen 첸 박사 (셀 시스템의 부 및 해부학, UT 건강 샌 안토니오) 모든 선 충 C. 실험에 대 한 그녀의 실험실 시설의 무제한 사용 허용에 대 한 감사 하 고 싶습니다. UT 건강 샌 안토니오)를 통해 confocal 현미경 검사 법. 우리 또한 박사 마 이런 Ignatius 지원 및 비디오 촬영을 촉진 하기 위하여 격려를 제공 하는 것을 감사 하 고 싶습니다.

1. 얼룩 및 장 리소좀 이미지
<ol><li>씨 선 충 성장 매체 (NGM) OP50와 플레이트
	<ol>
<li>권장된 프로토콜19 당 NGM 접시를 준비 하 고 실 온에서 2 일 동안 건조 닫힌된 접시 허용.</li>
		<li>OP50 박테리아 살 균 Luria 국물 (파운드) 국물에 접종 하 고 36 h 또는 마약은 0.2 ~ 0.4까지 37 ° C에서 떨고 인큐베이터 또는 물 목욕에서 성장. OD와 세균성 문화를 사용 하지 마십시오 > 1 또는 OD < 0.2.</li>
		<li>NGM 접시 건조 되 면, 드롭 (~ 30 µ L)는 격판덮개의 센터에 OP50 inoculum의 장소와 다음 패치에 대략 2 cm x 2 cm 크기에서에 드롭 확산. 참고: 모든 나머지 OP50 inoculum 최대 한 달에 4 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
		<li>OP50 플레이트는 inoculum (약 10 또는 15 분), 건조가 되 면 반전 하 고 36 h에 대 한 37 ° C에서 번호판을 품 어.</li>
		<li>36 h 후 나중에 사용할 때까지 판 인큐베이터와 4 ° C에서 저장소에서 제거 합니다. 참고: 격판덮개는 4 ° c.에 최대 1 달 좋은 되어야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>OP50에 cDCFDA를 보충
	<ol>
<li>보완 하기 위해 cDCFDA OP50 격판덮개에, 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 10 m m cDCFDA의 작업 재고를 준비 합니다. 빛과 나중에 사용-20 ° C에서 저장소에서 보호 cDCFDA 솔루션을 유지.</li>
		<li>전체 패치 cDCFDA 덮여 균일 하 게 되도록 부드럽게 2 cm x 2 cm OP50 패치, 표면에 10 mM cDCFDA 솔루션의 100 µ L를 놓습니다. 참고: 그것은 매우 중요 한 OP50의 전체 패치 cDCFDA 덮여 있다입니다. 필요한 경우, cDCFDA의 최대 150 µ L를 사용 하 여 각 접시. 그것은 또한 절대적으로 모든 cDCFDA OP50 패치에서 흐르는 음식에 통합 되지 것입니다 얼룩 강도 감소 귀 착될 것 이다 이후 cDCFDA 솔루션 OP50 패치의 국경을 넘어 확장 되지 않습니다.</li>
		<li>OP50 번호판을 벤치 위에 어두운 상자 에서도 cDCFDA 솔루션의 모든 세균 패치에 흡수 될 때까지 (일반적으로 약 25 ~ 30 분).</li>
	</ol></li>
	<li>CDCFDA를 사용 하 여 웜 얼룩
	<ol>
<li>일단은 cDCFDA는 완전히 OP50 패치를 침투 해, 접시 당 20 개 이상 벌레 놓고 14 h의 최소 20 ° C에서 거꾸로 접시를 품 어. 참고: 그것은 빛에 노출을 최소화 하기 위해 불투명 한 상자에서 cDCFDA 접시를 권장.</li>
		<li>섭취 량 차이 실험 제어 하 고 cDCFDA 신호를 정상화 (권장) 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) (공동 얼룩 difluoro) 붕 소 (갓 만든된 1mm 솔루션의 2.5 µ L), 산 성 pH 스펙트럼을 통해 그 형광은 크게 비 변형 acidotropic 약한 아민 염료 (시 약의 일반적인 이름에 대 한 재료의 표 참조). 이후이 부적당 한 cDCFDA 착 강도 제공할 수 있습니다 lysosomal pH의 잘못 된 해석에 게 참고: 14 h에 대 한 웜 착 색 하지 않습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>현미경 검사 법에 대 한 슬라이드를 준비
	<ol>
<li>테이프 약 3 인치 미러 (그림 1)과 같은 부드럽고 평평한 표면에 떨어져 라벨의 두 개의 병렬 스트립을 놓습니다.</li>
		<li>코트 발 수 스프레이, 거울의 표면 그리고 과잉 액체를 닦아.</li>
		<li>2 %agarose (증류수 H2O에서에서 해산) 완전히 액 화 될 때까지 전자 레인지에 녹여 다음 테이프의 2 개의 지구 사이 agarose의 50 µ L 드롭 놓고 슬라이드의 스트립에 수직이 되도록 신속 하 게 드롭 현미경 슬라이드 커버 테이프입니다. agarose는 경화 후 슬라이드를 뒤집어 슬라이드, 아래 원형 패드 형성 고 5mm 나트륨 아 지 드 (NaN3) agarose 패드에의 10 ~ 15 µ L를 추가 합니다. 참고: 앤3 시 토 크롬 C 억제제는 그 때 낮은 농도에서 사용, 그들은 이미징 동안 이동 하지 것입니다 벌레를 anesthetizes 역.</li>
