Name: 절연 및 애벌레 Zebrafish 두뇌에서 신경 세포, 대 식 세포 및 Microglia RNA 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 배우세요 어린 Danio rerio 뇌에서 신경세포, 대식세포 및 미세아교세포를 분리하고 고품질 RNA를 추출하는 방법을. 이 기술은 qPCR 및 전사체 분석을 위한 다운스트림 연구에 활용됩니다.

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우리 초기 도움말 및 실험적인 접근 및 QMRI Flow Cytometry 셀 정렬 시설에 대 한 토론에 대 한 박사 클레어 데이비스와 닥터 베로 Miron (여왕의 의료 연구소, 에든버러, 유나이티드 Kingdome) 감사합니다. 이 작품은 박사 더크 Sieger에 암 연구 영국 경력 설립 수상에 의해 지원 되었다.

1. 샘플 및 미디어 준비
<ol><li>6.4 m KCl m, 0.22 m m NaCl, 0.33 m m CaCl2 2 H2O, 0.33 m m MgSO4 7 H2O H2o.에에서 용 해 하 여 배아 매체 (E3)를 준비</li>
	<li>수정 (0 dpf) 후 즉시 zebrafish 태아를 수집 합니다.<ol>
<li>Zebrafish 태아 90 mm 페 트리 접시 당 50 분할. 착 색을 억제 하는 실험의 기간에 대 한 개발 (0 dpf)의 첫번째 날의 끝에서 배아 매체 (E3) 200 µ M 1-페 닐 2-thiourea (PTU), 치료의 50 mL에 28.5 ° C에서 배아를 올립니다.</li>
		<li>변화는 E3 + 실험 기간 동안 매일 통해 매체.</li>
		<li>Mpeg1:eGFP 및 NBT:DsRed 애벌레 2 dpf 긍정적인 transgene 식, GFP+ 세포/microglia 및 DsRed+ 뉴런에 대 한 형광 stereomicroscope를 사용 하 여에서 화면.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 미디어, 오염을 피하기 위하여 조직 문화 후드 실험 전날 준비 다음 4 ° c.에서 그들을 저장합니다<ol>
<li>15 mM Hepes, HBSS 1에서에서 25 m m D-포도 당을 용 해 하 여 준비 하는 미디어 A x.</li>
		<li>HBSS 10의 1 볼륨에 밀도 그라데이션 매체의 9 볼륨을 혼합 하 여 밀도 그라데이션 매체 (100%)를 준비 x.</li>
		<li>밀도 그라데이션 매체 (22%)을 준비 하는 DPBS 1의 88 ml에서 밀도 그라데이션 매체 (100%)의 22 mL를 diluting 하 여 x.</li>
		<li>준비 하는 DPBS 1 x.</li>
		<li>E3 매체 + Tricaine 450 μ M으로 E3 매체를 혼합 하 여 준비 Tricaine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 균질
참고: 모든 단계는 수행된 4 ° c.
<ol><li>90 mm 페 트리 요리 E3 배아 매체 200 µ M 말기 그들을 anesthetize를 통해 치료의 50 ml 50 애벌레를 1.5 mL Tricaine (15 m m)를 추가 합니다.<ol>
<li>3 mL 파스퇴르 대량 플라스틱 피 펫과 페 트리 디쉬에서 10 마 취 애벌레 빨 아.</li>
		<li>취 전송 애벌레 55 mm 페 트리 접시에 10 10 얼음 E3 배아 매체 + Tricaine로 가득합니다.</li>
		<li>Stereomicroscope, 아래 10 애벌레 페 트리 접시의 중앙에 맞춥니다. 다음 노 른 자-sac 수술 마이크로-가 위 (수영 방광을 피하기 위해 머리를 부동 제외)를 사용 하 여 위에 애벌레 머리 transect.</li>
		<li>3 mL 파스퇴르 대량 플라스틱 피 펫과 페 트리 디쉬에서 빨 아. 모든 머리 피 펫 팁 내에서 수집 하 고 다음 1 mL 차가운 미디어 A를 포함 하는 유리 균질 화기로 전송 될 때까지 기다립니다 (전송 미디어를 줄이기 위해 최소 볼륨에서 희석 e 3 + Tricaine). 얼음에 유리 균질 화기를 유지. 실험 조건 당 한 균질 화기를 사용 합니다.</li>
		<li>각 작은 페 트리 접시를 포함 하는 얼음 교체 차가운 E3 + Tricaine 새 것으로 그 transection 보장 하기 위해서 모든 30 분 차가운 E3 + Tricaine에서 수행 하는 매체.</li>
		<li>색상 페이딩 시작 유리 균질 화기에 얼음 처럼 차가운 미디어 A를 교체 합니다. 참고: 미디어 A 희석 온도 변화 머리 조직을 변경할 수 있습니다.</li>
		<li>모든 머리 수집 된 일단 (600 머리/조건), 유리 균질 화기에서 미디어의 최대 볼륨을 제거 하 고 신선한 얼음 처럼 차가운 미디어 a 1 mL와 함께 그것을 대체합니다</li>
		<li>얼음 꽉 유리 균질 화기와 뇌 조직 방해. 3-5 dpf 애벌레 및 7 및 8 dpf 애벌레에 대 한 50의 분쇄 40 라운드를 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 현 탁 액에 미디어 A의 2 개 mL를 추가 (1 mL 미디어 A 200 / 머리), 세포를 희석 하 고 수 초 밀도 그라데이션 매체에서 원심 분리 하는 동안 그들의 분리를 촉진 하기 위하여와 그들의 덩어리를 줄이기 위해.<ol>
<li>세포 덩어리를 제거 하려면 얼음에 유지 찬 50 mL 팔 콘 튜브 위에 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 실행 합니다. 3 번이이 작업을 반복 합니다.</li>
		<li>차가운 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액 1 mL를 전송 및 4 ° c.에서 10 분 300 g에서 그들을 회전합니다</li>
		<li>10 mL 주사기를 사용 하 여 상쾌한 제거 + 바늘 23G x 1'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다시 1 mL의 얼음 처럼 차가운 22% 밀도 그라데이션 부드럽게 차가운 DPBS 1의 0.5 mL에 의해 중첩 된 셀 펠 릿을 일시 중단 (그들, 두 솔루션 사이의 interphase 나타납니다 혼합 하지 마십시오) x.<ol>
<li>4 ° c.에 30 분 동안 느린 가속 및 브레이크 없이 950 g에서 튜브를 회전 참고: 이 단계는 DPBS 1의 interphase에 격리 하 여 다른 셀에서 myelin를 분리 x와 22% 밀도 그라데이션 매체, 반면 셀 튜브의 하단에 작은 것입니다. 수 초 제거 세포 농도가 너무 높은 경우 더 효율적입니다.</li>
		<li>그들의 interphase 10 mL 주사기 + 바늘 23G x 1' 삭제 DPBS, 밀도 그라데이션 매체 및 myelin의 최대 갇혀 사용 하.</li>
		<li>미디어의 0.5 mL + 2% 정상 염소 혈 청 (NGS)의 세포를 씻어 다음 4 ° c.에서 10 분 300 g에서 튜브를 회전</li>
		<li>상쾌한, 최대 삭제 다음 미디어 A + 2%의 동일한 실험 조건 함께 1 mL에서에서 모든 셀 펠 릿 풀 NGS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>관심사의 세포 대 식 세포/microglia mpeg1:eGFP에서 처럼 형광 단백질 또는 NBT:DsRed 유전자 변형 물고기 (유전자 변형 물고기 1.1.3의 심사), 35 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 실행에서 뉴런 뚜껑과에 그들을 전송 하는 경우는 차가운 5 mL FACS 빛 으로부터 보호과 얼음, 튜브. 참고: Microglia의 면역 얼룩을 또는, 수행할 수 있습니다.</li>
</ol>3. Microglia Immuno 얼룩이
참고: 4 ° c.에 모든 단계를 수행
