Name: 미네랄 hFOB 1.19에 의해 생산 및 Saos-2 세포를 사용 하 여 전송 전자 현미경 에너지 흩어진 엑스레이 Microanalysis와 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: 학습하세요 hFOB 1.19 및 Saos-2 세포에서 광물화 프로파일을 비교하는 방법을 전자현미경과 에너지 분산형 엑스선 분석을 사용하여. 이 기법은 뼈 생물학 및 조직 공학 연구에 활용됩니다.

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MK 및 요청 수동 작업을 수행 하는 파운드 그림을 준비 하 고 만든 영화. ASK 쓴 원고, 파운드 쓴 스크립트와 MK 준비 테이블. SM, RB 및 SP는 비판적으로 테이블, 스크립트 및 원고 읽기. 저자 ultramicrotomy와 그녀의 훌륭한 지원에 대 한 한 나 Chomontowska로 Szymon Suski와 헨리크 Bilski 가장 EDX 분석 그들의 훌륭한 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 저자는 전문 영어 교정 패트릭 나무와 지시를 기록 하기 위한 바바라 Sobiak 박사 감사 하 고 싶습니다.
이 일 파운드 및 2016/23/N/NZ1/02449 MK, EU FP7 프로젝트 BIOIMAGINE에 국립 과학 센터, 폴란드 2016/23/N/NZ4/03313에서 교부 금에 의해 물어, 과학 및 고 등 교육의 폴란드어 사역에서 N N401 140639 그랜트에 의해 지원 되었다 : 바이오 이미징 연구 혁신 및 교육, 조지아 No. 264173, 그리고 법정 자금의 Nencki 연구소의 실험 생물학, 아카데미 과학의 폴란드어.

