Name: 중생의 연구에 대 한 기본 위 상피 단층 문화 마우스 및 인간의 파생 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 배우세요 위상피 세포 재생 메커니즘을 연구하기 위한 3D 위 오가노이드에서 2D 단층 배양으로의 전환 기법을. 이 방법은 마우스 및 인간 유래 원발성 위 세포를 이용한 상처 치유 분석에 활용됩니다.

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이 작품은 NIH (NIDDK) 5에 의해 지원 되었다 R01 DK083402-07 부여 (YZ).

오염 방지, 살 균 조직 문화 후드 내에서 전체 프로토콜을 수행 합니다. 승인 된 신시내티 대학 IRB 프로토콜에 따라 소매 위절제술을 받은 환자에서 인간의 fundic 조직 수집 (IRB 프로토콜 번호: 2015-4869). 모든 마우스 연구는 신시내티 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회 (IACUC) 평가의 미국 협회 및 인증의 실험실 동물 배려 (AAALAC) 시설 유지 관리에 의해 승인 되었다.
1. 인간 파생 3D 위 Fundic Organoids 구축
참고:이 프로토콜은 이전이 랩8에 발표 된 연구에 근거한 다.
<ol><li>50 %Wnt 조절 하 고 20 %R-spondin 조절 미디어 구성 된 3D organoid 미디어를 준비 합니다.<ol>
<li>단련 하는 Wnt 미디어 준비, Wnt 성장 매체에 L 셀 문화 (Dulbecco 독수리 매체 (DMEM), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 수정의 페니실린/스) 7 일, 수확, 매체 및 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 필터링.</li>
		<li>R-spondin 조건 미디어를 준비 합니다. R-spondin 성장 매체에서 수정된 HEK 293T R-spondin 은닉 세포 라인을 성장 (Dulbecco 독수리 매체 (DMEM), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 수정의 페니실린/스). 2 시간 후 첨부 파일에 매체에서에서 변경 이러한 셀 OPTIMEM 성장 매체, 1% 페니실린/스. 7 일 동안 세포 문화. R-spondin 조절 미디어 수확 그리고 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 필터링 합니다. 참고:이 프로토콜 이전 게시 되었습니다 및 자세한 프로토콜 6,,78를 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>성장 인자 감소, 페 놀 레드 무료 지하실 멤브레인 매트릭스 4 ° c.에 얼음에 16 h에 대 한 해 동 에는 얼음 차가운 캘리포니아2 +/Mg2 +조직 수집-큰 플라스틱 용기에 DBPS 무료. 시작 단계 1.4까지 얼음에 저장 합니다. 참고: 조직 소매 위절제술을 받은 환자에서 수집 됩니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 세척 살 균 비 커 100ml Ca2 +/Mg2 +포함 하에서 적극적으로 조직-Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 분 (DPBS) 무료. 세척 약 30 s 또는 파편과 혈액 제거 되었습니다 때까지. 다음, 멸 균 거 즈를 사용 하 여, 상피에서 점액 레이어를 멀리 닦으십시오.</li>
	<li>조직의 힘과 근육 층을 파악, 멀리는 곡선된 hemostatic 포 셉을 사용 하 여 상피를 긁어 단단히 포 셉을 사용 하 여. 살 균, 폴리스 티 렌 페 트리 접시에 긁힌 것된 상피 파편을 수집 합니다.</li>
	<li>상피 조직 조직 소화를 최적화 하기 위해 면도기를 사용 하 여 약 2.0 x 2.0 m m2 크기의 조각으로 말하다. 캘리포니아2 +/Mg2 + 조직 파편을 씻고-DBPS 항생제로 보충 무료 (캘리포니아2 +/Mg2 + -무료 DPBS, 1% 페니실린/스, 0.25 mg/mL 암포 B 10 mg/mL Gentamicin, 50 mg/mL 대) 때까지 세척은 혈액의 무료입니다. 필요한 경우 여러 세척을 수행 합니다. 신중 하 게 폐기물 비 커에 씻어 멸 균 거 즈를 통해 필터링 하 여 세척을 삭제 합니다.</li>
	<li>수집 25 m m 저 어 바와 미리 데워 부 화 미디어 플라스 크 하단 라운드 125 mL 유리에 파편을 씻어 (2 m L-글루타민, 1% 보충 기초 미디어 페니실린/스, 10 mM HEPES 버퍼, 1 mg/mL 콜라 타입 1, 2 mg/mL 세포 배양 학년 소 혈 청 알 부 민). 고무 격 막과 둥근 바닥 플라스 크를 밀봉 하십시오.</li>
	<li>septa에 20 G 척수 바늘을 삽입 하 고 고무 뿌리고와 산소 탱크에 연결. 어떤 오염 물질을 필터링 하려면 필터를 만드는 튜브에 휴지를 삽입 합니다. 낮은에 산소 유출 켭니다. 격 막의 파열을 피하기 위해 septa에 10-15 유출 바늘을 삽입 합니다.</li>
	<li>클램프를 사용 하 여 링 스탠드에 최대 집합을 장악 하 고 37 ° c 30-45 분 동안 저 어 플레이트 보정 물 욕조에 배치. 후 조직 15 분 동안 배양 되어, 천연된 샘에 대 한 시각적으로 부 화 미디어의 50 µ L을 제거 합니다. 선 밀도 또는 하지 않은 경우 추가 5-10 분 동안 떠나 조직 으로부터 분리.</li>
	<li>50 mL을 추가, 부 화 직후 살 균 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 부 화 미디어 또는 외피 혼합물에 직접 붓는 의해 미리 DMEM/F12를가 열.</li>
	<li>4 50 mL 원뿔 튜브로 멸 균 거 즈를 통해 선 혼합물을 필터링 합니다. 추출 된 땀 샘 원뿔 튜브의 하단에 정착 수 있도록 15 분 동안 얼음에 여과 액을 유지 합니다. 수 정착된 동맥 방해, 제거 하 고 상단 표면에 뜨는 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 40 mL을 삭제 하지 않도록 주의 하십시오. 항생제로 보충 하는 DPBS의 10 mL에 나머지 10 mL를 resuspend.</li>