<ol><li>다시 미디어 A + 2%의 0.3 mL와 함께 셀 펠 릿을 일시 중단 NGS. 3 x 1.5 mL 튜브에 그들을 분할: 흠 없는 세포 비 특정 바인딩 microglia 및 세 번째 시험으로 이차 항 체의 측정을 이차 항 체 (1/200)에 대 한 관심의 셀에서 자동 형광 두 번째 측정 한 (4C 4 마우스 단일 클로 널 (해당 microglia)는 항 체 (1/20) + 2 차 항 체 (1/200)).<ol>
<li>낮은, 아 지 드 무료 (잎) 세포 (모든 튜브)를 1%에서 면역 글로불린의 Fc 도메인 CD16/CD32 상호 작용을 차단 하를 추가 합니다. 부드러운 동요 매 5 분으로 10 분에 대 한 셀을 품 어.</li>
		<li>4C 4 추가 항 체 (1/20) 셀 (관 3)와 품 어 부드러운 교 반으로 30 분 마다 10 분.</li>
		<li>4 ° C에서 10 분 300 g에서 튜브를 회전 다음 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>일단 미디어 A + 2 %0.5 mL와 NGS, 다음 4 ° c.에서 10 분 300 g에서 튜브 회전 세척</li>
		<li>미디어 A + 2%의 0.5 ml와 함께 셀 펠 릿 다시 중단 NGS와 부드러운 동요 매 5 분으로 10 분에 대 한 1%에서 잎 세포를 품 어.</li>
		<li>셀 (튜브 2와 3)를 이차 항 체 (1/200)를 추가 합니다. 매 10 분 및 가벼운 보호 부드러운 동요와 30 분에 대 한 셀을 품 어.</li>
		<li>4 ° C에서 10 분 300 g에서 튜브를 회전 한 다음 상쾌한 삭제.</li>
		<li>미디어 A + 2%의 1 mL와 함께 미디어 A + 2%, NGS 다음 다시 일시 중지 셀 펠 릿의 0.5 mL로 두 번 세척 NGS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>35 µ m 셀 스 트레이너 모자를 통해 세포 현 탁 액을 실행 하 고 빛 으로부터 보호 하는 얼음에 차가운 5 mL FACS 튜브로 그들을 전송.</li>
</ol>4입니다. 셀 정렬 (FACS)
참고: 4 ° c.에 모든 단계를 수행
<ol><li>신경 세포, 대 식 세포/microglia 및 microglia를 FACS를 사용 하 여 정렬 합니다. 참고: 이 단계는 일반적으로 FACS 시설의 직원에 의해 수행 하 고 설정을 사용 하는 장비의 유형에 따라 다릅니다.<ol>
<li>죽은 세포를 각 FACS 튜브에 1 µ g/mL의 농도에서 DAPI를 추가 합니다.</li>
		<li>모든 뇌 세포에서 FACS 및 정렬 신경 세포, 대 식 세포/microglia 또는 microglia를 설정 합니다. 그들의 크기, 단위, 그리고 앞으로 분산형 및 사이드 분산형 게이트 단일 세포의 기능에 있는 파편에서 별도 셀. DAPI에서 라이브 셀 라벨에 의해 죽은 세포를 제외 합니다. 그들의 각각 긍정적인 얼룩에 의해 신경 세포, 대 식 세포/microglia 또는 microglia를 식별 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 미디어 A + 2%의 1 mL를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 세포를 수집 NGS 얼음에. 다른 튜브를 사용 하 여 각 세포 유형에 대 한.<ol>
<li>4 ° C에서 10 분 300 g에서 튜브를 회전 하 고는 상쾌한 다음 삭제.</li>
		<li>미디어의 0.5 mL로 한 다음 삭제 상쾌한 최대 한 번 씻는 다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. RNA 추출
<ol><li>FACS를 구분 하는 다른 세포 유형에서 RNA를 추출 합니다. RNA 추출에 대 한 특정 키트를 사용 하 고 제조업체의 지침을 따릅니다. 청소 작업 영역 및 RNase 오염 제품 펫 RNase 무료 환경에서 작동 하는 필터 팁을 사용 하 여 확인 합니다.<ol>
<li>갓 50 µ M β-mercaptoethanol 보충 하는 세포의 용 해 버퍼의 1 mL를 준비 합니다. 참고: 여기서, β-mercaptoethanol RNA 저하를 줄이기 위해 추가 됩니다.</li>
		<li>무료 물 70%와 80% 에탄올 솔루션 RNase를 사용 하 여 준비 합니다.</li>
		<li>세포 세포의 용 해 버퍼 50 µ M β-mercaptoethanol 보충의 75 µ L lyse 다음 세포 파쇄를 분쇄기를 사용.</li>
		<li>제조 업체에 따라 RNA 추출의 매뉴얼을 계속 한다.</li>
		<li>프로토콜의 끝에, 충분 한 RNA 농도를 RNase 무료 물 14 µ L로 RNA elute.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기에 설명 된 실험 프로토콜 8 dpf에 3에서 zebrafish 애벌레에서 뇌 세포를 분리 하는 강력 하 고 효율적인 방법을 나타냅니다. 중요 한 것은, 이것은 첫 번째 프로토콜에서 애벌레 zebrafish 두뇌 microglia의 특정 격리를 허용입니다. 프로토콜은 세포 막의 무결성을 유지 하 고 처리 하는 동안 발생 하는 유전자 발현의 잠재적인 수정 최소화 하기 위해 설계 되었습니다. 이 마지막 점은 그 고립 된 세포 게놈 프로 파일의 분석에 따라 결과의 관련성에 대 한 중요 한 있습니다. 실제로, microglia 및 macrophage 분극 강하게 그들의 microenvironment에 의해 영향을 받습니다. 37 ° C에서이 세포 실험 조건 (부상 (transection) 응답)에 자신의 유전자 식 프로필을 변경 것입니다. 따라서, 그것은 이전 세포 프로세스 및 신진 대사 활동을 천천히 RNA 추출, 4 ° C에서이 실험을 수행 하는 중요 한 했다. 또한, 기계적 뇌 조직 균질 4 ° C에서 37 ° C에서 효소 조직 소화 대신 유전자 식 프로필에 어떤 영향을 피하기 위해 선정 되었다.
이 메서드는 매우 빠른; 강조 하는 것이 중요 하다 하루 내 여러 뇌 세포 인구는 적어도 두 개의 다른 실험 조건 및 그들의 RNA 추출에서 격리 될 수 있습니다. 프로토콜의 총 길이 애벌레 머리의 transection 제한 단계 (∼ 350 머리/h)으로 각 조건에 대해 사용 하는 애벌레의 수에 따라 달라 집니다. 일반적으로 3에서 microglia를 작업할 5 및 7 dpf이 좋습니다 transect ∼ 600 머리 (표 1)를 추출 하는 충분 한 RNA를 시험 당 하. Microglia 셀 형식을 나타내는 낮은 산출 (7 dpf에 인당 약 112 세포), 대 식 세포 (7 dpf에 인당 약 170 세포)를 포함 하 여 다른 세포 유형 머리의 수를 줄일 수 있습니다.
이 프로토콜의 또 다른 장점은 FACS 정렬 설정이 설정 된 후 동일한 설정을 사용할 수 있는 다양 한 실험에 대 한. 그것은 세포 인구 맞는 완벽 하 게 한 실험에서 다른 이전 설계, 게이츠와 함께이 메서드를 사용 하 여 실험의 재현성을 보여주는 관찰 되었습니다.
이 방법의 약간의 불리는 수확 하는 RNA의 상대적으로 낮은 금액입니다. 그러나,이 제한은 microglia 수로 두뇌 개발 (표 1)의 초기 단계에서 매우 낮은 기술적인 문제 보다는 더 많은 생물 학적 문제입니다. 수집 하는 RNA의이 낮은 양 때문에 증폭 단계 게놈 넓은 유전자 표정 분석을 수행 하기 위해 고려 될 필요가 있다. 다행히도, 이러한 증폭 단계 고품질 cDNA의 충분 한 양을 생산. 따라서, 고립 된 세포의 유전자 식 프로필에 글로벌 변화는 공부 될 수 있다.
결론적으로,이 프로토콜에는 격리 하 고 애벌레 zebrafish 두뇌에서 다양 한 CNS 셀 유형을 공부 강력한 방법을 제공 한다. 이것은 또한 질병에 그들의 역할을 연구로 개발 하는 동안이 세포의 깊은 이해를 얻기 위해 적용할 수 있습니다.