1. 세포 배양 및 치료
<ol><li>층 류 두건 아래 모든 필요한 자료를 넣고 아래 자외선 소독. 문화 미디어는: 1:1 혼합물 햄의 F12 및 DMEM 미디어 2.5 m L-글루타민 보충 100 U/mL 페니실린와 100 U/mL 스, 0.3 mg/mL G418 10% 소 태아 혈 청 (FBS) (v/v) 인간 태아 hFOB 1.19 SV40 큰 T 항 원 페에 대 한 osteoblasts, 그리고 맥 코이 5A 매체 1.5 m L-글루타민 보충과 100 U/mL 페니실린, 100 U/mL 스 15 %FBS (v/v) 인간의 다리 Saos-2 셀.</li>
	<li>5% CO2 의 분위기에서 34 ° C에서 hFOB 1.19 셀과 5%의 분위기 속에서 37 ° C에서 Saos-2 셀 문화 공동2. 층 류 두건에 인큐베이터에서 세포 배양, 어느 hFOB 1.19 또는 Saos-2 셀을 전송 하 고 매체 FBS와 신선한 문화 매체의 10 mL에 변경 합니다.</li>
	<li>자극 (휴식 셀) 없이 셀을 품 어 또는 50 µ g/mL Ascorbic 산 (AA) 7.5 m m β-Glycerophosphate (β-GP), 초순 앞부분에서 준비와 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 필터링 된 다음 그들을 자극 합니다. 문화 매체의 표면에 플라스틱 microcentrifuge 관에서는 자극 제를 추가 합니다. 부드럽게 문화 요리를 저 어 하 고 7 일 동안 품 어.</li>
</ol>2입니다. 칼슘 미네랄의 탐지
<ol><li>인산 염 버퍼 식 염 수와 세포 배양을 세척 (PBS: 125 mM NaCl, 5mm KCl, 10mm 나2HPO4, 1mm KH2포4, pH 7.0).</li>
	<li>추가 2% (g:100 mL)의 5 mL PBS, pH 5.0에에서 아칸소-S 및 미네랄 얼룩을 30 분 동안 접시를 품 어.</li>
	<li>PBS로 3 회 세척. 신중 하 게, 접시 벽에 PBS를 추가 미네랄을 파괴 하지 않으려고.</li>
	<li>칼슘 미네랄 거꾸로 가벼운 현미경을 관찰 하 고 이미지.</li>
</ol>3입니다. UV 빛에서 프로브의 시각화
<ol><li>세포 lysates 콜라 소화 프로토콜24에 따르면 셀 문화, 휴식 또는 7 일에 대 한 자극을 처리 합니다.</li>
	<li>세포 배양에서 매체를 수집 하 고 PBS로 세포 세척.</li>
	<li>0.25 M 자당, 0.12 M NaCl, 0.01 M KCl, 그리고 0.02 M Tris HCl 버퍼, pH 7.45, 3 h 37 ° C에서의 솔루션에 500 U/mL 콜라의 3 mL로 세포를 소화.</li>
	<li>기계적으로 긁어 셀, 플라스틱 microcentrifuge 튜브에 그들을 전송 고 통과 그들 10 번 1 mL 40 U 주사기 0.5 × 16 바늘.</li>
	<li>5 분 동안 500 × g에서 샘플 원심</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 합성 연골 림프 (SCL, 100 m m NaCl, 12.7 m m KCl, 0.57 m m MgCl2, 1.83 m m NaHCO3, 0.57 m m NaH2포4, 5.5 m m D-포도 당, 자당 63mm, 16.5 mM Hepes, pH 7.4)의 500 µ L에 셀 펠 릿을 중단.</li>
	<li>주걱으로 UV transilluminator에 병에서 hydroxyapatite (HA), fluorapatite (FA) 및 chlorapatite (CA) 분말을 전송 및 컨트롤 사용.</li>
	<li>플라스틱 팁 플라스틱 튜브에서 세포 lysates 전송 하 고 신중 하 게 UV transilluminator에 놓습니다.</li>
	<li>받아 아래 보이는 이미지 자외선 빛.</li>
</ol>4. 가장 EDX에 대 한 조사 준비
<ol><li>미네랄의 부정적인 얼룩이 지기에 대 한 준비<ol>
<li>이온된 수의 500 µ L에서 합성으로 생성된 하, CA 및 FA 미네랄25 의 2.5 mg을 일시 중단 하 고 1 시간에 5% CO2 의 분위기 속에서 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>가지고 Formvar/탄소 300 그물눈 니켈 격자 상자에서 정전기 방지 겸 도자기 다 잘 접시에 놓고 10 µ L HA, CA 및 FA 정지의 격자에 드롭.</li>
		<li>건조 실 온에서 30 분에 대 한 샘플.</li>
	</ol>
</li>
	<li>휴식의 준비 26 포함을 위한 세포를 자극 하 고<ol>
<li>세포 배양에서 매체를 수집 하 고 생리 둔감 (PD) 매체 (125 m m NaCl, KCL, 10mm NaHCO35mm, 1mm KH2포4, 10 m m 포도 당, 20 mM HEPES, pH 7.4)와 셀을 세척.</li>
		<li>3% (g:100 mL) paraformaldehyde/1% (g:100 mL)도 100 m m 나트륨 인산 염 버퍼, pH 7.2, 연기 후드 실 온에서 1 h의 혼합물의 5 mL와 함께 셀을 수정 합니다.</li>
		<li>100mm 나트륨 인산 염 버퍼의 5 mL로 세포 세척 하 고 부드럽게 세척 후 버퍼를 제거.</li>
		<li>어두운 방에서 100 m m 나트륨 인산 염 버퍼, pH 7.2, 연기 후드 실 온에서 20 분에에서 1% (g:100 mL) 오스뮴 tetroxide의 2 mL과 샘플을 후 위.</li>
		<li>오스뮴 tetroxide를 제거 하 고 그것을 활용.</li>
		<li>100mm 나트륨 인산 염 버퍼의 5 mL로 세포 세척.</li>
