Name: 자동된 슬라이드 스캔 및 Widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템을 사용 하 여 붙일 표시 된 조직에서 시장 세분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 배우세요 와이드필드 하이 콘텐츠 분석 시스템을 사용하여 형광 표시된 조직의 자동 분할을 수행하는 방법을. 이 프로토콜은 생물학적 과학 및 의료 공학 연구에서 단백질 정량화의 정확성과 효율성을 크게 향상시킵니다.

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이 프로젝트는 건강 연구의 캐나다 학회 및 앨버타 혁신-건강 솔루션/앨버타 암 재단에서 교부 금에 의해 투자 되었다. 저자는 그들의 장비, 건물 기초는 슬라이드 스캔은 WHCAS에서 가능 하 게 되었다, 그리고 제품의 창조 자에 폴라 Gedraitis의 일의 사용에 대 한 신경 생물학 핵심 시설에 재생 단위를 인정. 이 문서에서는, 분자 장치 언급.

종양 표본은 프로토콜 로컬 제도적 검토 보드 및 윤리 위원회에 의해 승인 및 국가 규정에 따라 실시에 의하여 얻은 했다. WHCAS 및이 문서에서 사용 되는 관련된 소프트웨어 자료의 테이블에에서 나열 됩니다.
1. 가져오기는 저널
<ol><li>관련된 소프트웨어를 엽니다.</li>
	<li>재료의 테이블에에서 표시 된 저널 스위트를 다운로드 합니다.</li>
	<li>저널을 향하고 주 메뉴를 클릭 하 여 적절 한 디렉터리에 저널 스위트를 가져오기 가져오기 저널 스위트...,을 선택 하 고 가져오기를 클릭 하.</li>
</ol>2. 만들기 설정 미리 보기에 대 한 검색 인수
<ol><li>플레이트 수집 설정 대화 상자에서 이동 목표 및 카메라 탭 선택 4 배 확대, 카메라 binning으로 1과 2는 이득으로.</li>
	<li>접시-Slidescanning탭 그림 1A 에 설정을 입력 합니다. 참고: 이러한 설정은 사용자 보고 최대 3 슬라이드를 탐색할 수 있도록 개발 되었습니다. 각 슬라이드 쉬운 탐색을 위한 3 인접 한 우물으로 분리 되어 고 '라이브' 조직 조각 또는 셀의 시각화.</li>
	<li>방문 사이트 탭에서 사이트와 우물을 균일 하 게 작성.</li>
	<li>플레이트 하단 설정 편집... 을 클릭 하 고 그림 1B에서 표시 되는 값을 입력.</li>
	<li>인수 루프 탭에서 미리 보기 스캔에 대 한 원하는 파장 (이 예제에서 어떤 핵 얼룩)를 입력 합니다. 최고의 콘트라스트 및 초점 이미지 기반, 밝은 형광 신호 (예를 들어, 자주 핵 얼룩)를 사용 합니다. 참고: 조직 핵 얼룩 같은 밝은 얼룩으로 얼룩이 지기 것이 좋습니다 이후 백그라운드에 비해 높은 콘트라스트를 제공 하는이. 뿐만 아니라 샘플 위치에이 지원 되지만 다음 높은 배율 인수에 하나 이상의 fluorophore 이미징 때 밝은 색상은 다른 색상의 이미징 오프셋을 기준 하는 데 사용 됩니다.</li>
	<li>함께 이미지를 플레이트 수집 모드에서 음영 보정 을 사용 합니다.</li>
	<li>A. 설정 이러한 설정을 저장합니다</li>
</ol>3. 고배율에서 슬라이드 인수에 대 한 설정 만들기
<ol><li>플레이트 수집 설정 대화 상자에서 이동 목표 및 카메라 탭 선택 40 X (해상도 대 한 최고의 디지털), 카메라 binning으로 1과 2 (신호 및 이미지의 밝기를 증가)를 이득으로 확대 합니다. 참고: 낮은 객관적인 배율 설정을 사용할 수 있습니다, 하지만 작가 찾을 인간의 microglia 및 다중 파장 셀 득점 모듈을 사용 하 여 뇌 종양 조직에서 세포의 분석에 대 한 최적의 설정 수 X 40.</li>
	<li>접시-Slidescanning 및 편집 판 하단 설정 탭 설정 A와 동일은 모든 설정을 확인 (단계 2 참조).</li>
	<li>얻은 이미지 선명 하 고 있다면, 잘 깊이, 판 높이및 플레이트 하단 설정 조정 초점을 변경할. 초점 문제가 여전히 경우 자동 초점 옵션 섹션 아래 레이저 이미지 복구 를 선택 합니다.</li>
	<li>인수 루프 탭 아래 샘플에 존재 하는 파장의 수를 입력 합니다. 초점 레이저 기반 사용 하 고 (인수 또는 레이저 복구)에 대 한 초점 이미지 기반 사용 옵션을 확인 합니다.</li>
	<li>자동 초점 탭 아래 판과 잘 하단에 초점을 선택 합니다.</li>
	<li>그림 2, 또한 선택 방지 비동기 하드웨어 이동 보장에 표시 된 대로 저널 탭에서 옵션을 선택 합니다.</li>
	<li>이 설정을 설정 B. 저장</li>
</ol>4. Widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템에서 슬라이드 배치