	<li>5 mL 셀 문화 시험관으로 혼합물을 균등 하 게 배포 합니다. 4 ° C에서 65 x g에 5 분 동안 centrifuge 고 상쾌한 한 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 제거 합니다. 피 펫 또는 200 µ L 넓은 피 펫 팁을 사용 하 여 해 동된 지하실 멤브레인 매트릭스에 선 펠 릿 resuspend 동 질 때까지 섞는다. 참고: 얼음에이 단계를 수행 하 고 혼합 하는 동안 지하실 멤브레인 행렬의 합을 피하기 위하여 결정적 이다. 또한, 그것은 시각적으로 선 밀도 50 µ L에 대 한 샘플링 검사 하는 것이 중요입니다. 최적의 밀도 ~ 70 %confluency입니다.</li>
	<li>다음으로, 지하실 멤브레인 매트릭스 넓은 스쳐 피 펫을 사용 하 여 50 µ L에 선 접시. 도금 하는 동안 모든 거품을 생성 하지 마십시오.</li>
	<li>37 ° c.에 10-15 분 동안 품 어 유해를 지하실 멤브레인 매트릭스를 허용 하려면 12 잘 문화 접시에 도금 하는 경우 추가 hFGO 미디어의 1 mL (고급 Dulbecco의 수정된이 글 매체/F12 매체 보충 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린/스, 0.25 mg/mL 암포 B 10 mg/mL Gentamicin, 50 mg/mL 대, 10 mM HEPES 버퍼, 1 m m n-Acteylcystine, 1 x N2, B27, Wnt 조절 매체 50%, 20% R spondin 조절 매체 100 ng/mL으로 보충 1 뼈 morphogenetic 단백질 억제제, 1 nM gastrin, 50 ng/mL 표 피 성장 인자, 200 ng/mL 섬유 아 세포 성장 인자 10, 10 니코틴, 및 10 µ M Y-27632 바위 억제제) 잘 당. 그렇지 않으면 12-잘 문화 접시를 사용 하 여 추가 지하실 멤브레인 매트릭스 거품 잠수함 충분 한 미디어.</li>
	<li>5% CO2 습도 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포 문화. 모든 4-5 일 미디어를 변경 합니다.</li>
</ol>2. 마우스 파생 3D 위 Fundic Organoids 구축
참고:이 프로토콜은 이전에 게시 6되었습니다. 얼음 지하실 멤브레인 매트릭스를 해 동 하 고 시작 하기 전에 모든 시 약 준비.
<ol><li>연구 수행 되 고 있는 연구 기관에 의해 승인 메서드를 사용 하는 쥐를 희생. 마우스에서 위를 제거 하 고 이전에 게시 프로토콜 6따라 해 부. 20 mL 얼음 차가운 캘리포니아2 +/Mg2 +세척-DBPS 무료. 참고: C57BL/6 마우스, 세 8-10 주 fundic 위 organoid 문화에 대 한 사용 됩니다. 쥐 위 제거 하기 전에 수동 경부 전위 뒤 이산화탄소의 흡입에 의해 안락사 되었다.</li>
	<li>위장에서 근육 층을 제거 하 고 모든 보이는 혈관 이전 6출판.</li>
	<li>동굴에서 살 균 면도날을 사용 하 여 forestomach는 저를 구분 합니다. 작은 수술가 위를 사용 하 여 파편 약 2.0 x 2.0 m m. 집게를 사용 하 여에 컷된 저 EDTA 인큐베이션 버퍼를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 파편을 수집 (캘리포니아2 +/Mg2 +-무료 DPBS, 5 mM EDTA)와 함께 2 h 4 ° C에서 품 어 부드러운 동요입니다.</li>
	<li>살 균 후드, 원뿔 관 두고 그대로 조각 가능한 많은 외피 버퍼를 제거 하는 피 펫을 사용 하는 약 5 분에 대 한 얼음 조각. 추가 버퍼를 떨고 5 mL (1 g D-솔 비 톨, 100 ml Ca2 +/Mg2 +1.47 g 자당-DPBS 무료) 2 분 허용 정착 하 고 서둘러, 1000 p 피 펫을 사용 하 여 제거 아직 정착 해야 작은 조각 큰 조각 힘으로 손으로 흔들어 상위 계층.</li>
	<li>65 x g에서 4 ° C에서 5 분 동안 제거 조각 회전.</li>
	<li>공기 거품을 피하 면 서,는 상쾌한을 제거 하 고 지하실 멤브레인 매트릭스에 resuspend 때까지 균질 성 혼합.</li>
	<li>넓은 팁 피 펫을 사용 하 여 잘 당 50 µ L에서 지하실 멤브레인 매트릭스 접시와 다음 20 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>충분 한 mFGO 성장 매체 추가 (고급 Dulbecco의 수정이 글 매체/F12 매체 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린/스, 10mm 보충 HEPES 버퍼, 1 m m n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50 %Wnt 조절 매체, 20% R spondin 조절 매체와 100 ng/mL 뼈 morphogenetic 단백질 억제제, 10 nM gastrin, 50ng/mL 표 피 성장 인자, 10 ng/mL 섬유 아 세포 성장 인자 10, 10 µ M Y-27632 바위 억제제 보충) 거품 잠수함.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2 습도 셀 문화 인큐베이터에서 세포 문화. 모든 4-5 일 미디어를 변경 합니다.</li>
</ol>3. 콜라겐 코팅 2D 전송
참고: 별도로 지정 하지 않는 한 무 균 조직 문화 후드에 모든 절차를 수행 합니다. 콜라겐은 단층을 3D organoids를 전송 하기 전에 24 시간 코팅을 시작 합니다. 얼음에 쥐 꼬리 콜라겐을 유지 하 고 빛 으로부터 차폐 된. 콜라겐 코팅 접시는 최대 2 주에 대 한 좋은. 코팅된 접시를 즉시 사용 하지, 경우 랩 parafilm 및 필요한 때까지 4 ° C에서 저장소 접시.
<ol><li>쥐 꼬리 콜라겐 20 m m 초 산을 사용 하 여 50 µ g/mL로 희석.</li>
	<li>충분히 희석된 콜라겐과 우물의 표면 커버. 표준 12-잘 접시에 한 잘, 콜라겐의 약 1 mL와 함께 코트. 살 균 후드에 실 온에서 하룻밤 둡니다.</li>
	<li>캘리포니아2 +/Mg2 +1 mL로 두 번 세척-DPBS 잘 당 고 떠나 살 균 후드에 실 온에서 2 h에 대 한 발견.</li>
</ol>4. 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅 2D 전송