		<li>CDCFDA, 보충 OP50 접시에서 벌레를 선택 하 고 어떤 OP50 없이 깨끗 한 NGM 접시에 그들을 전송. 벌레는 벌레의 표면에서 제거 하는 OP50의 대부분을 허용 하는 몇 초 동안에 대 한 이동 하 고 agarose 패드 5 m m 나트륨 아 지 드를 포함 하는 벌레를 전송.</li>
		<li>즉시 커버 슬립을 agarose 패드 커버. 때문에이 벌레 파열 귀 착될 수 있다 너무 많은 압력을 적용 하지 않고 부드럽게 커버 슬립을 배치 해야 합니다. 참고: OP50 박테리아 cDCFDA 보충 형광 현미경 검사 법에 의해 시각화 하는 때, 따라서 그건 나트륨 아 지 드를 포함 하는 agarose 패드에 그들을 배치 하기 전에 가능한 만큼 최고로 벌레를 청소 하는 것이 중요. C. 선 충 (를 포함 하 여 N2, 야생 유형 제어)의 이상의 6 종자를 준비 하는 경우 그것은 agarose 패드에 벌레를 건조 하지 않습니다 있도록 6의 일괄 처리에서 샘플을 준비 하는 것이 좋습니다. 일부 변종에 외 음부는 적절 하 게 계획 하는 것이 중요 하다 그래서 압력 커버 슬립으로 인해 시간의 연장된 기간 후 파열 시작 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Confocal 현미경 검사 법 참고: 일부 현미경 형광의 가변 레벨을 보상 형광 강도 자동으로 증가 하는 내장 기능이 있습니다. 이러한 현미경 이미징 벌레 때문에 그들은 본질적으로 샘플의 형광 강도 증가 것입니다 cDCFDA, 물에 잘 작동 하지 않을 수 있습니다.<ol>
<li>여기/방출 파장 488/530 설정을 사용 하 여 표준 confocal 현미경 이미징 수행 cDCFDA에 대 한 nm. 단일 평면 이미지 (Z 스택을 하지) 장 리소좀의 고 강도 정량화에 대 한 초점 (최대 신호 강도)은 리소좀만 사용. 참고: 아마도 염료 여부의 차이 때문에 인 두를 직접 후부 창 자 세포의 lysosomes 유지 cDCFDA 유전자 형 이나 나이 관계 없이 강도 얼룩, 따라서 주의 해야 이미징 리소좀이이 세포에서 피하려고.</li>
		<li>N2 첫째로 벌레 2 일 오래 된 야생 타입 포함 된 슬라이드 이미지. 이렇게 하는 동안 레이저 전력 등, 작은 구멍, 조리개 cDCFDA 강도 얼룩 하지 oversaturated 되도록 confocal 영상 매개 변수를 조정 합니다. 참고: 일단이 설정을 변경 하지 마십시오 그들 그날 영상의 전체 기간에 대 한.</li>
		<li>소장 (벌레 당 3 ~ 4 이미지)의 단일 평면 1024 x 1024 픽셀의 이미지 캡처는 60 배 확대 렌즈를 사용 하 여. 참고: 벌레에 cDCFDA 방출 스펙트럼 520 nm의 보고 된 형광 스펙트럼20은 장 autofluorescence (그림 3)에서 특정 신호 판독을 제공와 동시에 하나의 눈에 띄는 피크를 얻을 것입니다.</li>
		<li>각 채널에 대 한.tiff 파일로 원시 confocal 이미지 (.lsm 파일)를 내보냅니다.</li>
		<li>다음, ImageJ를 열고 파일을 클릭 | 오픈 측정할 수에 이미지 파일을 엽니다. 이미지 로드, 일단 관심 (ROI)의 영역을 선택 ImageJ에 타원형 모양을 선택 도구를 사용 합니다.</li>
		<li>그 후, 분석 클릭 | 측정 형광 강도 그 투자 수익에 대 한 척도를. 이미지 당 4-5 다른 포커스 리소좀을 선택 하 고 각 지역 관심 (ROI)의 평균 상대 형광 강도 계산.</li>
		<li>각 이미지에 대 한 리소좀 사이 내장의 영역에 배경 형광 강도 측정 합니다. 배경 형광 강도 값을 lysosomal 형광 강도 값에서 뺍니다.</li>
		<li>총, 약 30 ~ 50 테스트할 각 변형에 대 한 cDCFDA 강도 (6 ~ 10 동물)에 대 한 개별 정규화 된 값을 수집 합니다. 이 값을 사용 하 여 적절 한 통계 소프트웨어를 사용 하 여 상자와 수염 음모를. 참고: 얼룩 달라질 수 있습니다 상당히 온도, 보육 시간 및 동물의 전반적인 건강/나이 같은 요인에 따라 형광 강도 비교 같은 얼룩 실험 샘플 프로세스 내에서 관련만 되도록. 그것은 따라서 모든 얼룩 실험에서 컨트롤을 처리 하는 것이 중요입니다. 통계적 차이 계산 (t-테스트) 어떤 적절 한 통계 소프트웨어를 사용 하 여.</li>
		<li>모든 이미지는 이미지 매개 변수를 변경 하지 않도록 주의 복용 순서로 (같은 날에 스테인드) 같은 실험에서 변종.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