<ol><li>주 메뉴를 얻을 수 f 4 를 누릅니다. 검색 슬라이드를 선택 합니다. 오픈도어-추출 슬라이드를 클릭 하 고 슬라이드와 슬라이드 어댑터 (에 최대 3 개의 슬라이드를 저장할 수 있는) WHCAS (그림 3A 와 3B)에 삽입. 슬라이드 아래로 향하게 하는 coverslip와 슬라이드 어댑터 (그림 3A)에 노치 측면 라벨 동양. 참고:이 실험에서 사용 하는 슬라이드 1 mm 슬라이드 x 75 x 표준 25 했다.</li>
	<li>닫기 문-부하 슬라이드를클릭 하십시오.</li>
</ol>5. 미리 보기 스캔을 획득
<ol><li>상영 제목 아래 플레이트 수집 및 제어... 및 플레이트 수집 설치... 선택 하 고 설정 a. 로드</li>
	<li>방문에 웰 스 탭 필요는 잘 포함 하는 샘플을 마우스 오른쪽 클릭 버튼을 사용 하 여 이동 합니다. 셀 위치까지 방문 하는 사이트 탭 아래 라이브 이미지 캡처 다른 사이트로 이동 합니다. 수동으로 샘플에 집중 하거나 자동 초점을 사용 합니다. 캡처 이미지를 스냅 을 사용 합니다. 참고: 샘플 잘 사이트를 피팅 하 여 더 많은 사이트와 찾을 수 쉽습니다 (단계 2.3 참조).</li>
	<li>메인 메뉴에서 미리 보기 슬라이드를 선택 합니다.</li>
	<li>자동으로 팝업 되는 대화 상자에서 스캔 하려고 얼마나 많은 슬라이드를 반영 하는 옵션을 선택 합니다. 한 번에 한 슬라이드를 스캔 합니다. 확인키를 누릅니다. 4 X 배율을 선택 합니다. 확인키를 누릅니다. (0.17 m m) 아래로 Coverslip 슬라이드 방향 (사용 정정 고리 다른 coverslip 두께 사용 하는 경우) 선택 합니다. 확인키를 누릅니다. 계속을 클릭 합니다. 참고: 사용자가 2 이상의 슬라이드 미리 보기 스캔을 취득 하고자 하는 경우 각 미리 보기 스캔 해당 고배율 이미지의 인수 전에 개별적으로 열 수 있다.</li>
	<li>부하 검사 슬라이드 설정, 수집 설정 및 교정 상자 체크 확인. 취소를 누릅니다. 검색 슬라이드 설정 상자가 다시 나타납니다, 계속을 선택 합니다.</li>
	<li>슬라이드 스캔 대화 상자가 나타나면 그림 4A-4 C에 제안 하는 대로 설정을 조정 합니다. 가까운 완료를 선택 합니다. 참고: 카메라 binning 및 감소 하는 카메라의 노출 시간을 증가 발생 합니다 빠른 스캔, 이기는 하지만 낮은 디지털 해상도 동적 범위에서 각각, 그러므로 감소 이미지 품질. 음영 보정 보기의 단일 필드에 걸쳐 균일 한 강도 보장 합니다. 하드웨어 및 이미지 자동 설정 검색 초점에서 이지만 스캔 속도 보장 됩니다. 시간을 절약, 관심 낮은 확대 검사를 취득 하는 동안 수정 및 하드웨어 및 이미지 자동 초점에서 음영을 하지만이 옵션을 켜 6 단계에 대 한 높은 확대 이미징 동안 것이 좋습니다. 낮은 확대 스캔의 해상도 높은 확대 스캔의 해상도 영향을 미치지 않습니다.</li>
	<li>데이터를 검색 하는 슬라이드에 대 한 디렉터리를 선택 합니다. 확인을 클릭 합니다. 파일에 대 한 이름을 입력 합니다. 확인을 클릭 합니다.</li>
	<li>그리기 영역 대화 상자가 자동으로 표시 됩니다. 사각형 영역 도구 (그림 5A)를 사용 하 여 그림 5B와 같이 전체 미리 보기 스캔 영역을 선택. 계속을 클릭 합니다.</li>
	<li>설치 완료 대화 상자가 표시 됩니다. 계속을 선택 합니다. 참고: 미리 보기 슬라이드 스캔 지금 시작 됩니다.</li>
	<li>미리 보기가 완료 되 면 스캔 완료 대화 상자가 나타납니다. 계속을 선택 합니다. 미리 보기 검색 창을 닫지 마십시오 (이 예에서 DAPI 스캔 창; 그림 6참조). 참고: 설치 및 낮은 확대 스캔 수집 과정 약 20 분 소요 됩니다. 이후 높은 확대 이미지 수집 시간이 각 채널에 대 한 노출 시간 뿐만 아니라 선택 하는 사이트의 수에 따라 달라 집니다.</li>
</ol>6. 높은 확대 검사
<ol><li>B. 설정 로드</li>
	<li>어느 우물이 이미지 수를 확인 합니다. 방문에 웰 스 탭 필요는 잘 포함 하는 샘플을 마우스 오른쪽 클릭 버튼을 사용 하 여 이동 합니다. 참고: 기술 1 잘 이미징 의해 여기 증명 됩니다.</li>
	<li>세포 나 조직 때까지 방문 사이트 탭 아래 라이브 기능으로 다른 사이트로 이동 합니다. 수동으로 샘플에 집중 하거나 자동 초점을 사용 합니다. 캡처 이미지를 스냅 을 사용 합니다. 참고: 높은 확대에 샘플을 찾기에 투입, 자동 초점 없는 경우 샘플을 찾을 수 100 µ m에 어디에서 든 지 5 단계 크기를 조정 하려면 플레이트 수집 및 제어 대화 상자를 사용 합니다.</li>