		<li>그런 다음 실 온에서 등급된 에탄올 솔루션 시리즈의 5 mL aliquots에서 샘플을 탈수: 90% (vol.) 20 분, 75% (vol.) 15 분, 50% (vol.) 10 분, 25% (vol.) 5 분. 마지막으로 두 번 절대 에탄올을 사용 하 고 30 분 및 12 h 품 어.</li>
		<li>기계적으로 플라스틱 문화 접시에서 세포를 긁어, 플라스틱 microcentrifuge 튜브에 수집 하 고 1 분 130 x g에서 샘플 원심.</li>
		<li>supernatants 제거 하 고 셀 LR 화이트 수 지와 볼륨 비율 1: 2의 절대 에탄올의 혼합물의 1 mL에 중단.</li>
		<li>사용 하기 전에 유리 튜브의 내용을 잘 혼합 하 고 실 온에서 30 분 동안 품 어.</li>
		<li>샘플 1 분 130 x g에서 원심</li>
		<li>supernatants를 제거 하 고 LR 화이트 수 지와 절대 에탄올의 1:1 혼합물의 1 mL를 사용 하 여 이전 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>잘 혼합 하 고 실 온에서 30 분 동안 품 어.</li>
		<li>샘플 1 분 130 x g에서 원심</li>
		<li>supernatants 제거 합니다.</li>
		<li>마지막으로, 샘플에 순수한 LR 화이트 수 지의 1 mL를 두 번 추가 하 고 플라스틱 튜브에 실 온에서 1 h에 품 어.</li>
		<li>500 µ L 각 샘플의 젤라틴 캡슐에 넣으십시오. 참고: 샘플 수 지 라벨을 파괴 하지 않는다 그래야 종이 연필의 작은 시트를 사용 하 여 레이블이 지정 됩니다.</li>
		<li>젤라틴 캡슐, microcentrifuge 플라스틱 튜브에 넣어 닫고 스윙 아웃으로 터에서 1 분 130 x g에서 원심.</li>
		<li>진공 펌프를 사용 하 여 플라스틱 튜브에서 캡슐을 제거 합니다.</li>
		<li>오븐에 샘플을 이동 하 고 48 h 56 ° C에서 유해.</li>
		<li>홀더에 장착 하 고 피라미드를 트리밍 하 여 블록을 준비 합니다.</li>
		<li>소유자는 ultramicrotome, 다이아몬드 울트라 45 ° 칼 첨부 고 이온된 수; 그것을 채울합니다 부수적 기포에서 잎을 청소 하는 기억.</li>
		<li>다음 섹션 (700 Å) 이온된 물 목욕에 다이아몬드 칼을 사용 하 여 잘라.</li>
		<li>Ni 그리드 소 속눈썹 및 장소 Formvar/탄소 300의 반짝이 면에 메쉬를 사용 하 여 스크랩을 설정 하 고 그들을 건조.</li>
		<li>증기 두건 아래 어둠 속에서 절대 에탄올에 2.5% (vol.) 의해 uranyl 아세테이트를 준비 합니다. Uranyl 아세테이트 리드 컨테이너에 유지 하 고는 토사를 데리 러 하지 않는 것을 기억.</li>
		<li>어두운 방에서 합성 apatites 및 에탄올 증기 두건에서 실 온에서 20 분에 2.5% (vol.) 의해 uranyl 아세테이트와 셀 샘플 격자를 counterstain.</li>
		<li>다음 이온된 수에서 50% 에탄올에 격자 (vol.)에 의해 세척 하 고 24 시간 실 온에서 건조. 마지막으로, 상자에 격자를 넣어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 가장 EDX 분석
<ol><li>전송 전자 현미경 (TEM)에 의해 가장 이미징 갖춘 전체 범위 에너지 흩어진 엑스레이 microanalysis (EDX) 시스템 11 메가 픽셀 카메라<ol>
<li>미네랄과 세포의 관찰에 대 한 베릴륨 홀더를 준비 합니다. 정전기 방지 도구를 사용 합니다.</li>
		<li>나사의 쌍을 제거 하 고 베릴륨 플레이트 들어올린 보유자의 나머지에서 베릴륨 세탁기.</li>
		<li>그리드, 반짝이 면을, 소유자에 탑재 합니다.</li>
		<li>조심 스럽게 베릴륨 세탁기와 베릴륨 접시 놓고 단단히 죔 나사를 나사.</li>
		<li>진공 챔버에 홀더를 넣고 진공 펌프를 켭니다.</li>
		<li>진공 달성 되 면 부드럽게 이미징 챔버에 홀더를 삽입 하 고 광선을 켭니다.</li>
		<li>형광 모니터에는 현미경의 조리개 매개 변수를 설정 합니다. 이미지 난시 교정; 설정 확대/축소, 초점, 및 프레임; 50, 배율 TEM 이미지를 하는 고 000 X.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미징 및 x 선 스펙트럼 및 구성 분석을 위한 microanalysis 줄기<ol>
<li>스캐닝 전송 전자 현미경 (줄기) 이미징 챔버에 에너지 흩어진 엑스레이 (EDX) 검출기를 삽입 합니다.</li>
		<li>초점 모드에서 이미지의 선명도 조정 합니다.</li>
		<li>15, 확대 줄기 이미지를 000 X.</li>
		<li>X 선 microanalysis에 대 한 샘플에서 점을 선택 하 고 스펙트럼을 수집 합니다.</li>
		<li>모든 원자 량 (100%)로 샘플에서 주기율표의 모든 요소에 대 한 요약 및 선택 된 요소의 콘텐츠를 나타내는 데이터를 가져옵니다: Ca, F, Cl, 및 (원자 %)으로 P. 그런 다음, 각 샘플에 대 한 Ca, F 또는 Cl p의 비율을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이온 매핑<ol>
<li>칼슘, 불 소, 염소, 이온 매핑을 만들고 샘플에서 선택 된 요소의 EDX 지도 수행 인 등의 요소를 선택 합니다.</li>
		<li>분석 된 요소의 지역화를 지정 하 여 데이터를 가져올: Ca, F, Cl, 및 P (원자 %)로 계산 하는 각 샘플에 대 한 Ca, F 또는 P와 Cl의 (%)에서 공동 지역화 하 고.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 전혀 상충 선언 합니다.