노화, 세포 및 분자 이벤트의 다양 한 기여 생활사 특성 및 유전적 요인에 의해 영향을 받습니다. 우리의 최근 연구22 생식 주기 lysosomal pH 역학의 규제를 통해 소마의 피트 니스 조절에 중요 한 역할을 건의 한다. 우리는 동물에 산 성 리소좀 보장 v ATPase 전사의 upregulation에 의해 적극적으로 재현 하는 동안 그 중재 lysosomal 베이스 승진은 보여주었다. 복제, v ATPase 식 상품의 끝 리소좀 alkalinize, 그리고 단백질 집계가이 세포에 축적.
Lysosomal 산성화 손상 장애 변경된 v ATPase 활동에 의해 발생할 수 표시 되었습니다 그리고 v ATPase 뇌의 기능 감소도 제안 되었습니다 다양 한 신경 질환23기초를. 우리의 결과 더 가설 세포 노화 및 노화24의 원인 중 장애인된 v ATPas...

단백질의 외관은 진 핵 세포1,2,3, 그리고 대형의 생각 된다 세포 노화4 의 원리 드라이버 중에 노화의 각 인 될 널리 허용 , 5 , 6 , 7. 나이, 세포로 단백질 놓을 장애인, 단백질 집계에 증가로 이어지는 성장 증거가 있다. 세포 노화에 베이스의 붕괴 autophagy8 프로테아좀 중재 단백질 저하9의 장애를 포함 한다. 마지막으로, 돌이킬 수 없는 단백질 산화 단백질 놓을10더 혼란, 오래 된 세포에서 증가 된다.
Autophagy 처음 손상 된 단백질의 대량 저하에 대 한 비 선택 과정이 될 생각 하지만 최근 연구 결과 그 autophagy는 단백질 집계 되지 않은 역 기능 세포의 놓을에 매우 선택적 표명 의무가 다른 단백질 정리 메커니즘11통해 저하. Autophagy 과정에서 손상 되 고 집계 된 단백질은 autophagosome 라는 이중 막 소포에 격리 됩니다. 이 autophagosome 다음 리소좀, 라는 산 성 세포와 autophagosome 화물12의 저하에 이르게 퓨즈. Lysosomes autophagic 통로의 끝점을 나타내는 고 막 수리, transcriptional 제어 및 영양소 감지; 같은 다른 세포질 과정에 참여 세포질 항상성 (참고 13에서 검토 한 결과)에 그들의 중앙된 역할을 강조 합니다. 여러 연구 lysosomal 함수에는 연령에 따라 감소와 다양 한 신경 장애13사이 연결 표시. 일관 되 게, 이전 셀에 lysosomal 기능을 복원 노화 관련 고기14,15의 발병을 지연 수 있습니다. Intralumen 환경 구성의 연구 이전 셀에 lysosomal 기능의 붕괴 lysosomal 프로 테아 제16의 생산에 있는 감소 때문에 하지는 것이 좋습니다. 또는, intralysosomal 산, 그것의 효소 활동의 중요 한 요구의 손실 리소좀 중재 베이스17드롭 기초 수 있습니다 제안 되었습니다. 이 가설을 찾아보기 수 있도록, 시 약 및 복제 하 고 일관 된 방식으로 라이브 셀에 lysosomal pH에서 동적인 변화를 조사 하는 프로토콜 개발에 필수적 이다.
C. 선 충 의 창 자 벌레에서 주요 대사 조직 이며 조직의 항상성 및 수명의 중요 한 레 귤 레이 터 이다. 우리는 변화를 평가 하기 위해 분석 실험 개발 어떻게 리소좀 중재 하는 베이스를 결정 하는 벌레의 장 리소좀의 루멘의 산 성도에 노화에 기여. PH에 민감한 fluorophores에서에서 사용 된 이전 C. 선 충 장 리소좀을 표시, 하지만 아직 lysosomal pH vivo에서18. 에 있는 작은 증가 감지할 수 있는 성공적인 프로토콜을 설정 하는 노력 되지 않았습니다. 여기, 우리 OP50 음식으로 pH에 민감한 fluorophore (cDCFDA)를 통합 하는 간단 하 고 편리한 먹이 프로토콜을 사용 하 여 C. 선 충 의 장 셀에 lysosomal 산 성도의 손실을 감지 하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>OP50 (E. coli)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>https://cgc.umn.edu/strain/OP50 5</td></tr><tr><td>(6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein diacetate&nbsp에서</td> 온라인으로 주문하십시오.