	<li>W1 DAPI 탭에서 자동 노출클릭 합니다. 플레이트 수집 스냅-DAPI 이미지는 선명 하 고 확인 합니다.</li>
	<li>주 메뉴에서 풀-다운을 저널 에 클릭 합니다. 저널... 실행을 선택 합니다.</li>
	<li>그것을 발사 지역 수집 설정 슬라이드 저널에 두 번 누릅니다. 설치 슬라이드 영역 인수 대화 상자가 나타나면 계속을 선택 합니다.</li>
	<li>때, 제대로 된 DAPI 스캔 낮은 배율 슬라이드 이미지를 선택 선택 합니다. 확인키를 누릅니다. 마찬가지로, 강조 플레이트 수집 스냅-DAPI 플레이트 수집 스냅인에 대 한 질문. 확인을 클릭 합니다.</li>
	<li>만들기 또는 부하 영역 상자가 나타나면 DAPI 스캔 (그림 6)의 (a) 지구를 선택 하는 사각형 영역 도구를 사용 합니다. 계속을 누릅니다. 참고: 40 X에서 선택할 수 있는 최대 영역 35 행 45 열입니다. 관심의 여러 영역을 선택 하는 경우 큰 영역 상자 영역 크기가 조정 됩니다. 상자는 크기 위치 될 수 있습니다.</li>
	<li>로드 영역 대화 상자에서 아니요 를 선택 합니다. 참고: 선택 예 부하 이전 슬라이드의 일괄 처리에 대 한 지역으로 저장 관심 위치의 동일한 지역.</li>
	<li>로케이터 도구를 사용 하 여 관심의 가장 큰 영역을 강조 표시 하 고 선택 영역 대화 상자에서 계속 을 누릅니다. 확인 지역 상자가 나타나면 계속을 선택 합니다. 지역 영역 저장 대화 상자가 나타나면 저장 해야 하는지 여부를 결정 합니다.</li>
	<li>사이트 간격, 다음 대화 상자를 사용 하면 Tiled, 오버랩, 또는 10% 중복이미지를 선택할 수 있습니다. 옵션을 선택 하 고 확인을 클릭 합니다. 저자 Tiled선택 했다.</li>
	<li>세 개의 대화 상자는 이제 표시 됩니다. 계속을 눌러 설치 완료 상자를 해산 수 있습니다. 뜨고 40 X에 대 한 수집 사이트 설정 상자 (그림 7A) 지금 그것은 명확 얼마나 많은 열 및 행 (그림 7B) 플레이트 수집 설정 상자에 입력 하는 데 필요한 이후. 뜨고 표시 되는 WellPositions 상자 (그림 ℃) 왼쪽 아래 모서리에는 화상의 동안.</li>
	<li>플레이트 수집 설정 상자의 방문 하 웰 스, 이전에 선택한 관심의 영역으로 우물의 동일한 수 있어야 합니다 (그림 7D)을 강조 했다. 참고: 저자 슬라이드 당 관심의 9 개 지역 중 최대이 프로토콜을 개발. 더 많은 경우, 단순히 열 또는 관심 영역 수를 반영 하기 위해 플레이트-SlideScanning 탭 행의 수를 늘립니다. 이러한 웰 스 공간 어떤 식으로든에서 관심 영역의 위치를 대표 하지 않는다 하지만 적절 한 번호 강조 (왼쪽) 해야 합니다.</li>
	<li>플레이트 수집 설정 상자에서 방문 하는 사이트 탭 이동 제안된 열과 행 (그림 7B)을 입력 합니다. 타일 사이트클릭 하 여 기억 하십시오.</li>
	<li>샘플을 포함 하는 사이트를 찾는의 추측을 제거 하려면 미리 선택 된 관심 영역에서 무대를 요약 탭 아래 취득 접시 를 누릅니다. 일단 카메라는 셀을 포함 하는 사이트를 통해 팬, 누르십시오 취소 이미지 수집을 중지 하려면 오른쪽 하단 모서리에서. 무대는 이제 확인 샘플에 위치 하 고 있습니다.</li>
	<li>초점과 높은 동적 범위 이미지 획득은 파장 설정을 최적화 합니다. 만족, 요약 탭 및 취득 접시에서 클릭 합니다.</li>
</ol>7. 이미지 분석
<ol><li>원하는 사용자 지정 모듈을 선택 합니다. 참고: 저자는 뇌 종양 슬라이드의 자동된 분할을 보여 주기 위해 다중 파장 셀 득점 모듈을 선택 했다.</li>
	<li>모든 사이트에서 분석을 실행 합니다. 분석 매개 변수가 많은 슬라이드 같은 경우, 분석 게시물 수집 탭 플레이트 수집 설정 상자에 포함할 수 있습니다.</li>
	<li>분석 완료 되 면 결과 편견을 하지 가난한 이미지 품질의 사이트를 제외 합니다. 이 분석의 목표 microglia 및 세포 종양 실질에 계량 하기 때문에, 종양 샘플의 가장자리에서 관심 영역을 선택 합니다. 또한, 초점 및/또는 조직 주름 또는 거품과 조직에서 눈물을 포함 하는 사이트를 제외 합니다. 데모를 위해 대표 결과참조 하십시오. 또는, 어떤 사이트는 제외 임계값 아래 레이저 반사의 진폭에 따라 각 사이트에 대해 생성 된 레이저 초점 점수 를 사용 하 여 (임계값은 사용자 정의 및 노출 시간 등에 따라와 사용 되는 매체 형식)입니다. 참고: 높은 확대 이미지 가능 하 게 특별히 필요한 경우 구조, 큰 혈관의 괴 사, 지역 등을 제외 하. 그것은 또한 hypercellular는 하는 관심 영역만 포함 하도록 가능입니다. 이러한 방법으로, 특이성 및 분석의 정확성 증가 수 있습니다.</li>
</ol>