현재 신문에서 우리에 대 한 아칸소-얼룩, fluorapatite의 UV 빛 식별 프로토콜을 설명 하 고 가장 EDX 체 외에 이미징 MVs 셀 mineralizing 발표와 미네랄의 MVs. 에 의해 생산 그것은 몇 가지 일반적인 문제 해결 단계에 따라 위에서 언급 한 모든 메서드를 해결 수 있습니다. 최적의 결과 얻으려면 몇 가지 중요 한 단계는 신중 하 게 수행 되어야 한다. 첫째, 그것은 AA (산 성) 인 β-GP (알칼리 성) 인 문화 매체의 pH 7.4를 유지 하기 위해 다음 추가 좋습니다. 둘째, 아칸소-S 얼룩, 후 얼룩진된 칼슘 예금은 매우 깨지기 쉬운 고 셀 PBS 추가 시 결정의 파괴를 방지 하기 위해 매우 세 심하게 세척 되어야 한다. 셋째, 항상 리드 컨테이너에서 uranyl 아세테이트를 유지 하 고 희석된 일부만 고정 사용 해야 하기 때문에 앙금을 선택 하지 마십시오. 넷째, AA와 uranyl 아세테이트는 빛에 민감한 및 어두운 방에 처리 한다 기억 하십시오. 다섯째,...