<td>ThermoFisher</td><td>C369</td><td>일반적으로 cDCFDA로 알려진</td></tr><tr><td>9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one 및 (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron</td><td>ThermoFisher</td><td>L7528</td><td>일반적으로 Lysotracker Red Confocal microscope로 알려져 있습니다</td></tr><tr><td>(예: Zeiss LSM 510)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LB 육수 분말</td>에서 무료로 다운로드 <td>ThermoFisher</td><td>22700041</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>S71604</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤 분말</td><td>Sigma</td><td>C3045&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>시그마</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>시그마</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>K3PO4</td><td>시그마</td><td>P5629</td><td></td></tr><tr><td>아지드나트륨</td><td>시그마</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>ThermoFisher</td><td>3406</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>미러 또는 기타 매끄러운 평면</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

라이브 창 꼬마 선 충 에 lysosomal alkalinization 평가

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

선 충 류 꼬마 선 충 (C. 선 충) 널리 장 수 및 발달 경로 연구 하는 데 사용 되는 모델 시스템입니다. 이러한 연구는 동물, 앞으로 고 역 유전자 분석, 붙일 레이블된 생성 단백질의 상대적 용이성 및 초기에 microinjected도 수 형광 염료의 사용 능력의 투명도 의해 촉진 된다 배아 세포 세포 (예 9-diethylamino-5 H-benzo (a) phenoxazine-5-1 및 (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-를 그것의 음식 (E. 콜라이 긴장 OP50)에 법인 또는 [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron)입니다. 여기, 선물이 장 리소좀 얼룩 형광 pH에 민감한 염료를 사용 하 여 라이브 벌레에 lysosomal 산에서 동적, 생리 적 변화를 영상 판독을 제공. 이 프로토콜 lysosomal pH를 측정 하지 않습니다 하지만 오히려 lysosomal 산 성도에 관련 된 생리 적 변화를 평가 하는 신뢰할 수 있는 방법을 설정 하는 것을 목표로. cDCFDA는 형광 fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) 가수분해 시 세포내 esterases 변환 되는 셀 permeant 화합물 이다. 리소좀 안에 Protonation cDCF 어디 축적이 세포에서 트랩 합니다. 4.8의 그것의 낮은 pKa 때문이 염료는 효 모에는 pH 센서로 사용 되었습니다. 여기에 장 리소좀의 산도 평가 하기 위해 음식 보충으로 cDCFDA 사용 하 여 설명 C. 선 충. 이 기술은 살아있는 동물, alkalinizing 리소좀의 검출에 대 한 허용 하 고 노화와 autophagy, lysosomal 속에 대 한 연구를 포함 하는 실험적인 응용 프로그램의 광범위 한 범위를 하고있다.