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<li>Zock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+high+content+screening+in+life+science+research%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+%26+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Applications of high content screening in life science research.</a> Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (9), 870-876 (2009).</li>
</ol>

저자가이 원고에 설명 된 제품에 아무런 재정적 이익을 있고 아무것도 공개.

생물 과학 연구의 효율성을 방해한 일반적인 문제 아직도 붙일 표시 된 조직의 정확, 공평 하 고 정확한 정량화 및 그들의 구조에 대 한 프로토콜의 개발 이다. 상당한 양의 시간과 노력을 그들은 몇 군데 있다 일단 조직 슬라이드를 분석 하는 방법을 찾는 쪽으로 이동 합니다. 많은 기존의 방법 프로그램12,13,14에서 다시 사용자에 대 한 알고리즘을 제공 합니다. 이러한 메서드는 수락 가능 하다, 하지만이 보고서의 의미는 그것 쉽고 빠르게 설정 하는 전체적인 이미지 수집 및 분석 프로토콜 사용자가는 WHCAS에 액세스 하는 경우 사용자 수 있습니다. 종류를 구분 하 고 여러 구조와 프로세스, 세포 주기 분석, 및 핵 전 좌, 계량 분석 예를 들어 이미 관련된 소프트웨어에서 사용할 수 있습니다.
설치 몇 가지 중요 한 단계를 포함 한다. 첫째, 접시에 마치 슬라이드의 공간 매개 변수 정의 됩니다. 둘째, 낮은 배율 개요 검사는 관심 영역 높은 확대 이미징 선택으로 만들어집니다. 마지막으로, 정확도 및 후속 분석의 정밀도 영향을 주는 사이트는 제외 됩니다. 이 기술의 가장 큰 한계는 그것의 적용에 따라는 사용자가는 WHCAS에 액세스할 경우 이다. 그러나, 하이 콘텐츠 분석 시스템을 위한 증가 필요와 많은 기관 제공 하는 이러한 경쟁15에 남아 그들의 연구원에 게. 문제 해결은 가장 일반적으로 때 필요 조직 단면도 동일한 두께 필요가 없습니다. 다른 사람 하지 것입니다 동안 관심의 여러 영역을 선택 하는 경우 일부 초점에 있을 것입니다. 이상적으로, 단면, 하는 동안 사용자 다룰 것입니다 균질 견본을 만드는. 그러나, 샘플 일치 하지 않는 경우 집중 하는 데 사용 되는 핵 얼룩 파장 (또는 사용자의 밝은 fluorophore)에 초점을 맞추고 수 수 재조정 관심 각 밖의 초점 영역에 대 한 및 보기의 각 필드에 대 한도. 로 다른 파장은 단순히 핵 얼룩 파장에서 오프셋만이 파장 재조정을 해야 합니다.
이 보고서에서 우리는 검사 하 고 WHCAS 및 관련된 소프트웨어를 사용 하 여 슬라이드를 분석 하는 방법을 선발. 다중 파장 셀 득점 모듈을 사용 하면 어떤 핵 또는 세포질 마커를 붙일 레이블이 자동으로 계산 수 있습니다. 초점 설정을 조정 하 고 너비와 몇 군데 조직에 모듈을 사용자 지정 하는 지역 등 세포 특성 정의 후 더 이상 이미지 슬라이드와 양적 데이터를 사용자의 개입에 대 한 필요는. 최대 3 개의 슬라이드를 한 번에 몇 군데 수 있다 하 고 관심의 여러 영역을 정의할 수 있습니다. WHCAS 사용자가 슬라이드를 분석 하는 데 필요한 활용 사용자 정의 다목적,이 프로토콜 사용 하면 자동 워크플로 좀 더 최적화를 요구 하 고 미래에 조직의 조직학 분석을 포함 하는 모든 프로젝트에 적용할 수 있습니다.