두뇌 개발 및 뇌 질환에 대 한 지식을 마우스 뇌 transcriptomes1의 첫 번째 정량화 이후 지난 10 년간에서 크게 개선 했다. 실제로, 게놈 넓은 유전자 표정 분석 우리에 액세스할 뇌 조직 및 보완 하 고 관측 다른 기술 및 도구를 향상 시킬 수 있는 셀에 대 한 자세한 유전 정보.
제 브라는 쉽게 번 식 하 고 유전자; 수정 강력한 생물 학적 모델 애벌레 단계에서 광학 투명도 라이브 이미징 관찰2수 있습니다. 불행 하 게도, 인간을 비교 하 고 마우스, immuno 얼룩이 수행에 사용할 수 있는 항 체의 수는 오히려 낮은. 이 문제를 해결 하려면 유전자 변형 zebrafish 물고기 라인 쉽게 만들어집니다 유전자 물고기를 수정 하 여 셀 형식 특정 발기인에서 형광 단백질을 표현 하. 유전자 변형 zebrafish 라인 중앙 신경 시스템 (CNS) 개발 및 질병3,4,,56동안 microglia 및 대 식 세포의 역할을 공부 하는 과거에 사용 되었습니다. 그러나, 이러한 프로세스의 상세한 이해를 얻기 위해 우리가 해당 셀 형식에서 유전자 발현에 변화를 이해 해야 합니다. 이 목표를 우리는 특별히 신경 세포, 대 식 세포 및 8 일 3에서 microglia 같은 세포를 분리 하는 실험 방법 개발 후 수정 (dpf) 애벌레 zebrafish 두뇌. 프로토콜의 설립에 대 한 우리 신경 신경 ß-tubulin 아래에 있는 대 식 세포 표현 유전자 발기인 (mpeg1:eGFP) 및 DsRed 세포/microglia에서 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현 하는 유전자 변형 물고기 라인 근무 발기인 (NBT:DsRed)7,,89. 또한, 우리는 immuno 얼룩이 microglia 4C 4, 특별히 zebrafish microglia10,11얼룩 마우스 단일 클론 항 체를 사용 하 여의 수행. 이후에, ribonucleic 산 (RNA) 추가 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 또는 transcriptome 분석에 대 한 이러한 세포에서 추출 됩니다. 이 프로토콜 zebrafish 애벌레;에서 뇌 조직을 효율적으로 균질 하도록 설계 되었습니다. 신경 세포, 세포/microglia 및 그들의 원형질 막 무결성의 변경 없이 microglia를 수집 하 고 마지막으로 높은 품질의 이러한 세포에서 RNA 추출 (린 > 7) 및 게놈 분석을 수행 하는 수량. 뇌 조직12,13소화를 트립 신 처리 37 ° C에서 사용 하는 연구에 대 한 이전 게시, 달리이 프로토콜 RNA 추출 단계를 줄이기 위해 유전자 식 프로필의 수정까지 4 ° C에서 작업을 촉진 합니다. 이 단계는 결정적으로 microglia 및 대 식 세포는 매우 중요 한 세포는 그들의 진 식 프로필과 분극14,15, 를 변경 하 여 즉시 그들의 microenvironment에 있는 변화에 응답 16.
세부 사항에, 여기에 설명 된 프로토콜 신경 세포, 대 식 세포 및 microglia zebrafish 애벌레 두뇌에서 거의 그것의 다른 셀에 적용할 수 있습니다 보여줍니다 뇌-유전자 변형 물고기 라인을 사용 하 여 내 제시 또는 함께 표시 특정 항 체입니다. 이 방법은 그들의 게놈 넓은 유전자 표정 분석을 통해 CNS 세포의 더 나은 특성화 고 개발 및 뇌 질환 중 그들의 역할을 이해 하는 데 도움이 됩니다.