cDCFDA 얼룩 리소좀 pH 의존 방식에서 그리고 그것의 낮은 pKa와 리소좀에 준비 통풍 관은 이상적인 pH 센서21. cDCFDA 강도 얼룩은 lysosomal pH (즉 착 강도 증가 pH 감소도)18,22에 반비례 한다. cDCFDA 신호는 일관 되 게 약 20mm 클로로퀸, lysosomal 산성화의 억제제로 치료 하는 동물의 리소좀과 웜 v ATPase, 양성자 가져오기22에 필요한 리소좀의 막에 복잡 한 단백질의 고갈 . 이들은 cDCFDA 다른 유전 배경 또는 치료에 얼룩의 상대적 수준을 평가할 때 사용 하 여 중요 한 컨트롤입니다.
우리는 또...

C. 선 충 pH에 민감한 중요 한 염료 5 (6)-카-를 사용 하 여 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)의 소장에 lysosomal 산의 손실을 조사 하는 단계별 가이드

라이브 창 꼬마 선 충 에 Lysosomal Alkalinization 평가

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

이 절차의 전반적인 목표는 예쁜꼬마선충의 장 리소좀에서 리소좀 산의 상대적 손실을 평가하는 것입니다. 이 방법은 리소좀 기능 및 단백질 분해에 대한 정보를 간접적으로 제공함으로써 자가포식 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 간단하고 저렴하며 편리하며 재현 가능하다는 것입니다.우리는 효모의 액포 알칼리화를 평가하는 데 사용되는 염색 기술을 관찰했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. OP50 식품에 cDCFDA를 추가하고 2일 된 야생형 웜을 이미징 제어하는 것과 같은 특정 단계가 중요하기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. NGM 플레이트를 준비한 후 뚜껑을 닫은 상태에서 플레이트를 실온에서 2일 동안 건조시킵니다.그런 다음 멸균 Luria 육수에 OP50 박테리아를 접종합니다. 접종 후 OD가 0.2에서 0.4 사이가 될 때까지 접종제를 인큐베이터에 그대로 두십시오. 그런 다음 OP50 접종제를 드라이 NGM 플레이트 중앙에 한 방울 떨어뜨립니다.다음으로, 스프레더를 사용하여 접종제를 약 2 x 2cm 패치에 펴 바릅니다. 약 15분 후 접종제가 건조된 후 OP50 플레이트를 뒤집습니다. 그런 다음 36시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.배양이 끝나면 사용할 때까지 플레이트를 섭씨 4도에서 옮깁니다. 그런 다음 M9 완충액에 10밀리몰 cDCFDA의 작업 재고를 준비합니다. cDCFDA 용액을 영하 20도의 빛에서 멀리 보관하십시오.그런 다음 100마이크로리터의 10밀리몰 cDCFDA를 피펫팅하여 플레이트의 전체 OP50 패치를 균일하게 덮습니다. cDCFDA 플레이트를 벤치 탑의 어두운 상자에 약 30분 동안 그대로 두십시오. cDCFDA가 OP50 패치에 완전히 침투한 후 플레이트에 20개의 웜을 옮긴 다음 플레이트를 섭씨 20도에서 약 14시간 동안 거꾸로 된 상태로 둡니다.다음으로, 라벨링 테이프 두 줄을 가져다가 매끄럽고 평평한 거울 표면에 1.5인치 간격으로 놓습니다. 그런 다음 거울 표면에 발수 스프레이를 코팅하고 여분의 액체를 제거합니다. 다음으로 증류수에 아가로스 2%를 전자레인지에 녹입니다.아가로스가 액화되면 테이프의 두 스트립 사이에 아가로스 한 방울을 놓고 현미경 슬라이드로 방울을 덮습니다. 아가로스가 슬라이드 아래의 원형 패드 모양으로 굳어지면 슬라이드를 뒤집습니다. 그런 다음 아가로스 패드에 10-15마이크로리터의 5밀리몰 아지드나트륨을 추가합니다.