슬라이드에 붙일 레이블 조직의 정확 하 고 정밀한 정량 많은 과학 분야에서 매우 인기 있는 기술입니다. 그러나, 연구원은 자주 수동으로 계산 표본 또는이 비 자동화 된 기법을 개발 하는 시간의 상당한 금액을 지출. 여기, 우리는 자동된 슬라이드 스캔 및 예를 들어 냉동된 인간 두뇌 종양 섹션에 타고 난 면역 세포는 WHCAS 및 그 관련된 소프트웨어를 사용 하 여 셀의 정량에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 셀 유형1,2,3,,45, 의 세 neurite 결과에서 기본 제공 사용자 정의 모듈의 넓은 범위를 제공 하는 관련된 소프트웨어 6.이 방법의 목표의 이미지와 슬라이드 마운트 어떤 조직에 놓여있는지 표시 된 엔터티를 quantitate 시작 완료, 쉽게 재현할 수 프로토콜 연구를 제공 하는.
이 프로토콜에는 WHCAS 주로 슬라이드 어댑터와 기본 슬라이드 스캔7 에 사용할 수 있었던 비록 후속 분석 관련된 소프트웨어에 대 한 번호판을 이미징 사용 됩니다. 그것은 수집 지역, 해당 저널의 선택, 맞춤형된 로드의 창조와 제품 담당자와 연락의 주의 공간 교정 필요 했다 때문에 이미지 슬라이드를 금지 했다. 문학, 전용된 슬라이드 이미징 및 분석 기구8, 구입 하는 대신 넓은 본문에이 소프트웨어에 액세스할 수 있는 이전 기술 보고서 WHCAS 전부9슬라이드 이미지 수집을 피할. 이미지 수집 또는 이미지 분석을 수행 하는 다른 플랫폼에서 각각 다른와 호환은 보장 하기 위해 추가 작업을 필요로 합니다.
이미지 캡처는 WHCAS 및 그것의 소프트웨어를 사용 하는 기능에 대 한 검색 또는 이러한 도구를 워크플로 외국인 개발의 불필요 한 합병증을 피할 것 이다. 이 문서에서는, 접시,으로 슬라이드 하 여 낮은 확대 개요 검사 및 해당 고배율 이미지를 만드는 데 필요한 단계 및 다중 파장 셀 득점 세그먼트 모듈을 사용 하 여 후속 분석을 허용 합니다 WHCAS의 재사용. 이 쉽게 사용할 수 프로토콜 알고리즘 또는 다단계 세 프로토콜10,11 을 개발 하는 일단 이미지는 WHCAS에 인수는 필요가 없기 때문에 다른 기술에 비해 우위를 제공 합니다. 이 프로토콜 정량 기법을 최적화 하는 데 필요한 시간을 줄입니다, 더 정확 하 게12 와 수동 계산 보다 효율적인는 WHCAS의 사용을 극대화. 이 프로토콜 사용할 수 있습니다 광범위 하 고 쉽게 영상 및 슬라이드에 어떤 붙일 라는 조직의 분석 수 있습니다 이후.

<table><tbody><tr><td>ImageXpress MicroXLS</td><td>Molecular Devices</td><td>이미지</td><td>획득을 위한 NA 장치</td></tr><tr><td>MetaXpress 5.1</td><td>Molecular Devices</td><td>NA</td><td>ImageXpress MicroXL용 관련 소프트웨어(Windows 운영 체제가 설치된 PC에서 실행).</td></tr><tr><td>슬라이드 어댑터</td><td>Molecular Devices</td><td>NA</td><td>ImageXpress MicroXL</td></tr><tr><td>Slide_Region_Acquisition_revA.jzp</td><td>Molecular Devices</td><td>NA</td><td>저널은 metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide 또는 Molecular Devices 담당자에게 연락하여 얻을 수 있습니다</td></tr><tr><td>Slide_Region_Acquisition _Setup.JNL</td><td>Molecular 장치</td><td>NA</td>: <td>단계 6.6에서 이 저널을 선택합니다.</td></tr></tbody></table>

자동된 슬라이드 스캔 및 widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템을 사용 하 여 붙일 표시 된 조직에서 시장 세분화

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

슬라이드 검색 자동화 되 고 붙일 라는 조직의 세분화는 전체 슬라이드 또는 큰 조직 단면도 분석 하는 가장 효율적인 방법. 불행히도, 많은 연구원은 다량 시간 및 자원을 개발 하 고 그들의 자신의 실험 관련만 되는 워크플로 최적화의 지출. 이 문서에서 우리는 widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템 (WHCAS)에 대 한 액세스와 함께 그 어떤 슬라이드 마운트 조직, 관련된 소프트웨어에 미리 모듈 내에서 사용자 지정에 대 한 옵션으로 이미지를 사용할 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 원래 슬라이드 스캔을 위한,이 문서에 자세히 설명 하는 단계 슬라이드 관련된 소프트웨어로 가져올 수 있는 WHCAS에서 이미지 스캔을 취득 가능 합니다. 이 예제에서는 뇌 종양 슬라이드의 자동된 분할 설명 된다, 그러나 마커의 모든 붙일 표시 된 핵 또는 세포질 자동된 분할 가능 하다. 또한, 단백질 지역화/전, 세포질 확산/생존/apoptosis, 및 실행할 수 있는 신생에 대 한 분석을 포함 한 다른 양적 소프트웨어 모듈의 다양 한이 있다. 이 기술은 연구원은 시간 및 노력을 저장 하 고 슬라이드 분석을 위한 자동화 프로토콜을 만듭니다.