참고: 별도로 지정 하지 않는 한 무 균 조직 문화 후드에 모든 절차를 수행 합니다. 지하실 막 매트릭스 2 h는 단층을 3D organoids를 전송 하기 전에 코팅을 시작 합니다. 얼음에 지하실 멤브레인 매트릭스를 유지. 코팅된 판 즉시 사용할 수 있으며 시간의 오랜된 기간 동안 저장할 수 없습니다.
<ol><li>지하실 막 매트릭스 셀 문화 학년 물 15 mL 원뿔 튜브에 1:10 희석 비율. 얼음에 희석.</li>
	<li>표준 12-잘 접시의 각 잘 희석된 지하실 멤브레인 매트릭스의 100 µ L를 추가할는 피 펫을 사용 하 여. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 균등 하 게도 코트 잘 걸쳐 희석된 지하실 멤브레인 매트릭스를 배포 합니다.</li>
	<li>1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 잔여 물을 제거 하 고 3D organoids를 전송 하기 전에 1 시간 실 온에서 건조.</li>
</ol>5. 2D 위 상피 세포 Monolayers 3D m/hFGOs의 전송
<ol><li>후 3D 마우스-또는 인간-파생 된 FGOs에 6-7 일에 대 한 교양 있다, 2D 단층을 3D organoids의 전송을 시작 합니다. 참고: 필요한 단층의 각 잘이 좋습니다 300 그대로 organoids 또는 300 organoids에서 파생 된 단일 셀을 사용 하 여. 강력한 문화에서 그것 약 150 organoid/잘 12 잘 문화 배지 내의 얻을 예정 이다.</li>
	<li>접시는 전송 하기 전에 코팅 해야 합니다. 그러나 참고: 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅 접시 반투명 젤 레이어,, 콜라겐 코팅 판 코팅의 어떤 명백한 표시 없는 것입니다.</li>
	<li>직접 pipetting 1 mL 균 캘리포니아2 +/Mg2 +여 접시에서 3D 지하실 멤브레인 매트릭스 거품을 꺼내-거품의 중심에 DBPS 무료.</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여, 셀 문화 테스트 튜브로 지하실 멤브레인 매트릭스, organoid 혼합물을 수집 합니다. 튜브 당 2 지하실 멤브레인 매트릭스 거품의 비율로 수집 합니다. 40 x g와 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리기</li>
	<li>진공 시스템을 사용 하 여 제거는 상쾌한 그리고 최대한 많은 지하실 멤브레인 매트릭스. 캘리포니아2 +/Mg2 +4 ml에서 resuspend-무료 DBPS, 상쾌한를 제거 하 고 2-3 회 반복. 전체 organoid 전송 프로토콜에 대 한 5.10 단계로 진행 합니다. 5.7 단일 셀 서 스 펜 션 프로토콜에 대 한 단계를 계속 합니다.</li>
	<li>37 ° C에 세포 분리 솔루션을 미리 따뜻한 고 각 시험관에 1 mL를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 반전 하거나 한 피 펫으로 아래로 pipetting으로 혼합. 37 ° c.에서 10 분 동안 품 어</li>
	<li>캘리포니아2 +/Mg2 +의 2 개 mL를 추가-각 테스트 튜브에 직접 DBPS 무료.</li>
	<li>26 G 바늘을 사용 하 고 주사기는 혼합 2-3 번. 시각적으로 하나의 셀에 대 한 확인 합니다. Organoids 또는 셀의 클러스터는 여전히 1-2 번 더 주사기.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 40 x g에서 원심 분리기 2D FGO 미디어에 펠 릿을 resuspend (2D 마우스 FGO 성장 매체: 고급 Dulbecco의 수정된이 글 매체/F12 매체 보충 2 m L-글루타민, 10mm 페니실린/스, 10% 태아 종 아리 혈 청, 10 mM HEPES 버퍼, 1 x N2, 1 x B27, 10 nM gastrin, 50 ng/mL 표 피 성장 인자, 1 µ M TGF-β 억제제와 10 µ M Y-27632 바위 억제제 보충. 2D 인간의 FGO 성장 매체: 고급 Dulbecco의 수정된이 글 매체/F12 매체 보충 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린/스, 10 mM HEPES 버퍼, 10% 태아 종 아리 혈 청, 10mm 니코틴, 1 x N2, 1 x B27, 50 mg/mL 대, 50 ng/mL 상피 성장으로 보충 요인, 그리고 10 µ M Y-27632 바위 억제제, 1 µ M TGF-β 억제제).</li>
	<li>코팅된 판에 물의 resuspension 플레이트입니다. 37 ° c.에 번호판을 품 어 교체 미디어 매 4 일 또는 이전 미디어 노란색. 단층 형태로 약 4 일이 필요합니다.</li>
</ol>6. 스크래치 상처 분석 결과 2D 위 상피 세포 Monolayers를 사용 하 여
<ol><li>문화에는 100 %confluency 도달 했습니다 때 면도날을 사용 하는 단층 스크래치.</li>
	<li>실 온에서 15 분 동안 3.7% 포름알데히드를 사용 하 여 monolayers를 수정 합니다. 실 온에서 20 분 동안 0.5% 비 이온 세제/PBS와 permeabilize.</li>
	<li>다음 실 온에서 1 h에 대 한 혈 청 2% 당나귀와 monolayers를 차단 하 고 H+, K+의 1:1000 희석을 품 어-ATPase 1 차적인 항 체 하룻밤 4 ° C에서 0.1% 비 이온 세제/PBS로 세척 및 당나귀의 1: 100 희석으로 품 어 반대로 마우스 488 이차 항 체 및 10μg/mL Hoechst 세포 핵의 실 온에서 1 시간을 위한 얼룩.</li>
	<li>2D 인간 파생 위 단층 문화에 표면 점액 핏 셀을 확인 하려면 셀 20 μ g /mL Ulex europaeus (UEAI) FITC 켤레의 얼룩. 이미지는 confocal 현미경에 monolayers.</li>
	<li>상처 마다 몇 h. 스크래치 것입니다 다시는 단층의 품질에 따라 24-48 h와 환자 사이 사이 epithelialize의 이미지를 가져가 라.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