<table><tbody><tr><td>1-페닐 2-티오우레아 (PTU)</td><td>시그마</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>D-글루코스</td><td>시그마</td><td>G8644-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1X</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10X</td><td>Gibco</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (MS222)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin 표준 90mm 페트리 접시</td><td>ThermoFisher</td><td>101VIRR</td><td></td></tr><tr><td>수술용 마이크로 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 파스퇴르 플라스틱 벌크 피펫</td><td>SLS</td><td>PIP4206</td><td></td></tr><tr><td>유리 균질화</td><td>Wheaton</td><td>357538</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin 표준 55mm 페트리 접시</td><td>ThermoFisher</td><td>P55V</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m 세포 여과기</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 폴리프로필렌 원추형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 주사기</td><td>BD</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>바늘 23G x 1''BD</td><td></td> <td>300800</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 혈청(NGS)</td><td>세포 신호</td><td>5425S</td><td></td></tr><tr><td>35 &뮤; m 세포 여과기 캡</td><td>BD</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACS 튜브</td><td>BD</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>저내독소, 아지드 무함유(LEAF)</td><td>Biolegend</td><td>101321</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 염소 안티 마우스 IgG(H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-4C4</td><td>Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS 분류기 FACSAria II</td><td>BD</td><td>QMRI, FACS 시설</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus 마이크로 키트</td><td>QIAGEN</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; 31350-010</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725271</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 96 Real-Time PCR 시스템&nbsp;</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ovation RNA-Seq 시스템 V2</td><td>NuGEN</td><td>7102-32</td><td></td></tr><tr><td>애질런트 RNA 6000 Pico 시약</td><td>애질런트</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>2100 바이오분석기</td><td>애질런트</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

절연 및 애벌레 zebrafish 두뇌에서 신경 세포, 대 식 세포 및 microglia rna 추출

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

개발 또는 설립 중 다른 CNS 세포의 역할에 대 한 상세한 이해 및 두뇌 병 리의 진행을 얻으려면, 그것은 그들의 유전자 식 프로 파일을 변경 하지 않고 이러한 세포를 분리 하는 것이 중요. Zebrafish 모델 제공 많은 유전자 변형 물고기 라인 있는 특정 세포 유형 표시 됩니다; NBT:DsRed 선 또는 대 식 세포/microglia mpeg1:eGFP 라인에서 하는 예를 들어 신경에 대 한 또한, 항 체 개발 되었습니다 microglia 4C 4와 같은 특정 세포를 얼룩이 항 체.
여기, 우리 신경 세포, 대 식 세포에서 애벌레 zebrafish 두뇌 microglia의 설명. 이 프로토콜은 셀룰러 프로필을 수정할 수 있는 37 ° C에서 효소 조직 소화의 회피입니다. 4 ° C에서 조직 균질의 기계 시스템 대신 사용 됩니다. 이 프로토콜 세포 현 탁 액으로 두뇌의 균질, 그들의 immuno 얼룩이 지 고 신경 세포, 대 식 세포 및 FACS에 의해 microglia의 격리를 의미 한다. 이후에, 우리는 그 세포에서 RNA를 추출 하 고 그들의 품질/수량 평가. 우리는 고품질의 RNA를 관리 (RNA 무결성 번호 (린) > 7) 세포/microglia 및 신경, 그리고 transcriptomic microglia 분석에서 정량 수행 하. 이 방법은 개발 및 pathologies에 그들의 역할에 대해 명확 하 게 이해로 서이 세포의 더 나은 특성을 수 있습니다.