WHCAS 소프트웨어 내에서 이미지를 볼 수 있습니다. 그림 8 의 정의 된 영역 내에서 모든 사이트의 높은 확대 축소판을 보여줍니다. (예제 표시 됩니다 그림 8 및 그림 9에서 낮은 확대율에서 각각) 분석에서 제외 해야 하는 것 들을 식별 하기 위해 각 사이트를 검토 합니다. 예를 들어 사이트 149 초점 (그림 9A), 사이트 219는 거품 (그림 9B) 이며 사이트 54 배 (그림 9C)를 포함 하 고 제외 해야 합니다. 이미지가 포함 된 모든 사이트의 10-15%를 제외 일반적입니다. 제공 된 예제에서 사이트의 15.3% 제외 (25/300 거품, 17/300 초점 있었다, 3/300은 접혀 있었고 1/300 가장자리에). 그림 10A는 대표 이미지 분석 (해당 낮은 확대 축소판 그림 8에 표시 됩니다)에 대 한 선택. 여기, 다중 파장 셀 득점 모듈에 의해 생성 된 해당 오버레이 사이트 59, 작성자의 사양에 맞게 사용자 지정에서 수행 하는 자동화 된 세분화의 결과 보여 줍니다 (핵 최소 폭 2.5 µ m, 최대 너비 = = 7.5 µ m, 그리고 로컬 배경 위의 강도 = 35 graylevels; CD11b-긍정적인 세포의 최소 폭 4 µ m, 최대 너비 = = 18 µ m, 최소 스테인드 영역 15 µ m2와 지역 배경 위의 강도 = = 310 graylevels; CD45-긍정적인 세포의 최소 폭 4 µ m, 최대 너비 = = 18 µ m, 최소 스테인드 영역 15 µ m2<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig1.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig1large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig2.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig3.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig3large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig4.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig4large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig5.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig5large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig6.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig6large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig7.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig7large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig8.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig8large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig9.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig9large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig10.jpg"> <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig10large.jpg" target="_blank"></a>

여기 우리는 widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템 (WHCAS)를 사용 하 여 슬라이드에 붙일 레이블된 조직의 자동화 된 세그먼트에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 생물 과학, 의료 공학, 건강 과학 등 생물 조직에서 형광 표식의 정량과 관련 된 모든 분야에서 광범위 한 응용 프로그램 있다.

자동된 슬라이드 스캔 및 Widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템을 사용 하 여 붙일 표시 된 조직에서 시장 세분화