현재 프로토콜 세부 인간 및 마우스 파생 된 위 상피 monolayers 스크래치 상처 분석 실험을 위해 사용 될 수 있는 설립. 프로토콜 주민 줄기 세포 주 인간 (또는 마우스)에서 절연 조직의 개념에 의존 하 고는 수정 된 프로토콜 처음 발행 Schlaermann 외7. 특히, 우리는 합칠 확립 여기 프로토콜을 최적화 하 고 어떤 표현 주요 세포 계보 vivo에서위 상피 내에서 찾을 수 있는 위 상피 단층 편광. 위계 양 수리 조직 재 epithelialization, 재생, 및 확산9,,1011를 포함 하는 복잡 한 프로세스입니다. 특히, 우리 연구소는 위 상피의 재생 재생 위 샘 내 궤 양 여백에 spasmolytic polypeptide/개미 자리의...

처음 상처 분석 실험의 사용 수리 및 재생1,2,,34,,56공부에 대 한 인기 있는 방법입니다. 특별히 위 중생과 헬리코박터 파일로리 식민지 연구 제안 된 방법론을 사용할 수 있습니다. 과거에는, 위 암 세포 선 헬리코박터 파일로리 (헬리코박터) 감염1,2 를 공부 하는 수단으로 사용 되었습니다 했으며 최근 위 암까지 AGS 셀 등 셀 라인 선호1 ,2,,34. 위 암 세포 배양의 한계가 정리 위 상피의 세포 다양성에 그들의 실패 이다. 이 한계를 해결 하려고 하 시연 설립 및 기본 인간 및 마우스 파생 3 차원 fundic 위 organoids (FGOs)의 이동은 여기 먼저 수정 된 방법에 따라 상처 치유 분석 실험에 대 한 위 상피 단층을 Schlaermann 외에의해 설명. 7 위 상피 monolayers에서 파생 된 전단 3D 위 FGOs 또는 단일 셀 FGO 파생 된 유지 밀접 하 게 위 상피의 나타내는 편광된 세포 구성 시연 vivo에서. 위 암 셀 라인 팬 들은이 기술을 표시 셀 구성의 정보를 입증 하지 않습니다, 그는 현재 프로토콜 대체 스크래치 상처 분석 방법에 비해 장점이 있다. 이 방법론은 해리 organoids에서 단일 세포 현 탁 액 또는 전체 organoids에서 설립 하 고 지하실 멤브레인 매트릭스를 사용 하 여 도금 또는 콜라겐 코팅 monolayers 수 면 최적화 되었습니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 organoid 파생 된 위 상피 단층 문화 소설 상처 치유 분석 결과 대 한 설정입니다.