설명된 프로토콜은 신경 세포, 대 식 세포 및에서 zebrafish 애벌레 두뇌 microglia 분리 간단 접근 이다. 이들에서 고립 세포, 높은 품질의 상당수 (린 &gt; 7) RNA 추출 되었다. 이 프로토콜의 목표 분석 및 셀 속성 및 기능 특성에 그들의 유전자 식 프로 파일의 최소 수정 CNS에서 다른 종류의 세포를 분리 하는. 따라서, 전체 프로토콜 기계적 뇌 조직 균질 화와 4 ° C에서 수행 됩니다. 이 방법은 실험실에서 수행 하는 두 개의 연구 성공적으로 사용 되었습니다. 첫 번째 연구에서 신경 세포와 대 식 세포/microglia 8 dpf mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ 애벌레 (그림 1)에서 분리 했다. 그들의 크기의 기능에서 파편에서 셀 분리를 허용 하는 FACS (FSC-A) 및 세분성 (SSC-A) (그림 1A). 단일 셀 다음 남자 또는 세포 응집 체 (그림 1B)에서 분리 되었다. 단일 세포 인구에서 죽은 세포 (DAPI+)를 제거 하는 게이트 그려 했다. 해당 점 플롯으로 죽은 세포의 비율은 26.7% (그림 1C)만이 실험 프로토콜 세포 원형질 막 무결성을 보존 공개 했다. 마지막으로, 신경 (DsRed+)와 대 식 세포/microglia (GFP+) 쉽게 라이브 셀 인구 게이츠에서 차별 했다. 신경 인구 (23.1%) (그림 1D) 뇌 내 세포/microglia 인구 (1.56%) 보다 더 두드러진 것으로 나타났다. 이 프로토콜을 신경 세포와 대 식 세포/microglia 사이 특정 유전자의 표정을 비교할 후속 정량 분석을 수행 하려면 그 세포에서 RNA를 분리를 허용 했다. 그림 2 쇼 신경 고 증식 세포 핵 항 원 (pcna)예를 들어 β-걸 집 지키는 유전자에 대 한의 대 식 세포/microglia 유전자 식 수준.
두 번째 연구에 대 한이 방법은 3, 5, 7 dpf 애벌레 두뇌 microglia 절연에 집중 했다. 위에서 설명한 실험과 달리 세포 면역 염색에 의해 고립 되었다 4C 4, 특히 라벨 microglia (그림 3 A D)는 항 체를 사용 하 여. 앞에서 설명한, microglia (4C 4+) 라이브 셀에서 선정 됐다 고 (그림 3D) 수집. Zebrafish 애벌레 두뇌 내의 Microglia 번호는 변수 (표 1), 3 dpf (물고기 당 25 ∼)에서 매우 낮은. 그 세포에서 추출 된 RNA의 양과 품질 마이크로 모 세관 전기 이동 법 기반 시스템을 사용 하 여 측정 되었다. 결과 5 dpf 애벌레 zebrafish 두뇌 microglia에서 추출 된 RNA의 RNA 분석 (표 1 (5 dpf; 실험 4))의 예를 보여 주기 위해 제공 되었습니다. 그림 4 는 전기 추적 및 리보솜 RNA (28s와 18s)의 명확한 시각화로이 샘플에 대 한 얻은 그것의 그래픽 표현. 이 데이터는 샘플 린 계산 하 고 RNA 농도 결정 하는 데 필요한. 표 1 절연된 microglia 생선과 microglia 당 RNA의 양을 각각 다른 실험 3, 5, 7 dpf에 대해 린 점수 당 수를 요약 합니다. 이 메서드를 사용 하 여 격리 microglia에서 추출 된 RNA의 품질과 양을 키트를 사용 하 여 cDNA로 RNA를 증폭 수 있었습니다. 에 딘 버 러 유전체학에서 제공 하는 품질 및 수량 테스트 증폭된 cDNA 라이브러리 준비 및 후속 시퀀싱에 대 한 충분 한 품질의 확인. 그림 5 는 cDNA 조각 및 전기 이동 시스템을 사용 하 여 측정 하는 그들의 금액의 크기 분포를 보여준다. 이 샘플에는 cDNA 36100의 농도에 299bp의 평균 크기를 했다 pmol/l. 표 2 는 각각 RNA 샘플 (표 1 (5 dpf; 실험 4))에서 증폭 된 cDNA에서 품질과 수량 테스트를 보여 줍니다. 증폭된 cDNA는 시퀀싱을 위해 성공적으로 사용 되었습니다.
실험실에서 수행 하는 여러 연구 확인 품질 신경 세포, 대 식 세포 및 microglia에서 추출 된 RNA의 수량 및 후속 정량 및 게놈 넓은 진 식 분석에 사용할 수 있습니다. 따라서,이 실험 프로토콜 안정적으로 막 무결성을 변경 하 고 그들의 유전자 식 프로 파일의 수정에 제한 하지 않고 CNS 세포의 다른 종류를 분리 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig1.jpg"> 그림 1 : 신경 세포와 대 식 세포/microglia mpeg1:GFP+/NBT:DsRed+ 에서 8 dpf zebrafish 애벌레 정렬 FACS. (A-C) 연속 게이팅의 모든 뇌 세포 () 순차 선택, 앞으로 분산형과 측면에 의해 단일 셀 분산형 (B). (C) 죽은 세포 DAPI 라벨에 의해 제외 되었습니다. (D) 신경 세포 및 대 식 세포/microglia 각각 DsRed와 GFP 긍정적인 얼룩에 의해 확인 되었다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig2.jpg"> 그림 2 : 유전자 표정 분석 pcna 및 신경 세포와 대 식 세포/microglia β-말라 . 격리 된 신경 세포와 대 식 세포/microglia RNA 정량 PCR 분석에 사용 하기 위해 cDNA에는 복사할 수 수 있습니다. 격리 된 신경 세포와 대 식 세포/microglia 정량에 의해 결정에서 β-걸 집 지키는 유전자에 대 한 pcna 의 mRNA 식 레벨 (N = 3). 배 변화 비교 (ΔΔCT) 메서드를 사용 하 여 측정 했다. 오차 막대 대표 평균 ± SEM. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig3.jpg"> 그림 3 : FACS microglia 3 dpf zebrafish 애벌레에서에 대 한 정렬. (A-C) 연속 제어 순차 선택 모든 뇌의 세포 (A), 앞으로 분산형과 측면에 의해 단일 셀 분산형 (B). (C) 죽은 세포 DAPI 라벨에 의해 제외 되었습니다. (D) Microglia 4C 4에 의해 확인 되었다 긍정적인 얼룩이 지기. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig4.jpg"> 그림 4 : 5 dpf zebrafish microglia에서 추출 된 RNA의 마이크로 모 세관 전기 이동 법 결과. 두 개의 큰 봉우리는 18와 28S ribosomal RNA. RNA 무결성 번호 (린)은 28S ribosomal 소 단위는 18의 생성된 비율 및 전체 전기 이동 추적의 분석을 사용 하 여 bioanalyzer 소프트웨어에 의해 자동으로 계산 됩니다. Microglia RNA 린 8.6 있다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig5.jpg"> 그림 5 : 5 dpf zebrafish microglia의 RNA 샘플에서 증폭 된 cDNA의 품질과 수량 테스트. 화면은 299의 평균 크기를 가진 cDNA 조각 크기 분포 분석된 샘플의 bp. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>조건</td>