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

이 이미징 및 분석 방법의 전반적인 목표는 형광 표지된 슬라이드 장착 조직 샘플의 자동 분할을 위한 설정하기 쉬운 워크플로우를 생성하는 것입니다. 이 방법은 관심 있는 조직 샘플의 특정 영역 내에서 주어진 단백질이 얼마나 많이 발견되는지에 대한 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 자동 분할을 위한 시간 최적화 프로토콜을 절약할 수 있어 이 방법을 후속 형광 표지된 슬라이드 장착 조직 샘플에 적용할 수 있다는 것입니다.이 방법에 대한 아이디어는 뇌 조직의 새로운 세포를 고배율로 정량화해야 할 때 처음 떠올랐습니다. 저널을 가져온 후 Plate Acquisition Setup 대화 상자를 열고 Objective and Camera 탭을 엽니다. 배율을 4배로, 카메라 비닝을 1로, 게인을 2로 설정합니다.Plate Slide Scanning 탭을 열고 적절한 실험 설정을 입력합니다. Sites to Visit(방문할 사이트) 탭에서 웰을 현장과 균일하게 채우고 Edit Plate Bottom Settings(플레이트 바닥 설정 편집) 탭을 열어 적절한 실험 값을 입력합니다. 이러한 설정을 설정 A로 저장한 후 목표 및 카메라 탭을 열고 배율을 40배, 카메라 비닝을 1로, 게인을 2로 설정합니다.Plate Slide Scanning(플레이트 슬라이드 스캔) 및 Edit Plate Bottom Settings(플레이트 하단 설정) 탭 아래의 모든 설정이 Setting A(설정 A)에 입력한 것과 동일한지 확인하고 Acquisition Loop(획득 루프) 탭을 엽니다. 샘플에 존재하는 파장 수를 입력하고 Enable laser-based focusing(레이저 기반 초점 사용) 및 Enable image-based focusing(이미지 기반 초점 사용) 옵션을 선택합니다. 그런 다음 이 설정을 설정 B로 저장합니다.그런 다음 최대 3개의 슬라이드를 배치하고 노치 측면의 레이블이 아래를 향하도록 슬라이드 어댑터에 덮개를 덮습니다.그리고 F4 키를 눌러 메인 메뉴를 엽니다. Slide Scanning(슬라이드 스캔)을 선택하고 Open Door Eject Slide(도어 꺼내기 슬라이드)를 클릭하여 슬라이드 어댑터를 광시야 고함량 분석 시스템에 삽입합니다. 그런 다음 Close Door Load Slide를 클릭합니다.시작하려면 적절한 파장이 선택되었는지 확인하십시오. 관심 영역을 찾을 때까지 라이브 피처 이미지 내의 다른 사이트로 이동합니다. 지역에 집중합니다.초점이 맞지 않으면 자동 초점 버튼을 사용하거나 초점이 맞춰질 때까지 단계 크기를 조정합니다. 스냅을 사용하여 이미지를 캡처하고, 단계 크기를 변경하여 초점을 수동으로 조정하는 경우 이미지를 캡처합니다. 이전 스캔을 설정하려면 먼저 설정 A를 로드하고 슬라이드 미리보기를 선택합니다.슬라이드 수를 표시하고 확인을 선택합니다. 배율로 4배를 선택합니다. 그런 다음 Coverslip down을 선택하고 이전 스캔에 대한 기본 설정을 계속 선택합니다. Cancel을 선택하기 전에 Acquisition setting(획득 설정)과 Calibrations(보정)가 모두 선택되어 있는지 확인하고 Continue(계속)를 누릅니다.W1:DAPI 탭에서 Live를 클릭한 다음 Auto Expose를 클릭한 다음 Snap을 클릭합니다. 그런 다음 닫기를 누릅니다. 디렉토리를 선택하고 이전 스캔 이름을 입력합니다.그리기 영역(Draw Region) 대화 상자가 자동으로 나타납니다. 사각형 영역 도구를 사용하여 이전 스캔 영역 전체를 선택하고 계속을 클릭합니다. 이전 스캔이 끝나면 설정 B를 로드하고 방문할 사이트 탭을 엽니다.시작하려면 적절한 파장이 선택되었는지 확인하십시오. 관심 영역을 찾을 때까지 라이브 피처 이미지 내의 다른 사이트로 이동합니다. 지역에 집중합니다.초점이 맞지 않으면 자동 초점 버튼을 사용하거나 초점이 맞춰질 때까지 단계 크기를 조정합니다. 스냅을 사용하여 이미지를 캡처하고, 단계 크기를 변경하여 초점을 수동으로 조정하는 경우 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 W1 DAPI 탭에서 자동 노출을 클릭하고 Plate Acquisitions Snap DAPI 이미지가 선명한지 확인합니다.주 메뉴에서 Journal(저널)을 클릭하고 풀다운 메뉴에서 Run Journal(저널 실행)을 선택합니다. Slide Region Acquisition Setup Journal을 두 번 클릭하여 시작하고 Setup Slide Region Acquisition 대화 상자가 나타나면 Continue를 클릭합니다. 지시가 있으면 DAPI 스캔을 선택하여 저배율 슬라이드 이미지를 선택하고 확인을 클릭합니다. Plate Acquisition Snap을 묻는 메시지가 표시되면 Plate Acquisition Snap-DAPI를 강조 표시하고 OK(확인)를 클릭합니다. Create or Load Regions(영역 생성 또는 로드) 상자가 나타나면 Rectangular Region(사각형 영역) 도구를 사용하여 DAPI 스캔에서 관심 영역을 선택하고 Continue(계속)를 클릭합니다.로케이터 도구를 사용하여 관심 영역을 강조 표시하고 Select Region(지역 선택) 대화 상자에서 Continue(계속)를 클릭합니다. Confirm regions(지역 확인) 상자가 나타나면 Continue(계속)를 클릭하고 Save Regions(영역 저장) 대화 상자가 나타날 때 영역을 저장해야 하는지 여부를 결정합니다. 세 개의 대화 상자가 나타납니다.계속을 클릭하여 설정 완료 상자를 닫습니다. 샘플 사이트에서 추측을 찾지 않으려면 Display Settings 탭에서 Display images during acquisition이 선택되어 있는지 확인하고 Summary 탭을 열어 Acquire Plate를 클릭하여 미리 선택된 관심 영역의 스테이지를 배치합니다. 카메라가 관심 있는 셀이 포함된 사이트 위로 이동할 때 취소를 클릭하여 이미지 획득을 중지합니다.이미지의 초점이 맞지 않아도 놀라지 마십시오. 이 단계는 선택한 관심 영역에 첫 번째 사이트의 스테이지를 배치하는 데만 사용됩니다. 스테이지가 샘플 위에 있고 사이트 수를 올바르게 입력했는지 확인합니다.파장 설정을 최적화하여 HDR(High Dynamic Range)에서 초점이 맞춰진 이미지를 얻을 수 있습니다. 그런 다음 Summary(요약) 탭을 다시 열고 Acquire Plate(플레이트 획득)를 클릭합니다. 분석이 끝나면 디스플레이 탭을 선택합니다.Image Overlay(이미지 오버레이) 풀다운 메뉴에서 Show well information(웰 정보 표시)을 선택하여 왼쪽 상단 모서리에 사이트 번호를 표시합니다. 사이트를 스크롤하여 초점이 맞지 않거나 조직에 조직 주름 또는 기포 및 찢어짐이 포함된 사이트를 제외합니다. 이 대표 이미지에서는 정의된 관심 영역 내의 모든 사이트에 대한 고배율 썸네일이 표시됩니다.분석에서 제외해야 하는 사이트를 식별하기 위해 각 사이트를 검토해야 합니다. 예를 들어, 이 실험에서, 제149기지는 초점이 맞지 않았고, 제219기지에는 거품이 있었으며, 제54기지에는 접힌 부분이 있었다. 이 세 곳 모두 분석에서 제외되었습니다.여기서, 다중-파장 세포 스코어링 모듈에 의해 생성된 해당 오버레이는 실험 사양에 따라 맞춤화된 바와 같이 사이트 59에서 수행된 자동화된 분할의 결과를 보여줍니다. 세분화 후, 각 마커, 두 마커, 마커 없음, 평균 염색 면적 및 평균 형광 강도에 대해 양성으로 염색된 세포의 비율에 대한 정량적 데이터를 얻을 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 슬라이드 장착형 조직 샘플의 이미징 및 세분화를 위한 자동화된 워크플로우를 생성하기 위해 광시야 고함량 분석 시스템을 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

여기 수량 immunofluorescence, 이미지 분석, 이질의 통계 측정을 사용하여 종양이 자료 histological 섹션에 분자 이질을 계량하는 방법을 설명합니다. 방법은 임상 biomarker 개발 및 분석에 사용하기위한 것입니다.