뼈는 두 부분으로 구성 된 결합 조직: 유기 (세포와 콜라겐 섬유)과 미네랄 (칼슘, 인산 화합물). 뼈에 주요 미네랄 구성 요소는 apatites1. 다른 종류의 강화 유능한 세포 뼈 (osteoblasts), 치아 (odontoblasts)와 연골 (chondrocytes) 규제 강화의 초기 단계는 세포 외 기질 (ECM)의 단백질을 생산 하 고 매트릭스를 발표 하 여 소포 (MVs) (그림 1). MVs는 100-300 nm 직경 소포 칼슘과 인회석 nucleation 촉진 인산 축적 하 고 그 후 콜라겐2,3를 바인딩할. 다음, MVs extracellular 매체에 apatites를 풀어 분해. apatites 계속 콜라겐 섬유 접촉 성장과 뼈 매트릭스를 형성 합니다. 강화 작용은 P나 및 캘리포니아2 + 세포 외 매체에서의 일정 한 공급에 의해 지속 됩니다. 최근 게시 된 데이터 지원 우리의 모델4,5. 부드러운 조직 생리 적인 조건 하에서 형성할 하지 않습니다. 그러나, 소성 석 회화는 혈관 석 회화3같은 병 적인 조건 하에서 발생할 수 있습니다. 혈관 세포 osteoblast 형 취득 apatites의 nucleation 유발 하 고 혈관 벽의 중간과 내 층에서 강화 작용을 시작 하는 MVs를 생성할 수 있습니다. 소성 석 회화부터 정상적인 endochondral 강화3, 뼈가 있는 세포의 강화 작용의 분자 메커니즘을 이해와 chondrocytes는 부드러운 조직의 소성 석 회화에 몇 가지 단서를 제공 한다 형성.
골격 조직 개발은 다양 한 효소, 성장 요인, 발기인 또는 강화 작용의 억제제에 의해 통제 된다. 반목 행동 조직-특이 현상 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (TNAP) (그림 1)와 ectonucleotide pyrophosphatase/포스의 난 (NPP1), 함께 ankyrin (ANK), 제어 (PPi) 무기 파이 인산 농도 6. PP나, 하 대형의 강력한 억제제 TNAP;에 의해 분해 되 NPP1 hydrolyzes 뉴클레오티드 PP나 ANK ECM에 PP나 를 셀에서 수출 하는 동안 형성 된. Pi/PPi 비율 인회석 형성7,8 병 적인 결과9를 조절할 수 있습니다.
MV 막 nucleation 프로세스 (그림 1) 중 칼슘과 인산 염 MVs 안쪽의 초기 강수량을 용이 하 게 이온 수송 단백질 농축입니다. 인산 염 운송업 자 1 (구 덩이) P나 MVs10,11perivesicular 공간에 생성을 통합 하는 데 도움이 됩니다. Annexins는 MV 루멘12,13강화 작용을 시작 하는 생물 과정에서 바인딩 및 캘리포니아2 + 의 전송에 관련 될 수 있습니다. 우리는 가설, 이전, ECM14,15에서 전파 하기 전에 뮤직 비디오 안에 인회석의 내부 nucleation의 intracytoplasmic 소포 내에서 강화에 대 한 제안 부탁. 생체 외에서 모델링 캘리포니아2 +/P나 단지 형성 PS 및 AnxA516에서 만든 proteoliposomes에서의 유도를 확인 했다. 이 그 축적을 나타낼 수 있습니다의 캘리포니아2 +, P나, microvilli 같은 membranesrepresent M대 Annexins와 TNAP는 인회석의 nucleation 코어 (NC)의 지질 뗏목에서 AnxA5 및 PS 단지 또한 콜라겐 바인딩 보유 강화는 ECM에서의 전파를 자극, 그리고 콜라겐 섬유를 따라 MVs에 도움이 될 수 있는 용량 Fetuin A와 osteopontin (OPN)17, collagenous 비 계에 강화 작용의 전파를 저하 시킬 수 있습니다 인회석 형성 억제제로 알려져 있습니다. Nucleation 및 전파는 고유한 이벤트, 후자, 앞 전 고 모두 병 적인 강화 작용의 과정에 대 한 관련성이 있을 수 있습니다.
어떻게 칼슘 인산 염 복합물의 화학 생리 강화 및 소성 석 회화 변경 될 수 있습니다 발견, 그것은 세포에 의해 생산 하는 광물을 식별 하는 데 필요한. Apatites 칼슘 및 인산 염 무기물 일반 크리스탈 단위 셀 수식 Ca10(PO4)6X2를 포함 하는 그룹, 어디 X = Cl, F, 오하이오. 그들은18를 다음과 같이 분류 된다: fluorapatite (FA) Ca10(PO4)6F2, chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 , hydroxyapatite (HA) Ca10(포4 )6(OH)2.
광물의 형성을 유발 하 osteoblast 셀 라인의 선택은 각 셀 라인 강화 작용의 독특한 프로필을 전시 하기 때문에 중요 한. 이 보고서에서 우리는 강화 작용의 두 가지 선택 된 인간 세포 모델에 의해 미네랄의 nucleation 비교: osteoblastic hFOB 1.19 셀과 다리 Saos-2 셀. Osteosarcoma 파생 셀 osteoblastic 모형으로 상용 되 고 Saos-2 셀 가장 성숙한 osteoblastic 문자19 보존 undifferentiated 인간의 태아 hFOB 세포는 정상 osteoblastic 모델로 널리 사용 감 별 법20. 다른 방법으로 그들의 강화 프로 파일 분석 했다: 알리자린 레드-S (아칸소-S) 얼룩, 자외선 (UV) 빛 시각화, 전송 전자 현미경 (TEM) 이미징, 에너지 흩어진 엑스레이 microanalysis (EDX) 정량, 및 이온 매핑. 이전 연구에서 사용 되는 대체 기술 가장 EDX의 이점을 준다는 것 이온 교체의 양적 및 질적 결과 인회석 결정4,,521입니다. 가장 EDX를 사용 하 여 전반적인 목표 이미징 및 강화 프로세스의 고유 단계 동안 다른 종류의 세포에서 다양 한 미네랄에서 Ca, F 및 Cl 이온의 분포의 정량화에 대 한 간단한 방법을 찾으려고 했다. 이 메서드는 성공적으로 사용 되었습니다, 예를 들어 공존 화학 물질과 아연 나노 입자 및 수생 생물22에 그들의 결합된 효과의 상호 작용을 모니터링. 또 다른 연구에서는 구리 촉매 용액에서 티타늄 소재에 광범위 하 게 유도 결합된 플라즈마 광 방출 분 광 분석 (ICP OES), N2 physisorption (내기)에 의해 특징 이었다 XRD, UV에 대 한 DRS FT-적외선, 라만 분광학, 편-EDX, 및 화학적 측정23. 우리의 목표는 근원 및 소포 및 미네랄 뼈가 있는 차별화 동안 강화 작용을 제어 하는 메커니즘을 이해 하 두 셀 라인의 속성을 비교 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57423/57423fig1.jpg"> 그림 1 . 뼈가 있는 세포 외 기질 (ECM) 단백질의 종합 및 막에서 매트릭스 소포 (MVs)의 출시에에서 강화의 초기 단계의 계획. MVs 칼슘 묶는 단백질, annexins 및 인산, 무기 인산 염 운송업 자 (구 덩이)의 행동을 통해 조직의 일반적인 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (TNAP), dephosphorylates는의 활동에 의해 다음의 행동을 통해 칼슘 축적 PP나 를 P나, 따라서 인회석 nucleation 촉진. 그런 다음, MVs 분해 하 고 extracellular 매체에 apatites를 출시. 강화 작용은 P나 및 캘리포니아2 + extracellular 매체4,5에서 일정 한 공급에 의해 지속 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57423/57423fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td><강한>시약</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>햄' s DMEM/F12 배지 혼합물</td><td>PAA</td><td>E15-813</td><td>1:1, 인간 태아 hFOB 1.19 SV40 대형 T 항원 형질주입 조골세포(ATCC CRL-11372)</td></tr><tr><td>McCoy' s 5A 매체</td><td>PAA</td><td>E82312-0025</td><td>인간 골육종 Saos-2 세포(ATCC, HTB-85),</td></tr> <tr><td>항생제 혼합물(페니실린/스트렙토마이신),</td> <td>시그마</td><td>P0781-100ML</td>, <td>각 100 U/mL</td></tr>, <tr><td>G-418</td>, <td>시그마</td><td>68168</td>, <td>0.3 mg/mL</td></tr>, <tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td>, <td>hFOB 1.19의 경우 10% 및 Saos-2</td></tr><tr><td>AA</td>, <td>시그마</td><td>A-5960 50</td><td>&마이크로의 경우 15%; g/mL</td></tr><tr><td>&szlig;-GP</td><td>Sigma</td><td>G9422-100G</td><td>7.5 mM</td></tr><tr><td>Bio-Gel</td><td>HTP Gel Bio-Rad</td><td>130-0420</td><td>for HA</td></tr><tr><td>FA</td><td></td><td></td> by <td>us</td></tr><tr><td>CA</td><td></td><td></td><td></td></tr> 합성 미국 <tr><td>CA Sodium phosphate 완충제 Na2HPO4/NaH2PO4 혼합물</td><td>Sigma</td><td>S7907/S8282</td><td>0.1 M, pH 7.2</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>pH 7.0,</td></tr><tr><td>PBS Sigma</td><td></td><td>A5533-25G</td><td>0.5 g/100 mL, pH 5.0</td></tr><tr><td>콜라겐 분해효소 유형 IA</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>500 U/mL</td></tr><tr><td>SCL 완충액</td><td></td><td></td> 우리가 <td>제조</td></tr><tr><td>한</td><td>탈이온화 웨이퍼</td><td></td><td></td></tr> 에<tr><td>탄올</td><td>POCh</td><td>BA6480111</td><td>절대 99.8 % 및 용액 25, 50, 75, 90</td></tr> <tr><td>% 우라닐 아세테이트 50 % 에탄올</td><td>Polysciences Inc.