			<td>실험</td>
			<td>물고기 수</td>
			<td>휴대폰 번호</td>
			<td>물고기 당 휴대폰 번호</td>
			<td>RNA 농도 (pg/ul)</td>
			<td>총 RNA (pg)</td>
			<td>셀 (pg) 당 RNA 금액</td>
			<td>린 점수</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>700</td>
			<td>11922</td>
			<td>17.03</td>
			<td>126</td>
			<td>1512</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>22527</td>
			<td>37.55</td>
			<td>253</td>
			<td>3036</td>
			<td>0.13</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>18688</td>
			<td>31.15</td>
			<td>255</td>
			<td>3060</td>
			<td>0.16</td>
			<td>7.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>11121</td>
			<td>18.54</td>
			<td>189</td>
			<td>2268</td>
			<td>0.20</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>15581</td>
			<td>25.97</td>
			<td>131</td>
			<td>1572</td>
			<td>0.10</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>11965</td>
			<td>19.94</td>
			<td>256</td>
			<td>3072</td>
			<td>0.26</td>
			<td>8.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>58629</td>
			<td>97.72</td>
			<td>362</td>
			<td>4344</td>
			<td>0.07</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>32510</td>
			<td>54.18</td>
			<td>348</td>
			<td>4176</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>77884</td>
			<td>129.81</td>
			<td>594</td>
			<td>7128</td>
			<td>0.09</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>50755</td>
			<td>84.59</td>
			<td>305</td>
			<td>3660</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>44967</td>
			<td>74.95</td>
			<td>134</td>
			<td>1608</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>51031</td>
			<td>85.05</td>
			<td>163</td>
			<td>1956</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>60496</td>
			<td>100.83</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>450</td>
			<td>55517</td>
			<td>123.37</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>88897</td>
			<td>148.16</td>
			<td>465</td>
			<td>5580</td>
			<td>0.06</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>63008</td>
			<td>105.01</td>
			<td>356</td>
			<td>4272</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>350</td>
			<td>34956</td>
			<td>99.87</td>
			<td>245</td>
			<td>2940</td>
			<td>0.08</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>63887</td>
			<td>106.48</td>
			<td>341</td>
			<td>4092</td>
			<td>0.06</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: microglia 격리 및 3, 5, 7 dpf zebrafish 애벌레에서 RNA 추출 데이터의 요약.
<table fo:font-size="7" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>내부 샘플 ID</td>
			<td>외부 샘플 ID</td>
			<td>큐 비트 (ng/ul)</td>
			<td>Qubit(ng/ul)</td>
			<td>평균 농도 (ng/ul)</td>
			<td>볼륨 (ul)</td>
			<td>ug 받은</td>
			<td>최소 농도 대 한 합격/불합격</td>
			<td>Minimim 수량에 대 한 합격/불합격</td>
			<td>권장된 수량에 대 한 합격/불합격</td>
		</tr>
<tr>
<td>10907SD0010</td>
			<td>5 dpf (실험 4)</td>
			<td>58.8</td>
			<td>58.4</td>
			<td>58.6</td>
			<td>30</td>
			<td>1.76</td>
			<td>패스</td>
			<td>패스</td>
			<td>패스</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="10">샘플 라이브러리 준비에 대 한 요구 사항:</td>
		</tr>
<tr>
<td>라이브러리 준비</td>
			<td>최소 수량 (ng)</td>
			<td>권장된 수량 (ng)</td>
			<td>최소 농도 ng/uL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>TruSeq 나노 젤 cDNA에서 무료 350 bp 삽입 라이브러리</td>
			<td>600</td>
			<td>1100</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 5의 dpf zebrafish microglia의 RNA 샘플에서 증폭 된 cDNA의 수량 테스트 합니다.