<table><tbody><tr><td>Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (L-glutamine)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B/Gentamicin</td><td>Thermo Scientific</td><td>R01510</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>RO1510</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 버퍼</td><td>시그마 Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>n-아세틸시스틴</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>BMP 억제제(Noggin)</td><td>Pepro Tech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Tocris</td><td>3006</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Pepro Tech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Pepro Tech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK 억제제</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 억제제</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+/Mg2+ -free DPBS</td><td>Fisher</td><td>21-031CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>FBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPTIMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22&micro; M 필터</td><td>Fisher</td><td>099-720-004</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C 수조</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 유형 1</td><td>Worthington&nbsp;</td><td></td><td></td>LS004214</tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마 알드리치</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes (티슈 페이퍼)</td><td>Fischer Scientific</td><td>06-666C</td><td></td></tr><tr><td>125 mL 둥근 바닥 플라스크</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 in (25 mm) 교반 막대</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>고무 격막</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 거즈</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>교반 플레이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>링 스탠드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>링 스탠드 클램프</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 페트리 접시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5인치 길이의 바늘 18G</td><td>Thermo Fisher</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>3.5인치 길이의 척추 바늘 20G</td><td>Thermo Fisher</td><td>405182</td><td></td></tr><tr><td>12웰 세포 배양 처리 플레이트</td><td>미드웨스트 사이언티픽</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>성장 인자 감소, 페놀 레드-프리 MatrigelTM (기저막 매트릭스)</td><td>Fisher</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>멸균 면도날</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>와이드-팁 핀셋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>곡선형 헤모스태틱 펜치</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &마이크로; L 와이드 피펫 팁</td><td>Thermo Fisher</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 세포 배양 시험관</td><td>Fisher</td><td>14-956-3C</td><td></td></tr><tr><td>고무 호스</td><td></td><td></td><td></td>가 있는 산소 탱크</tr><tr><td>1 g D-소르비톨</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수크로오스</td><td>Fisher</td><td>SS-500</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 트레이</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>흔들 테이블</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>쥐 꼬리 콜라겐 유형 1</td><td>Life Technologies</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 등급 빙초 Fisher</td><td></td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 등급 물</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>2웰 챔버 슬라이드</td><td>Thermo Fisher</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>12-웰 Transwell (폴리에스테르 멤브레인 인서트)</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Corning</td><td>353086</td><td></td></tr><tr><td>Accutase (cell detachment solution)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>263/8 G syringe</td><td>Thermo Fisher</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L Cells</td><td>Wnt3a 생산 세포주인 L 세포는 Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, 네덜란드)로부터 선물로 받았습니다. &nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T Rspondin 분비 세포</td><td>변형된 HEK-293T R-스폰딘 분비 세포주는 Jeff Whitsett 박사(미국 신시내티 소재 신시내티 의과대학 신생아학, 주산기 및 폐 생물학 섹션)로부터 획득되었습니다. &nbsp; &nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HK-ATPase 1차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>SC-374094</td><td></td></tr><tr><td>E-Cadherinn</td><td>SantaCruz</td><td>sc-59778</td><td></td></tr><tr><td>UEA1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9006</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 488 secondary 항체 (Donkey anti-mouse 488 secondary 항체)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37114</td><td></td></tr></tbody></table>

중생의 연구에 대 한 기본 위 상피 단층 문화 마우스 및 인간의 파생

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

위 상처 복구의 생체 외에서 연구는 일반적으로 세포질 확산 및 마이그레이션의 스크래치 상처 분석 결과에서 위 암 세포 라인의 사용을 포함 한다. 그러나 이러한 분석의 한 가지 중요 한 한계는, 그들의 균질 성 다양 한 세포 종류입니다. 복구는 여러 종류의 세포 상호 작용을 요구 하는 복잡 한 프로세스입니다. 따라서, 세포 하위, 없는 문화 공부를 우리가 복구 프로세스를 이해 하 고 있다면 극복 되어야 하는 관심사 이다. 위 organoid 모델에 의하여 세포 유형의 이기종 컬렉션 밀접 하 게 위 상피 또는 다른 기본 조직 비보의 반영이 문제를 완화 수 있습니다. 여기는 소설, 스크래치 상처 시험 생체 외에서 인간에서 파생 된 증명 또는 마우스 3 차원 organoids 다음으로 옮겨질 수 위 상피 단층 중 그대로 organoids 또는의 단일 세포 현 탁 액으로는 해리 organoids입니다. 프로토콜의 목적은 organoid 파생 된 위 상피 monolayers 위 재생 연구 소설 스크래치 상처 분석 결과 시스템에서 사용할 수 있는 설정입니다.