</td><td>21447-25</td><td>0.25 g/10 mL</td></tr><tr><td>PD 매체</td><td></td><td></td><td>pH 7.4, 당사 준비</td></tr><tr><td>고정 혼합물(파라포름알데히드/글루타르알데히드)</td><td>Sigma</td><td>158127/G-6257</td><td>3%:1%</td></tr><tr><td>Post-fixation OsO4</td><td>Sigma</td><td>75633</td><td>1%</td></tr><tr><td>LR 에탄올</td><td>Polysciences Inc.</td>의 흰색 수지<td>17411-MUNC 500g</td><td>1:2, 1:1, 100%</td></tr> <tr><td>아세톤</td><td>CHEMPUR</td><td>111024800</td><td>순수</td></tr><tr><td><강력한>도구</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>극저온 바이알</td><td>Corning Inc.</td><td>430487</td><td>1.2 mL</td></tr><tr><td>플라스틱 페트리 배양 접시</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>플라스틱 튜브</td><td>, Falcon</td><td>352096 및 352070</td>, <td>15 및 50 mL</td></tr><tr><td>혈청학 피펫,</td><td>Falcon 및 VWR</td><td>357521 및 612-3700</td>, <td>1 및 10 mL</td></tr><tr><td>플라스틱 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>, Sigma</td><td>Z688312 및 Z628034</td>, <td>1.5 mL 검정색 및 2 mL</td></tr><tr><td>투명 플라스틱 팁</td><td>VWR</td><td>613-0364, 613-0239 및 613-1050</td><td>0.1-10 &마이크로; L 자연, 1-200 &마이크로; L 노란색 및 200-1000 &micro; L 파란색</td></tr><tr><td>플라스틱 랙</td><td>Light Labs</td><td>A-7055-Z, A-7053-C</td><td>튜브용 녹색, 마이크로 튜브용 주황색, TEM 프로브용 파란색</td></tr><tr><td>Laminar Hera Save</td><td>Thermo Scientific Co.</td><td>KS12</td><td>HEPA 필터(DIN EN 1822에 따른 H14)</td></tr> <tr><td>인큐베이터 Hera Cell</td><td>Thermo Scientific Co.</td><td>150</td><td>34°C; hFOB 1.19 및 37&deg의 경우 C; C, Saos-2</td></tr><tr><td>흄 후드</td>, <td>POLON</td><td>WCS-2</td><td>, TEM 염색,</td></tr><tr><td>유리병</td><td>SIMAX</td><td>1632414501050 및 1632414501100</td><td>50 및 100 mL</td></tr><tr><td>석영 유리관</td><td>SIMAX</td><td>638422010100</td><td>&Oslash; 10 mm, L 100</td></tr><tr><td>mm 펌프</td><td>, IBS Integra Biosciences</td><td>VACUSAFE 진공 오븐</td><td>용</td></tr> 편안함 <tr><td></td><td>Memmert</td><td>UNE 400</td><td>56&데그; C</td></tr><tr><td>도자기 멀티 웰 플레이트</td><td>Rosenthal technik</td><td>229/12</td><td>12 웰</td></tr><tr><td>유리 비커</td><td>SIMAX</td><td>632417010025</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>유리병</td><td>Pocord</td><td>DIN22</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>플라스틱 상자</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td></td><td>어둠을 위해</td></tr><tr><td>스냅 핏 젤라틴 캡슐</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td>G3741</td><td>크기 1</td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 300 메쉬 Ni 그리드 상자</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td>S162N3</td><td>필름, 광택 면,</td></tr><tr><td>실리콘 셀 스크레이퍼</td><td>Sigma</td><td>SIAL0010-100EA</td>, <td>크기: 1.8/25cm</td></tr><tr><td>주사기(바늘 포함</td>), <td>BogMark</td><td>007</td>, 주<td>사기, 1mL, 40U, 바늘: 0.5 x 16</td></tr>, <tr>주<td>사기</td><td>: Chirana</td><td>CH005L</td><td>, 5mL</td></tr>, <tr><td>원심분리기</td>, <td>MPW, 의료기기</td><td>, MPW-350R,</td><td>130xg, 500xg,</td></tr><tr><td>자외선 투과기</td>, <td>UVP</td><td></td><td>가시광선 및 자외선용</td>M-20</tr><tr><td>초박절개</td><td>LKB</td><td>NOVA</td><td>700&Aring; 섹션</td></tr><tr><td>블록 홀더</td><td>LKB</td><td>E6711</td><td>원형</td></tr><tr><td>다이아몬드 나이프</td><td>DiATOME</td><td>Ultra 45&deg;</td><td>사이즈 3</td></tr><tr><td>속눈썹 홀더</td><td></td><td></td><td>소, 미국</td></tr><tr><td>집게</td><td>ROTH</td><td>2855.1</td><td>그리드 용 정전기 방지</td></tr><tr><td>주걱 세트</td><td>ROTH</td><td>E286.1</td><td>정전기 방지 파우더</td></tr> <tr><td>용 < 강력>이미징 < / 강력 ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>반전 광 현미경</td><td>Zeiss with Canon</td><td>AxioObserver Z1 PowerShot G9</td><td>위상차, 투과광, 20 x 대물렌즈, RGB 필터</td></tr>, <tr><td>투과전자현미경</td>, <td>TEM, Oxford Instruments 및 SiS-Olympus</td>, <td>JEM-1400 TEM, 전 범위 INCA 에너지 분산형 X선 미세분석(EDX) 시스템 및 11메가픽셀 MORADA G2 카메라</td><td>배율, TEM용 50,000X 및 STEM 및 EDX용 15,000X</td></tr><tr><td>카메라 본체 및 렌즈</td><td>니콘</td><td>Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D </td><td>동영상 녹음용</td></tr><tr><td>마이크</td><td>MXL 마이크</td><td>템포</td><td></td></tr></tbody></table>