이제 cDCFDA 보충 플레이트에서 OP50이 없는 깨끗한 NGM 플레이트로 웜을 옮깁니다. OP50이 표면에서 제거될 때까지 몇 초 동안 웜을 움직이게 합니다. 그런 다음 5밀리몰의 아지드화나트륨이 함유된 아가로스 패드에 웜을 옮깁니다.커버 슬립으로 아가로스 패드를 빠르게 덮습니다. 다음으로, 60X 확대 렌즈를 사용하여 생후 2일 된 야생형 기생충과 돌연변이 기생이의 장 단일 평면에서 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 ImageJ를 열고 파일을 클릭합니다.그런 다음 열기를 클릭하여 수량화해야 하는 파일을 엽니다. 이미지가 로드된 후 타원형 선택 도구를 사용하여 관심 영역을 선택합니다. 그런 다음 Analyze(분석)를 클릭하고 마지막으로 Measure(측정)를 클릭하여 관심 영역의 형광 강도를 정량화합니다.리소좀 기능 활성을 연구하기 위해 컨포칼 이미징을 사용하여 cDCFDA 염색 강도를 정량화합니다. 이 이미지에서는 야생형 2일차 C.Elegans의 장 리소좀에서 강력한 cDCFDA 형광 신호 강도가 있습니다. 이것은 기능적으로 유능한 산성 리소좀을 나타냅니다.반대로, 형광 강도는 야생형 8일 늙은 벌레의 장 리소좀에서 상당히 억제됩니다. 이것은 2일차 기생충의 장 리소좀과 비교한 것입니다. 그 결과 8일째 된 벌레에서 기능적으로 무능한 알칼리성 리소좀이 존재함을 나타냈습니다.흥미롭게도, cDCFDA 형광의 강도는 야생형 웜과 비교할 때 2일차와 8일째 RNAi 웜 모두에서 현저히 감소했습니다. 여기서, 리소좀 내막에서 액포 ATPase 소단위체를 암호화하는 vha 유전자는 2일차와 8일차에 쓰러졌습니다. 일단 숙달되면 이 전체 염색 및 현미경 검사 요법을 적절하게 수행할 경우 18시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 OP50 식품의 cDCFDA 보충제에 있는 기생충을 최소 14시간 동안 배양하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 살아있는 예쁜꼬마선충의 장 리소좀에서 리소좀 산의 손실을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

출처: Le, T. A. N . 외, 박테리아 및 화학물질이 카 에노르하브디티스 엘레간스의 장 투과성에 미치는 영향 측정. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 Pseudomonas aeruginosa에 노출된 C. elegans의 장 투과성을 정량화하기 위한 형광 기반 분석 방식을 보여줍니다. 대장균을 먹인 대조군과 비교하면, 병원체 처리된 벌레는 체강으로의 형광체 누출이 증가하여 상피 장벽 손상을 나타냅니다.

세균 노출 후 C. elegans 의 장 투과성 평가

이 비디오는 젖산 탈수소효소를 사용하여 세포 용해물에서 젖산을 측정하기 위한 비색 분석에 대해 설명합니다. 이 효소는 젖산을 피루브산으로 변환하고, NAD를 테트라졸륨 염료와 반응하는 NADH로 변환하여 젖산을 정량화하기 위해 분광 광도계로 측정할 수 있는 착색 제품을 제공합니다.

테스트 샘플에서 젖산의 정량화를 위한 비색 분석

우리는 벌레에 amylopathies의 양상을 연구하는 방법을...

<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</emAmylopathy 연구에 대한&gt; 모델 시스템

단백질 항상성, 스트레스 및 노화 사이의 관계를 연구하기 위해 유전적으로 다루기 쉬운 후생동물인 Caenorhabditis elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 기능 장애, 세포 내 단백질 국소화 및 유기체, 세포 및 단백질 수준에서의 단백질 안정성을 추적하여 단백질 접힘의 변화를 모니터링했습니다.