양적 Immunofluorescence를 사용하여 종양의 단백질 표현의 이질 매핑

형광 표지 된 세포의 다중 이미지 기반 분석을 가능하게하는 유연한 정보학 워크 플로우입니다 발표. 워크 플로는 핵 및 세포질 마커를 정량화하고 이러한 구획 사이에 마커 전위를 계산한다. 절차 96- 웰 포맷으로 간접 면역 형광에 의해 마커 검출 용 siRNA를 안정적인 방법을 사용하여 세포의 섭동 제공된다.

높은 콘텐츠, 오픈 소스 소프트웨어에 의해 지원되는 범용 현미경 데이터에서 형광 마커, 개별 셀 정량화를위한​​ 워크 플로우

우리는 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 기초 판독하여 단백질 상호 작용을 분석 자동화 형광 수명 이미징 (FLIM)을 이용하는 오픈 소스 고 함량 분석 (HCA) 기기를 제시한다. 이 openFLIM-HCA 기기에 대한 데이터 수집은 소프트웨어 μManager 작성 및 데이터 분석 FLIMfit에 착수에 의해 제어된다.

자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석

종양 microenvironment 공부 immunotherapy 임상 응답의 전조 또는 예측 생체를 식별할 수 있습니다. 여기에 제시, 혁신적인 방법을 기반으로 현장에서 형광 multispectral 이미징 분석 하 고 CD8의 자동으로 다양 한 부분 모집단을 계산+ T 세포. 이 재현 하 고 신뢰할 수 있는 기술은 대형 코 호트 분석에 적합 합니다.

면역 형광 분석 및 Intratumoral+ PD-1 팀-3+ CD8의 정량화를 다중화+ T 세포

여기 우리는 다중 형광 immunohistochemical 얼룩 및 여러 암 관련 항 림프 종에서의 동시 지역화에 대 한 이미징에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 모든 조직 섹션에서 생체의 colocalization 분석을 확장할 수 있습니다.

멀티플렉스 형광 Immunohistochemical 얼룩, 이미징, 및 림프 종 조직학 샘플 분석

우리는 냉동 된 조직에 다중 스펙트럼 이미징을 수행하는 빠른 염색 방법을 설명합니다.

냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법

우리는 비브라톰과 아가로스 포매된 폐 조직을 활용하여 폐 절편을 생성하는 조직 처리 기술을 개발하여 폐 구조의 고해상도 이미지를 획득할 수 있습니다. 특정 폐 구조 마커를 사용하여 공간 단백질 발현을 관찰하기 위해 면역형광 염색을 사용했습니다.

다중 형광 이미징을 위한 Agarose-Embedded 폐 조직의 자동 진동 절편

본 프로토콜은 (SWITCH - H 2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT 조직 형질 전환 기법과 광시트 형광 현미경 이미징을 일상적으로 높은 처리량 프로토콜로 결합하여 수십 개의 사후 인간 뇌 절편의 신속하고 동시적인 광학 투명화, 다중 라운드 라벨링 및 3D 체적 재구성을 위한 단계별 절차를 제공합니다.

Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging(대규모 인간 뇌 영상에서 광시트 형광 현미경을 위한 광학 투명화 및 라벨링)

다중 순환 면역조직화학은 반복적인 항원-항체 배양, 이미지 스캐닝, 이미지 정렬 및 통합을 사용하여 여러 마커를 동시에 현장에서 검출할 수 있습니다. 여기에서는 폐암과 쌍을 이루는 뇌 전이 샘플에서 이 기술로 면역 세포 기질을 식별하기 위한 운영 프로토콜을 제시합니다.

Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry(다중 순환 형광 면역조직화학)

IBEX(Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity)는 헤파린 차단을 추가하여 비특이적 결합을 최소화하고 스펙트럼 검출과 전산 혼합 해제를 활용하여 자가형광을 억제함으로써 기본 IBEX 기술을 기반으로 합니다. 이 접근 방식은 배경 소스를 줄이면서 이미지 획득을 가속화하여 강력한 다라운드, 고파라미터 공간 단백질체 분석을 가능하게 합니다.

비특이적 조직 형광을 최소화하기 위해 스펙트럼 공초점 현미경을 사용한 하이플렉스 이미징

다중화 면역형광은 단일 조직 절편 내에서 여러 항체 표지자를 순차적으로 표지하여 조직 구조와 세포 집단의 공간 분석을 지원합니다. 여기서는 노화 관련 마커, 구조적, 면역 마커의 다중성 검출 워크플로우를 제시하는데, 여기에는 수동 및 자동 슬라이드 준비, 반복 영상, 디지털 병리 소프트웨어를 이용한 단일 세포 분석이 포함됩니다.

생체 내 노화 마커의 공간 평가를 위한 다중화 면역형광 분석법

배우세요 와이드필드 하이 콘텐츠 분석 시스템을 사용하여 형광 표시된 조직의 자동 분할을 수행하는 방법을. 이 프로토콜은 생물학적 과학 및 의료 공학 연구에서 단백질 정량화의 정확성과 효율성을 크게 향상시킵니다.

자동된 슬라이드 스캔 및 Widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템을 사용 하 여 붙일 표시 된 조직에서 시장 세분화

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