미네랄 hfob 1.19에 의해 생산 및 saos-2 세포를 사용 하 여 전송 전자 현미경 에너지 흩어진 엑스레이 microanalysis와 분석

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

이 비디오 전송 전자 현미경 검사 법의 사용 에너지 흩어진 엑스레이 microanalysis을 소포 두 인간의 뼈 세포 라인에 의해 발표에서 미네랄의 상태를 비교할 (가장 EDX) 선물: hFOB 1.19와 Saos-2. Ascorbic 산 (AA)와 β-glycerophosphate (β-GP), 치료 후 이러한 셀 라인 강화를 확산에서 완전 한 osteogenic transdifferentiation를 받아야 매트릭스 소포 (MVs)에서 인회석 nucleation 트리거하는 생산 하 고는 세포 외 매트릭스 (ECM)입니다.
알리자린 레드-S (아칸소-S) 얼룩 및 미네랄 자외선 (UV)를 사용 하 여 세포 lysates 또는 소포 편 이미징 EDX 정량 및 이온 매핑을 사용 하 여 구성의 분석을 바탕으로, 우리가 그 다리를 유추할 수 Saos-2 그리고 osteoblastic hFOB 1.19 셀 별개 강화 프로필 공개. Saos-2 셀 hFOB 1.19 셀 보다 더 효율적으로 형성할 고 생산 자외선 아래 표시 되지 않습니다 하지만 비슷합니다 hydroxyapatite (HA) 들은 더 많은 Ca와 F 대체에 큰 무기물 예금.
이러한 기술을 사용 하 여 얻은 결과 수 결론 강화 작용 과정 세포 유형에 따라 다릅니다. 우리는, 세포 수준에서 기원과 vesicles의 속성 미리 미네랄의 종류를 제안 합니다.

가장 EDX 체 외에 이미징 매트릭스 소포 (MVs) 셀 mineralizing 발표와 M대 강화 작용의 과정을 다르게 진행할 수 있습니다이 기술을 사용 하 여 얻은 결과 입증 하 여 생산 하는 미네랄의 수 에 셀의 다양 한 종류. 두 셀 라인 같은 osteoblastic transdifferentiation 치료를 받은 아직 자극된 Saos-2 셀 mineralized hFOB 보다 더 효율적으로 1.19 osteoblasts 아칸소-S에 의해 입증으로 얼룩 (그림 2). 이 hFOB 1.19 셀20에 비해 Saos-2 셀19 의 더 성숙한 osteoblast 형 때문일 수도 있습니다. 만든 UV transilluminator를 사용 하 여 샘플의 시각화 그것 취소만 fluorapatites UV 빛...