Organoids는 인간의 코 퍼스/본문 또는 마우스 위 조직 (그림 1A)의 저에서 파생 되었다. 콜라 또는 인간 또는 마우스 파생 된 위장 조직의 EDTA 소화 후 각각 샘 지하실 멤브레인 매트릭스에 포함 되며 6-7 일 (그림 1A)에 대 한 교양. 그림 1B 인간 파생 위 organoids (huFGOs) 다음 위 상피 단층 (huGEM)로 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅 챔버 슬라이드에 전송 되었습니다의 형성을 보여 줍니다. 4 일 후 문화, confluent huGEMs 스크래치 상처 분석 실험 (그림 1B)에 사용 되었다. 이미지는 24 시간 (그림 2)의 기간 동안 문화 안에 상처 폐쇄를 보여준...

여기는 설정 하 고 2 차원 단층을 3D organoids의 전송에 대 한 인간 및 마우스 파생 된 3 차원 (3D) 위 organoids, 그리고 방법을 경작 하는 프로토콜에 설명 합니다. 재생 연구에 대 한 분석 결과 처음 상처를 소설로 위 상피 단층의 사용은 또한 기술 된다.

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

이 배양 시스템의 전반적인 목표는 상처 치유 분석에서 재생 연구를 위해 1차 마우스 또는 인간 유래 위 단층을 생성하는 것입니다. 이 방법은 부상에 대한 반응으로 위 상피 세포 재생의 메커니즘과 같은 위 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 첫째, 1차 마우스 또는 인간 유래 위 세포에서 생성된 상처 치유 분석에서 세포 이동 및 재생에 대한 연구와 대규모 실험을 위한 2세대 인간 유래 위 오가노이드입니다.이 방법은 위 상피의 재생에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 헬리코박터 파일로리 감염 및 상피 면역 세포 공동 배양과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Emma Teal입니다. 먼저 칼슘 마그네슘 프리 DPBS로 채워진 큰 플라스틱 용기에 준비된 조직을 수집합니다.사용할 때까지 플라스틱 용기를 얼음 위에 두십시오. 다음으로, 집게를 사용하여 100ml의 칼슘 마그네슘 프리 DPBS가 들어 있는 멸균 비커에서 약 30초 동안 조직을 세게 씻습니다. 그런 다음 멸균 거즈를 사용하여 상피의 점액층을 닦아냅니다.다음으로, 큰 집게를 사용하여 조직의 근육층을 단단히 잡은 다음 큰 구부러진 지혈 집게를 사용하여 힘으로 상피를 긁어냅니다. 긁어낸 상피를 멸균 폴리스티렌 페트리 접시에 보관하십시오. 조직 소화를 최적화하려면 상피 조직을 조각으로 다지십시오.그런 다음 항생제가 보충된 칼슘 마그네슘 프리 DPBS로 조직을 씻습니다. 여러 번 씻어 혈액을 제거하십시오. 세척액은 쓰레기 비커에 버리십시오.그런 다음 세척된 상피 조각을 25mm 교반 막대와 예열된 배양 배지가 있는 125ml 유리 둥근 바닥 플라스크에 수집합니다. 조직 조각을 수집한 후 둥근 바닥 플라스크를 격막으로 밀봉합니다. 그런 다음 클램프를 사용하여 설정을 링 스탠드에 고정합니다.그런 다음 격막에 20게이지 척추 바늘을 삽입합니다. 고무 호스로 격막을 산소 탱크에 연결합니다. 파열을 방지하기 위해 격막에 10-15개의 유출 바늘을 삽입하고 산소 유출 스위치를 낮게 켭니다.그런 다음 교반 플레이트에서 섭씨 37도에서 30-45분 동안 수조를 보정합니다. 보정이 완료되면 설정을 수조에 넣습니다. 배양 15분 후 해리된 땀샘을 확인합니다.원하는 배양 시간 후, 혈청학적 피펫을 사용하여 15ml의 예열된 DMEMF12를 배양 배지에 추가합니다. 다음으로, 멸균 거즈를 통해 얻은 샘 혼합물을 4개의 15ml 원뿔형 튜브에 여과합니다. 그런 다음 얼음에서 15분 동안 여과액을 배양합니다.이렇게 하면 샘이 원뿔형 튜브의 바닥에 가라앉을 수 있습니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 글랜드 현탁액 상단에서 40ml의 상등액을 버립니다. 항생제가 보충된 DPBS 10ml에 나머지 10ml의 glad 혼합물을 다시 현탁합니다.그런 다음 전체 혼합물을 5mL 세포 배양 시험관에 분배합니다. 튜브를 섭씨 4도에서 5분 동안 65배 G로 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 제거합니다.얻어진 선상 펠릿을 넓은 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 생각 기저막 매트릭스로 용해시킵니다. 균질해질 때까지 현탁액을 혼합합니다. 그런 다음 끝이 넓은 피펫을 사용하여 기저막 매트릭스의 15마이크로리터에 땀샘을 플레이트합니다.기저막 매트릭스가 중합되려면 섭씨 37도에서 10-15분 동안 배양합니다. 그런 다음 12웰 배양 플레이트에서 배양하는 경우 각 웰에 1ml의 hFGO 배지를 추가합니다. 그런 다음 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.45일마다 매체를 변경합니다. 