사용 예쁜 꼬마 선충 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

투명 한 선 충 C. 소장"vivo에서 조직 챔버를" 다세포 tubulogenesis 동안 단일 세포 및 subcellular 수준 apicobasal 막과 루멘 속 공부에 대 한 될 수 있습니다. 이 프로토콜 표준 라벨을 결합 하는 방법을, RNAi/손실의 기능 유전자 및 분자 수준에서이 프로세스를 해 부 현미경 접근에 설명 합니다.

C. 선 충 장 한 모델으로 루멘 Morphogenesis 세포를 단일 세포 수준에서 Vivo에서 편광 막 속: 항 체 얼룩이 지기, RNAi 손실의 기능 분석 및 이미징 라벨

C. 선 충 배설 운하 드 노 보 편광 막 속의 시각적 vivo에서 분석에 대 한 고유한 단일 셀 모델입니다. 이 프로토콜 표준 유전 RNAi 및 이미징 접근, 식별 및 분자 단 세포 tubulogenesis, 그리고 꼭대기 막 및 루멘 속 감독의 특성에 대 한 적응의 조합을 설명 합니다.

세포내 루멘 Morphogenesis 그리고 Vivo에서 편광 막 속 단일 셀에 대 한 모델로 선 충 C. Excretory 운하: GFP 융해, RNAi 상호 작용 화면 및 이미징 라벨

우리는 수정 된 소규모 추출 및 젖 산 염 그리고 pyruvate는 선 충 류에서의 색도계 분석 실험 설명 C. 선 충. 상업적인 분석 키트를 이용 하는 때 그들의 감도 정확도의 기술 개발이 중요 합니다. 추출 강 수 단백질은 세포내 대사 산물의 양적 결정에 대 한 가장 중요 한 단계 이다.

소규모 색도계 분석 실험의 세포내 젖이 나올와 꼬마 선 충 의 선 충 Pyruvate

이 프로토콜은 예쁜꼬마선충의장 투과성을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 장 내 박테리아와 숙주 간의 상호 작용과 관련된 장 건강에 대한 기본 생물학적 연구와 새는 장 증후군 및 염증성 장 질환을 치료하는 프로바이오틱 및 화학 약제 식별 스크리닝에 유용합니다.

케노하브디티스 예쁜꼬마선충의 장 내 침투성에 대한 박테리아와 화학물질의 영향 측정

전립선성 감소는 노화의 특징입니다, 신경 퇴행성 질환의 발병을 촉진. 우리는 형광 기자에게 융합 된 폴리 글루타민 반복의 이종 발현을 통해 두 가지 다른 Caenorhabditis elegans 조직에서 프로테오스타시스를 정량적으로 측정하는 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 프로테오스타증의 생체 내 유전 적 분석을 빠르게 허용합니다.

Caenorhabditis 예인단에서 조직 특정 전립선 성 감소를 정량화

자극라만 산란 (SRS) 현미경 검사법은 특정 화학 적 moieties의 선택적, 라벨없는 이미징을 허용하고 효과적으로 생체 내에서 지질 분자를 이미지하기 위해 사용되었습니다. 여기에서, 우리는 SRS 현미경 검사법의 원리에 대한 간략한 소개를 제공하고 Caenorhabditis elegans에있는 지질 저장에 그것의 사용을 위한 방법을 기술합니다.

자극라만 산란 현미경 검사를 사용하여 Caenorhabditis elegans의 지질 저장 역학의 라벨 프리 이미징

생물학을 가르치는 것은 실험을 통해 학생들에게 더 자극을 줄 수 있습니다. 이 원고는 학생들이 고칼로리 다이어트, 굶주림 및 노화와 관련된 가설을 공식화하고 테스트하도록 장려하기 위해 교실에서 사용할 수 있는 두 가지 다르지만 보완적인 프로토콜을 제시합니다.

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)의 글리코겐 축적 및 장 무결성을 시각화하기 위한 저비용 염료 사용

배우세요 C. elegans의 장 리소좀 산성도 손실을 cDCFDA 염료로 평가하는 방법을. 이 간단하고 재현 가능한 기술은 오토파지 연구에서 리소좀 기능과 단백질 분해를 이해하는 데 도움을 줍니다.

라이브 창 꼬마 선 충 에 Lysosomal Alkalinization 평가

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