선물이 두 인간의 뼈 세포 선으로 발표 하는 소포에 미네랄의 상태를 비교 하는 프로토콜: hFOB 1.19와 Saos-2. 그들의 강화 프로 파일에 의해 알리자린 레드-S (아칸소-S) 얼룩, 자외선 (UV) 빛 시각화, 전송 전자 현미경 (TEM) 이미징 및 에너지 흩어진 엑스레이 microanalysis (EDX)을 분석 했다.

미네랄 hFOB 1.19에 의해 생산 및 Saos-2 세포를 사용 하 여 전송 전자 현미경 에너지 흩어진 엑스레이 Microanalysis와 분석

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

광물화의 초기 단계에서 세포는 세포외 기질 단백질을 생성하고 칼슘과 인산염을 축적하는 기질 소포를 방출하여 인회석 핵형성을 촉진합니다. 이 보고서에서는 선택된 두 가지 인간 세포 모델, 즉 조골세포 hFOB 1.19 및 골육종 Saos-2 세포에 의한 광물의 핵형성을 비교합니다. 이들의 광물화 프로파일은 다양한 방법으로 분석되었습니다.모든 재료를 층류 아래에 놓고 자외선 아래에서 살균합니다. 소 태아 혈청이 있는 배지를 10ml의 신선한 배양 배지로 변경합니다. 휴지 세포는 자극제 없이 배양되는 반면, 자극된 세포는 아스코르브산과 베타-글리세로인산으로 처리됩니다.먼저, 아스코르브산을 배양 배지 표면에 최종 농도인 밀리리터당 50마이크로그램까지 부드럽게 떨어뜨려 세포를 자극합니다. 다음으로, 배양 배지에서 최종 농도인 7.5 millimolar에 베타-글리세로포스페이트를 첨가하여 세포를 자극합니다. 배양 접시를 부드럽게 저어 인큐베이터에 7일 동안 넣습니다.7일간의 배양 후 세포 배양물을 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다. 2%알리자린 레드 5ml를 넣고 플레이트를 30분 동안 배양하여 미네랄을 염색합니다. PBS로 세 번 씻으십시오.접시 벽에 PBS를 조심스럽게 추가합니다. 미네랄을 파괴하지 마십시오. 도립 광 현미경으로 광물을 관찰하십시오.세포 배양에서 배지를 수집하고 PBS로 세포를 세척합니다. 7일 동안 휴지 또는 자극된 세포를 37도에서 3시간 동안 밀리리터 콜라겐 분해 효소 용액당 500 단위로 소화합니다. 그런 다음 기계적으로 세포를 긁어냅니다.플라스틱 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 주사기에 10번 통과시킵니다. 샘플을 500g에서 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 버리고 세포 펠릿을 500마이크로리터의 합성 연골 림프액에 현탁시킵니다. 병에서 하이드록시아파타이트, 플루오라파타이트 및 클로라파타이트 분말을 주걱으로 UV 트랜스일루미네이터에 옮기고 대조군으로 사용합니다. 플라스틱 팁이 있는 플라스틱 튜브에서 세포 용해물을 옮기고 UV 투과기에 조심스럽게 놓습니다.2.5mg의 하이드록시아파타이트, 플루오라파타이트 및 클로라파타이트 분말을 500마이크로리터의 탈이온수에 현탁시킵니다. 37도에서 한 시간 동안 배양합니다. 정전기 방지 집게가 있는 상자에서 Formvar/탄소 니켈 그리드를 꺼내 도자기 멀티 웰 플레이트에 놓습니다.그리드에 10마이크로리터의 하이드록시아파타이트 현탁액을 떨어뜨립니다. chlorapatite와 fluorapatite에 대해서도 동일한 작업을 수행합니다. 샘플을 실온에서 30분 동안 건조시킵니다.포매를 위해 휴지 세포와 자극된 세포를 준비합니다. 세포 배양에서 배지를 수집합니다. 생리적 탈감작 배지에서 세포를 세척하십시오.3%파라포름알데히드와 1%글루타르알데히드의 혼합물 5ml를 100밀리몰의 인산나트륨 완충액에 넣고 흄 후드 아래 실온에서 한 시간 동안 세포를 고정합니다. 5ml의 100 millimolar sodium phosphate 완충액으로 세포를 세척합니다. 세척 후 버퍼를 부드럽게 제거하십시오.암실에서 100 밀리몰 인산나트륨 완충액에 1%오스뮴 테트록사이드 2밀리리터를 샘플에 접붙입니다. 흄 후드 아래의 실온에서 샘플을 20분 동안 배양합니다. 사산화오스뮴을 제거하고 활용하십시오.5ml의 100 millimolar sodium phosphate 완충액으로 세포를 세척합니다. 그런 다음 실온에서 등급이 매겨진 에탄올 용액 시리즈의 5ml 분취량, 25, 50, 75 및 90% 에탄올로 샘플을 탈수합니다. 마지막으로 앱솔루트 에탄올을 두 번 사용하고 30분과 12시간 동안 배양합니다.배양 접시에서 세포를 기계적으로 긁어냅니다. 세포를 플라스틱 마이크로 원심분리기 튜브에 모읍니다. 샘플을 130g에서 1분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거합니다. LR White 수지와 절대 에탄올의 혼합물에 세포를 1:2의 부피 비율로 현탁시킵니다. 잘 섞어 실온에서 30분 동안 배양합니다.샘플을 130g에서 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다. LR White 수지와 절대 에탄올의 일대일 혼합물을 사용하여 이전 단계를 반복합니다.잘 섞어 실온에서 30분 동안 배양합니다. 샘플을 130g에서 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다.샘플에 순수 LR White 수지를 첨가하고 플라스틱 튜브에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 샘플을 130g에서 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다.순수한 LR White 수지를 다시 첨가하십시오. 각 샘플 500마이크로리터를 젤라틴 캡슐에 넣습니다. 샘플은 수지가 라벨을 파괴하지 않도록 작은 종이와 연필을 사용하여 라벨을 부착합니다.젤라틴 캡슐을 닫습니다. 캡슐을 플라스틱 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. 130g의 원심분리기를 스윙 아웃 로터에서 1분간 가열합니다.진공 펌프를 사용하여 플라스틱 튜브에서 캡슐을 제거합니다. 샘플을 오븐으로 옮기고 56도에서 48시간 동안 중합합니다. 블록을 홀더에 장착하여 준비합니다.홀더를 초박 절편기에 넣습니다. 다이아몬드 나이프를 부착합니다. 탈이온수로 채우십시오.우발적인 기포에서 블레이드를 청소하십시오. 그런 다음 탈 이온수 수조에서 다이아몬드 나이프를 사용하여 섹션을 자릅니다. 소 속눈썹을 사용하여 스크랩을 설정합니다.그런 다음 Formvar/탄소 니켈 그리드의 반짝이는 면에 놓고 건조시킵니다. 어두운 방에서 합성 아파타이트 및 세포 샘플의 그리드를 에탄올에 2.5% 우라닐 아세테이트로 카운터 스테인하여 흄 후드 아래 실온에서 20분 동안 대조 염색합니다. 그리드를 50% 에탄올로 세척한 다음 탈이온수로 세척하고 실온에서 24시간 동안 건조시킵니다.마지막으로 그리드를 상자에 넣습니다. 미네랄과 세포를 관찰하기 위해 베릴륨 홀더를 준비합니다. 정전기 방지 도구를 사용하십시오.한 쌍의 나사를 제거합니다. 베릴륨 플레이트와 베릴륨 와셔를 리테이너의 나머지 부분에서 들어 올립니다. 반짝이는 면이 위로 향하게 그리드를 홀더에 장착합니다.베릴륨 와셔와 베릴륨 플레이트를 조심스럽게 놓습니다. 고정 나사를 단단히 조입니다. 홀더를 진공 챔버에 넣고 진공 펌프를 켭니다.진공이 완료되면 홀더를 이미징 챔버에 부드럽게 삽입하고 빔을 켭니다. 형광등 모니터에서 현미경의 조리개 매개변수를 설정합니다. 이미지 난시 보정을 수행합니다.확대/축소, 초점, 프레임을 설정하고 투과 전자 현미경 이미지를 촬영합니다. 검출기를 이미징 챔버로 이동합니다. 초점 모드에서 이미지의 선명도를 조정합니다.X선 미세분석을 위해 샘플에서 점을 선택하고 스펙트럼을 수집합니다. 칼슘, 불소, 염소 및 인과 같은 원소를 선택하여 이온 매핑을 만들고 선택한 원소의 맵을 수행합니다. 자극된 Saos 세포는 hFOB 조골세포보다 더 효율적으로 광물화되었습니다.fluorapatites만 UV light excitation에서 관찰할 수 있습니다. HFOB 세포 용해물은 Saos보다 형광성이 더 높았으며, 이는 이러한 세포에 형석석이 더 풍부하다는 것을 시사합니다. 자극된 Saos 세포는 hFOB 세포 및 휴지 Saos 세포에 비해 미네랄을 포함하는 소포를 더 많이 생성합니다.합성 아파타이트는 다양한 미네랄 형태를 가지고 있습니다. 위에 적용된 절차는 휴지 및 자극 상태에서 hFOB 및 Saos 세포에 소포가 존재함을 보여주었습니다. 빨간색 점은 칼슘, 녹색 인 및 파란색 불소 분포를 나타냅니다.자극된 조건하에서, Saos 세포에 의해 생성된 소포의 칼슘과 인 분포와 hFOB 세포에 의해 생성된 소포의 불소와 인 분포 사이에는 강한 중복이 있었습니다. 결론적으로, 우리의 연구 결과는 소포가 특히 세포 수준에서 미네랄 핵형성의 핵심 결정 요인임을 나타냅니다. 더 효율적으로 광물화되는 Saos-2 세포에서 방출된 소포와 hFOB 1.19 세포에서 방출된 소포의 비교는 기질 소포가 미네랄로 채워진 소포라는 가설을 뒷받침합니다.이것은 기질 소포의 존재가 인회석 핵형성을 유도하는 데 필요한지 여부와 이것이 생리학적으로 병리학적 광물화를 어떻게 변화시킬 수 있는지에 대한 의문을 남깁니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

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소수 종, 광원, 산소 공실 및 기타 포인트/라인/평면도 결함으로부터 정보를 안정적으로 추출하는 사고 전자 빔 흔들림 조건하에서 전자 채널링 현상을 활용하여 불순물 및 화학 상태의 사이트 점유율을 추정하기 위한 정량적 미세 분석 방법의 일반적인 개요를 제공합니다.

전자 채널링 강화 마이크로 분석에 의한 결정재료의 기능적 도팬츠/점 결함의 정량적 원자사이트 분석

학습하세요 hFOB 1.19 및 Saos-2 세포에서 광물화 프로파일을 비교하는 방법을 전자현미경과 에너지 분산형 엑스선 분석을 사용하여. 이 기법은 뼈 생물학 및 조직 공학 연구에 활용됩니다.

미네랄 hFOB 1.19에 의해 생산 및 Saos-2 세포를 사용 하 여 전송 전자 현미경 에너지 흩어진 엑스레이 Microanalysis와 분석

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