3D 마우스 또는 인간 유래 FGO 배양 6-7일 후 3D 오가노이드를 2D 단층으로 옮기기 시작합니다. 이렇게 하려면 기포 중앙에 1ml의 칼슘 마그네슘 프리 DPBS를 추가하여 플레이트에서 3D 기저 멤브레인 기포를 제거합니다.그런 다음 세포 배양 튜브에서 기저막 매트릭스와 오가노이드 혼합물을 수집합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 40배 G로 원심분리합니다. 원심분리 후 진공 시스템을 사용하여 상층액과 기저막 매트릭스를 최대한 많이 제거합니다.그런 다음 펠릿을 칼슘 마그네슘이 없는 DPBS 4ml에 녹입니다. 단층을 준비하기 위해 오가노이드를 수확한 후 가능한 한 많은 기저 매트릭스를 제거해야 합니다. 다음으로, 섭씨 37도에서 예열된 세포 분리 용액 1ml를 각 시험관에 추가합니다.그런 다음 여러 번 뒤집어 튜브의 내용물을 혼합합니다. 마지막으로 섭씨 37도에서 10분 동안 튜브를 배양합니다. 단일 세포 현탁액을 얻으려면 2ml의 칼슘 마그네슘 프리 DPBS를 각 시험관에 직접 첨가하십시오.그런 다음 26 게이지 바늘을 사용하여 현탁액을 2-3 번 혼합합니다. 혼합 후 세포 현탁액을 원심 분리한 다음 세포 펠릿을 2D FGO 배지에 용해시킵니다. 전체 오가노이드를 얻으려면 코팅된 플레이트에 세포 현탁액을 플레이트합니다.그런 다음 약 4일 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 색상이 노란색으로 바뀌면 매체를 변경합니다. 배양이 100% 포화도에 도달하자마자 면도날을 사용하여 단층을 긁습니다.그런 다음 3.7% 파라포름알데히드를 사용하여 실온에서 15분 동안 단층을 고정합니다. 다음으로, Triton X-100으로 단층을 실온에서 20분 동안 투과시킵니다. 투과화 후, 2% 당나귀 세럼으로 단층을 한 시간 동안 차단합니다.1시간 동안 차단한 후 1차 항체 용액으로 단층을 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 하룻밤 사이에 배양물이 증발하고 건조되는 것을 방지하기 위해 단층을 파라필름으로 감쌉니다. 다음날 PBS에 0.1%의 비이온 세제로 세척합니다.그런 다음 2차 항체와 1밀리리터당 10마이크로그램의 숙주 세포 핵 염색을 실온에서 한 시간 동안 배양합니다. 다음으로 세포를 염색합니다. 그런 다음 컨포칼 현미경으로 2D 인간 유래 위 단층 배양에서 표면 점액 구덩이 세포를 식별합니다.마지막으로, 몇 시간마다 상처의 이미지를 캡처합니다. 타임랩스 분석의 이러한 이미지는 인간 FGO의 형성을 보여줍니다. 이러한 오가노이드는 기저막 매트릭스 코딩 챔버 슬라이드의 위 상피 단층으로 전달됩니다.위 상피 단층은 하루 동안 8시간마다 분석됩니다. 이미지는 상처 부위가 계속 줄어들고 단 하루 만에 배양에서 완전히 사라지는 것을 보여줍니다. 이 면역 형광 염색은 표면 점막 세포로 구성된 E-cadherin 양성 단층의 존재를 보여줍니다.이것은 위 상피 단층의 재생을 나타냅니다. 존재하는 핵은 hoechst로 염색됩니다. 그런 다음 인간 위 상피 단층에서 추출한 RNA를 사용하여 RTPCR 분석을 수행하여 두정면 점막, 주경 및 점막 경부 세포의 발현을 확인합니다.ATPa 및 PgC의 존재는 각각 두정세포와 주세포의 존재를 보여줍니다. MUC5AC 및 MUC6의 존재는 각각 표면 점액 및 점액 목 세포의 존재를 나타냅니다. 이 면역 형광 이미지에서는 인간 위 상피 단층 배양에서 증식하는 세포가 EdU의 준비된 흡수에 의해 표시됩니다.이러한 면역 형광 이미지는 스크래치 상처 후 0시간, 8시간, 16시간 및 24시간에 위 상피의 재생과 표면 점막 및 두정세포의 발현을 보여줍니다. 일단 마스터하면 3D에서 2D로의 전송이 제대로 수행되면 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 2D 전달 전에 수확된 오가노이드에서 기저막 매트릭스를 최대한 씻어내야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 숙주 병원체 상호 작용과 같은 추가 질문에 답하기 위해 단층 내 헬리코박터 파일로리 감염 및 단층 면역 세포 공동 배양과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 위장병학 분야의 연구자들이 위의 질병과 재생을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 인체 조직으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 멸균 기술 및 개인 보호 조치와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 인간의 기저 조직에서 위 상피 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 분리된 상피 세포는 위 생리학 및 병태 생리학에서 조절 역할을 연구하기 위한 체외 모델로 사용할 수 있습니다.