우리는 신경 세포, 대 식 세포 및에서 생리 및 병 적인 조건 하에서 애벌레 zebrafish 두뇌 microglia 분리 프로토콜을 제시. 절연, 시 RNA 유전자 식 프로필 분석 하이 셀에서 추출 됩니다. 이 프로토콜 정량 및 transcriptomics 같은 다운스트림 분석에 대 한 높은-품질 RNA의 컬렉션에 대 한 수 있습니다.

절연 및 애벌레 Zebrafish 두뇌에서 신경 세포, 대 식 세포 및 Microglia RNA 추출

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 유충 제브라피시 뇌에서 뉴런, 대식세포 및 미세아교세포를 분리하고 고품질 RNA를 추출하여 qPCR 및 전사체학과 같은 다운스트림 분석을 수행하는 것입니다. 형질전환 유충 제브라피쉬는 라이브 이미징을 위한 강력한 도구이며 시간이 지남에 따라 살아있는 환경에서 미세아교세포와 같은 개별 세포를 관찰할 수 있는 기회를 제공합니다. 그러나 이들의 기능을 자세히 이해하려면 유전자 발현 프로파일을 이해해야 하며, 당사의 분리 및 분류 프로토콜은 이러한 목적을 위해 설계되었습니다.이 기술의 주요 장점은 유전자 발현 프로파일에 대한 최소한의 수정으로 중추 신경계에서 다양한 유형의 세포를 분리할 수 있으므로 세포 기능과 특성을 특성화할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜의 효율성은 그 효능에 반영됩니다. 이 프로토콜을 사용하면 다양한 다운스트림 응용 분야에서 짧은 시간 내에 충분한 양의 RNA를 생산할 수 있습니다.텍스트 프로토콜에 따라 PTU를 포함하는 E3 배지에서 제브라피시 배아를 키운 후, 형광 실체현미경을 사용하여 2개의 dpf에서 유충을 스크리닝하여 GFP 양성 대식세포와 DsRED 양성 뉴런의 미세아교세포를 스크리닝합니다. 한 지점에서 배아를 균질화하기 위해 50 ml의 중간 내지 50 개의 유충 당 15 밀리 몰 트리카인 5 ml를 마취를 준비한다. 그런 다음 3ml 파스퇴르 피펫을 사용하여 한 번에 10마리의 유충을 트리카인이 함유된 얼음처럼 차가운 E3 배지로 채워진 55ml 페트리 접시에 옮겨 말기 마취시킵니다.steromicroscope에서 페트리 접시 중앙에 10 마리의 유충을 정렬 한 다음 외과 용 마이크로 가위를 사용하여 난황 주머니 위의 유충 머리를 절제합니다. 3 ml 파스퇴르 피펫으로, 모든 머리를 채택하고 가능한 한 적은 액체로, transection가 찬 E3 플러스 Tricaine 매체에서 실행된다는 것을 보증하기 위하여 30 분마다 새로운 것으로 얼음 찬 E3 플러스 Tricaine를 포함하는 얼음 차가운 매체 A.Replace의 1 ml를 포함하는 얼음에 유리제 균질화기로 그(것)들을 옮기십시오. 색상이 바래기 시작하면 유리 균질화기에서 얼음처럼 차가운 미디어 A를 교체하십시오.일단 머리의 전체 그룹이 모아지면, 유리제 균질화기에서 모든 매체 A를 제거하고 얼음 위에 아직도 균질화기를 가진 상태에서 얼음 위에 아직도 균질화기를 1개 ml로 대체하고, 3개에서 5개의 dpf 유충을 위한 분쇄 그리고 회전의 40개의 라운드를 수행함으로써 뇌 조직을 혼란시키기 위해 꽉 끼는 유봉을 사용합니다. 그런 다음 세포 현탁액에 2ml의 Media A를 첨가하여 세포를 희석하고 미엘린과의 응집을 줄입니다. 40미크론 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 얼음 위의 차가운 50ml 팔콘 튜브에 넣어 세포 응집을 제거합니다.이 단계를 세 번 반복합니다. 세포 현탁액 1ml를 차가운 1점 5ml 튜브에 옮기고 300배 g과 섭씨 4도에서 10분 동안 회전시킵니다. 그런 다음 23게이지 1인치 바늘이 있는 10ml 주사기를 사용하여 상층액을 제거합니다.얼음처럼 차가운 22% 밀도 구배 매체 1ml를 사용하여 얼음처럼 차가운 1X dbps 5ml를 영점으로 부드럽게 오버레이하고 세포 펠릿을 부드럽게 다시 현탁시킵니다. 섭씨 4도에서 30분 동안 느린 가속을 쉬지 않고 950회 g으로 튜브를 돌립니다. 스핀 후, 계면에 갇힌 미엘린의 dbps 밀도 구배 매질을 버립니다.그런 다음 2% NGS가 포함된 영점 5ml의 Media A를 사용하여 세포를 세척하고 섭씨 4도에서 300회 g으로 튜브를 10분 동안 돌립니다. 상층액을 최대한 제거한 다음 동일한 실험 조건의 세포 펠릿을 2% NGS가 있는 1ml의 배지 A에 함께 넣습니다. 관심 세포가 형광 단백질을 발현하는 경우, 35미크론 세포 여과기 캡을 통해 세포 현탁액을 실행하고 빛으로부터 보호된 얼음 위의 차가운 5ml FACS 튜브로 옮깁니다.미세아교세포를 면역염색하려면 영점 3ml의 Medium A와 2% NGS를 사용하여 세포 펠릿을 다시 현탁시킨 다음 세포를 3개의 1점 5ml 튜브로 분할하여 염색되지 않은 세포용 1개는 자가형광을 측정하고, 다른 하나는 미세아교세포에 대한 2차 항체의 비특이적 결합을 측정하고, 세 번째는 테스트용으로 사용합니다. 모든 튜브에 1%의 낮은 내독소 아지드 프리 또는 잎을 추가하여 면역글로불린의 FC 도메인과 CD16, CD32 상호 작용을 차단합니다. 그런 다음 5분마다 부드럽게 교반하면서 10분 동안 세포를 배양합니다.다음으로, 세 번째 튜브에 4C4 항체를 추가하고 10분마다 부드럽게 교반하면서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 300회 g과 섭씨 4도에서 10분 동안 튜브를 돌립니다. 상층액을 버린 후 튜브를 다시 회전시키기 전에 영점 5ml의 Media A와 2% NGS로 펠릿을 한 번 세척합니다.영점 5ml의 Media A와 2% NGS로 세포 펠렛을 다시 현탁시킨 다음 1% 잎을 추가하고 5분마다 부드럽게 교반하면서 10분 동안 세포를 배양합니다. 튜브 2와 3에 2차 항체를 추가하고 튜브를 어두운 곳에 둡니다. 튜브를 돌리고 상층액을 버린 후 영점 5ml의 Media A와 2% NGS를 사용하여 샘플을 두 번 세척한 다음 1ml의 Medium A와 2% NGS로 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다.35미크론 셀 스트레이너 캡을 통해 세포 현탁액을 실행하고 빛으로부터 보호된 얼음 위의 차가운 5ml FACS 튜브로 옮깁니다. 마지막으로 텍스트 프로토콜에 따라 FACS 분류 및 RNA 추출을 수행합니다. 이 연구에서는 8개의 dpf mpeg1 EGFP 양성 NBT dsRED 양성 유충에서 뉴런과 대식세포와 미세아교세포를 분리했습니다.FACS는 크기와 입도의 기능에 따라 세포를 파편에서 분리하는 데 사용되었습니다. 그런 다음 단일 세포를 이중선 또는 세포 응집체로부터 분리했습니다. 단일 세포 집단에서 죽은 세포를 제거하기 위해 게이트를 그렸습니다.해당 점도표는 이 실험 프로토콜이 죽은 세포의 비율이 26.7%에 불과하기 때문에 세포 원형질막의 무결성을 보존한다는 것을 보여주었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 뉴런과 대식세포, 그리고 미세아교세포는 살아있는 세포 집단 게이트에서 쉽게 분리되었습니다. 뇌 내에서, 뉴런 집단은 대식세포와 미세아교세포 집단보다 더 두드러지는 것으로 나타났다.두 번째 연구에서는 FACS 분류를 사용하여 미세아교세포를 특이적으로 표지하는 항체인 4C4로 유충 뇌에서 살아있는 미세아교세포를 분리했습니다. 이 미세아교세포 분리 및 RNA 추출 데이터 표에 요약된 바와 같이, 제브라피시 유충 뇌 내 미세아교세포의 수는 다양하며 3dpf로 매우 낮습니다. 마지막으로, 5개의 dpf 유충 제브라피시 뇌의 미세아교세포에서 한 번의 실험으로 얻은 RNA 추출 결과는 리보솜 RNA의 명확한 시각화와 함께 이 전기영동 추적에 표시됩니다.이 기술을 마스터하면 조건당 필요한 헤드 수에 따라 12시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 RNA 분해를 방지하기 위해 모든 것을 차갑게 유지하고 표면을 깨끗하게 유지하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 제브라피시를 모델로 사용하여 생리학적 및 병리학적 조건에서 다양한 세포의 유전자 발현 프로파일을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.동영상을 시청한 후에는 유충 제브라피시 뇌에서 뉴런, 대식세포 및 미세아교세포를 분리하는 방법과 qPCR 및 전사체학과 같은 다운스트림 분석을 수행하기 위해 고품질 RNA를 추출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