위 안저 땀샘 격리 : 인간의 위 조직에서 기저 땀샘을 분리하는 방법

이 비디오는 쥐의 망막에서 분리된 Müller glial (MG) 세포의 배양을 보여줍니다. 망막은 소화 효소를 사용하여 단세포 현탁액으로 해리됩니다. 그런 다음 세포는 MG 세포 증식과 신경 세포 사멸을 촉진하는 성장 인자를 가진 배지에서 성장합니다. 파시에이징(passaging) 과정에서 죽은 신경세포를 제거하고 MG 세포를 성장시켜 추가 분석을 진행합니다.

마우스 망막에서 얻은 Müller Glial 세포 배양 확립

줄기세포 유래 배양은 감염병을 모델링할 수 있는 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 여기에서는 성체 줄기 세포에서 유래한 마우스 및 인간 위 오가노이드의 배양에 대해 설명합니다. 오가노이드에는 위 병원균인 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)가 미세주입됩니다.

감염증에 대한 모델로 Organoids : 헬리코박터 파이로리의 인간의 문화와 쥐 위장 Organoids 및 미세 주입

이 프로토콜은 혼합 된 쥐의 소장 세포의 분리 및 문화에 대해 설명합니다. 이러한 기본 장 배양 기법들을 사용하여 장내 펩타이드 분비 하부 신호 전달 경로의 조사를 가능하게한다.

장 내분비 세포의 굿 호르몬 분비의 연구 및 라이브 세포 이미징을위한 의도 된 쥐 소장의 혼합 차 문화

여기, 우리는 기본 유 방 암 세포 뿐만 monocytes 그리고 콜라겐 저하, 면역 세포 모집, 셀 결과 함께 그들의 직접/간접적인 상호 작용 연구로 형태를 분석 하는 3 차원 문화 방법 설명 침공, 그리고 암 관련 된 염증의 승진.

(ECME) 추출 Monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템

우리는 단계별 지침을 설명합니다 : 1) 렌티 또는 레트로 바이러스 변환을위한 자기 나노 입자를 사용하여 장 오르가노이드를 효율적으로 엔지니어링하고, 2) 엔지니어링 된 오르가노이드에서 냉동 섹션을 생성합니다. 이 접근은 다운스트림 효력의 조사를 위한 organoids에 있는 유전자 발현을 능등하게 바꾸는 강력한 공구를 제공합니다.

냉동 절편을 위한 자기 나노입자 전착 바이러스성 벡터를 사용하여 1 차적인 마우스 장 오르가노이드의 유전 공학

이 프로토콜에서, 우리는 장 지하실에서 직접 뮤린 기본 상피 결장 단층층을 생성하는 방법을 설명합니다. 우리는 투과성 필터에 컨천단층을 생성하기 위한 실험적 접근법, 스크래치 상처 치유 및 생화학 연구를 위한 컨큐리 단층, 면역 형광 분석을 위한 희소및 응수 단층층을 제공합니다.

장 내 토굴에서 뮤린 기본 결장 상피 단층의 세대

마우스 망막으로부터 수득된 뮐러 글리아 일차 배양물은 마이크로RNA 처리 후 망막 전구 세포로의 신경교세포 전환을 연구하는 매우 강력하고 신뢰할 수 있는 도구를 나타낸다. 단일 분자 또는 조합물은 생체내 접근법의 후속 적용 전에 시험될 수 있다.

MicroRNA 처리 후 Murine Müller Glia의 재생 잠재력을 연구하기 위한 일차 세포 배양

위 환자 유래 오가노이드는 연구에서 점점 더 많이 사용되고 있지만, 표준화된 파종 밀도를 가진 단일 세포 분해물에서 인간 위 오가노이드를 생성하기 위한 공식적인 프로토콜은 부족합니다. 이 프로토콜은 상부 내시경 검사 중에 얻은 생검 조직에서 위 오가노이드를 안정적으로 생성하는 자세한 방법을 제시합니다.

양성 위체 및 안방 상피의 생검에서 환자 유래 위 오가노이드의 확립 및 특성화

Peyer의 패치를 다루는 전문 뿌리 - 관련 상피의 M 세포는 창자 - 관련 림프 조직에서 점막 immunosurveillance을위한 중요한 역할을한다. 여기 우리는 M 세포에 의해 세균 transcytosis에 대한 평가 방법을...

마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

배우세요 위상피 세포 재생 메커니즘을 연구하기 위한 3D 위 오가노이드에서 2D 단층 배양으로의 전환 기법을. 이 방법은 마우스 및 인간 유래 원발성 위 세포를 이용한 상처 치유 분석에 활용됩니다.

중생의 연구에 대 한 기본 위 상피 단층 문화 마우스 및 인간의 파생

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