isolation-rna-extraction-neurons-macrophages-microglia-from-larval

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 성인 제브라피시의 뇌를 미세 해부하는 기술을 설명합니다. 이 방법은 더 자세히 연구할 수 있는 전체 뇌 유래 중성구를 얻는 데 도움이 됩니다.

제브라피쉬 뇌 해부: 물고기 신경생물학 기법

이 비디오는 뇌 조직을 기계적으로 파괴하여 유충 제브라피시 뇌에서 뉴런, 대식세포 및 미세아교세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 정제된 세포 집단은 게놈 분석에 추가로 사용할 수 있습니다.

제브라피시 유충에서 뇌 세포 분리: 제브라피시 뇌 조직에서 온전한 뉴런, 대식세포 및 미세아교세포를 얻는 기술

이 비디오에서는 면역염색 결합 세포 분류를 통해 제브라피시 미세아교세포를 분리합니다. 분리된 미세아교세포는 뇌 병리학에서 자신의 역할을 이해하기 위해 다운스트림 실험에 사용할 수 있습니다.

Immunostaining Coupled Cell Sorting에 의한 미세아교세포 분리: 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 제브라피시 뇌 세포에서 미세아교세포를 분리하는 면역 염색 방법

특정 조직에서 세포의 서브 세트의 유전자 발현 분석가 중대한 과제이다. 이 문서에서는 레이저 캡처 미세 절제와 빠른 immunolabeling 방법을 결합하여 특정 세포 집단에서 고품질의 총 RNA를 분리하는 방법에 대해 설명합니다.

셀 특정 부분 집단에서 RNA 분리 빠른 Immunolabeling과 결합 레이저 캡처 이외에 Microdissection을 사용하여

여기에서 우리는 전체 뇌 또는 telencephalic, tectal 또는 성인 zebrafish의 뇌의 소뇌 영역 중 하나에서 파생 neurosphere 분석을 사용하여 성인 신경을 검사 할 수있는 재생 가능한 방법을 제공한다. 또한, 우리는 제브라 피쉬 neurosphere를 유전자 발현을 조작하는 절차를 설명한다.

성인 Zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를의 분리 및 문화

이 프로토콜에서 zebrafish 태아, 애벌레, 전체 transcriptome 분석에 대 한 접근을 제공 하거나 셀을 정렬 합니다. 우리는 RNA의 격리, RNASeq 데이터의 통로 분석 및 유전자 표정 변화의 qRT-PCR 기반 유효성 검사를 포함합니다.

샘플 준비 및 제 브라에서 RNASeq 기반 유전자 표현 데이터의 분석

선물이 zebrafish 태아 transfection 라이브 셀 이미징 뿐만 아니라 성인 zebrafish 두뇌에서 1 차 셀을 준비 하는 프로토콜의 기본 셀 문화를 준비 하기 위한 효율적이 고 사용 하기 쉬운 프로토콜.

문화와 Zebrafish 기본 세포의 Transfection

우리는 성인 마우스 뇌 반구의 다른 해부 된 영역에서 microglia의 격리를위한 프로토콜을 제공하고, 전체 길이 전사체의 깊은 단일 세포 RNA 시퀀싱을위한 반자동 라이브러리 준비를 제공합니다. 이 방법은 건강과 질병에서 microglia의 기능적 이질성을 해명하는 데 도움이됩니다.

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

이 프로토콜은 결과적인 신경 염증 반응과 신경 독성을 연구하기 위해 제브라 피쉬 애벌레 모델에서 뇌실 영역에 지질 다당류를 미세 주입하는 것을 보여줍니다.

신경 염증 및 신경 독성을 평가하기 위해 유충 제브라피쉬에 지질 다당류의 뇌실 미세 주입

여기에서는 단세포 RNA 염기서열 분석을 위해 수정 후 5일에 제브라피시 유충에서 장을 분리하는 방법을 설명합니다.

Single-cell RNA 염기서열분석을 위한 Zebrafish 유충의 장 분리

우리는 빠른 스캐닝 컨포칼 현미경을 활용하여 개발 중인 제브라피시 시신경 구조에서 미세아교세포의 실시간 이미징을 수행하는 방법을 시연하여 생체 내에서 이러한 세포의 역학을 분석할 수 있습니다.

Zebrafish 배아에서 Microglia Dynamics의 실시간 이미징 및 특성 분석

배우세요 어린 Danio rerio 뇌에서 신경세포, 대식세포 및 미세아교세포를 분리하고 고품질 RNA를 추출하는 방법을. 이 기술은 qPCR 및 전사체 분석을 위한 다운스트림 연구에 활용됩니다.

절연 및 애벌레 Zebrafish 두뇌에서 신경 세포, 대 식 세포 및 Microglia RNA 추출

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