자동된 슬라이드 스캔 및 Widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템을 사용 하 여 붙일 표시 된 조직에서 시장 세분화

이 이미징 및 분석 방법의 전반적인 목표는 형광 표지된 슬라이드 장착 조직 샘플의 자동 분할을 위한 설정하기 쉬운 워크플로우를 생성하는 것입니다. 이 방법은 관심 있는 조직 샘플의 특정 영역 내에서 주어진 단백질이 얼마나 많이 발견되는지에 대한 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 자동 분할을 위한 시간 최적화 프로토콜을 절약할 수 있어 이 방법을 후속 형광 표지된 슬라이드 장착 조직 샘플에 적용할 수 있다는 것입니다.

이 방법에 대한 아이디어는 뇌 조직의 새로운 세포를 고배율로 정량화해야 할 때 처음 떠올랐습니다. 저널을 가져온 후 Plate Acquisition Setup 대화 상자를 열고 Objective and Camera 탭을 엽니다. 배율을 4배로, 카메라 비닝을 1로, 게인을 2로 설정합니다.

Plate Slide Scanning 탭을 열고 적절한 실험 설정을 입력합니다. Sites to Visit(방문할 사이트) 탭에서 웰을 현장과 균일하게 채우고 Edit Plate Bottom Settings(플레이트 바닥 설정 편집) 탭을 열어 적절한 실험 값을 입력합니다. 이러한 설정을 설정 A로 저장한 후 목표 및 카메라 탭을 열고 배율을 40배, 카메라 비닝을 1로, 게인을 2로 설정합니다.

Plate Slide Scanning(플레이트 슬라이드 스캔) 및 Edit Plate Bottom Settings(플레이트 하단 설정) 탭 아래의 모든 설정이 Setting A(설정 A)에 입력한 것과 동일한지 확인하고 Acquisition Loop(획득 루프) 탭을 엽니다. 샘플에 존재하는 파장 수를 입력하고 Enable laser-based focusing(레이저 기반 초점 사용) 및 Enable image-based focusing(이미지 기반 초점 사용) 옵션을 선택합니다. 그런 다음 이 설정을 설정 B로 저장합니다.그런 다음 최대 3개의 슬라이드를 배치하고 노치 측면의 레이블이 아래를 향하도록 슬라이드 어댑터에 덮개를 덮습니다.

그리고 F4 키를 눌러 메인 메뉴를 엽니다. Slide Scanning(슬라이드 스캔)을 선택하고 Open Door Eject Slide(도어 꺼내기 슬라이드)를 클릭하여 슬라이드 어댑터를 광시야 고함량 분석 시스템에 삽입합니다. 그런 다음 Close Door Load Slide를 클릭합니다.

시작하려면 적절한 파장이 선택되었는지 확인하십시오. 관심 영역을 찾을 때까지 라이브 피처 이미지 내의 다른 사이트로 이동합니다. 지역에 집중합니다.

초점이 맞지 않으면 자동 초점 버튼을 사용하거나 초점이 맞춰질 때까지 단계 크기를 조정합니다. 스냅을 사용하여 이미지를 캡처하고, 단계 크기를 변경하여 초점을 수동으로 조정하는 경우 이미지를 캡처합니다. 이전 스캔을 설정하려면 먼저 설정 A를 로드하고 슬라이드 미리보기를 선택합니다.

슬라이드 수를 표시하고 확인을 선택합니다. 배율로 4배를 선택합니다. 그런 다음 Coverslip down을 선택하고 이전 스캔에 대한 기본 설정을 계속 선택합니다. Cancel을 선택하기 전에 Acquisition setting(획득 설정)과 Calibrations(보정)가 모두 선택되어 있는지 확인하고 Continue(계속)를 누릅니다.

W1:DAPI 탭에서 Live를 클릭한 다음 Auto Expose를 클릭한 다음 Snap을 클릭합니다. 그런 다음 닫기를 누릅니다. 디렉토리를 선택하고 이전 스캔 이름을 입력합니다.

그리기 영역(Draw Region) 대화 상자가 자동으로 나타납니다. 사각형 영역 도구를 사용하여 이전 스캔 영역 전체를 선택하고 계속을 클릭합니다. 이전 스캔이 끝나면 설정 B를 로드하고 방문할 사이트 탭을 엽니다.

시작하려면 적절한 파장이 선택되었는지 확인하십시오. 관심 영역을 찾을 때까지 라이브 피처 이미지 내의 다른 사이트로 이동합니다. 지역에 집중합니다.

초점이 맞지 않으면 자동 초점 버튼을 사용하거나 초점이 맞춰질 때까지 단계 크기를 조정합니다. 스냅을 사용하여 이미지를 캡처하고, 단계 크기를 변경하여 초점을 수동으로 조정하는 경우 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 W1 DAPI 탭에서 자동 노출을 클릭하고 Plate Acquisitions Snap DAPI 이미지가 선명한지 확인합니다.

주 메뉴에서 Journal(저널)을 클릭하고 풀다운 메뉴에서 Run Journal(저널 실행)을 선택합니다. Slide Region Acquisition Setup Journal을 두 번 클릭하여 시작하고 Setup Slide Region Acquisition 대화 상자가 나타나면 Continue를 클릭합니다. 지시가 있으면 DAPI 스캔을 선택하여 저배율 슬라이드 이미지를 선택하고 확인을 클릭합니다. Plate Acquisition Snap을 묻는 메시지가 표시되면 Plate Acquisition Snap-DAPI를 강조 표시하고 OK(확인)를 클릭합니다. Create or Load Regions(영역 생성 또는 로드) 상자가 나타나면 Rectangular Region(사각형 영역) 도구를 사용하여 DAPI 스캔에서 관심 영역을 선택하고 Continue(계속)를 클릭합니다.

로케이터 도구를 사용하여 관심 영역을 강조 표시하고 Select Region(지역 선택) 대화 상자에서 Continue(계속)를 클릭합니다. Confirm regions(지역 확인) 상자가 나타나면 Continue(계속)를 클릭하고 Save Regions(영역 저장) 대화 상자가 나타날 때 영역을 저장해야 하는지 여부를 결정합니다. 세 개의 대화 상자가 나타납니다.

계속을 클릭하여 설정 완료 상자를 닫습니다. 샘플 사이트에서 추측을 찾지 않으려면 Display Settings 탭에서 Display images during acquisition이 선택되어 있는지 확인하고 Summary 탭을 열어 Acquire Plate를 클릭하여 미리 선택된 관심 영역의 스테이지를 배치합니다. 카메라가 관심 있는 셀이 포함된 사이트 위로 이동할 때 취소를 클릭하여 이미지 획득을 중지합니다.

이미지의 초점이 맞지 않아도 놀라지 마십시오. 이 단계는 선택한 관심 영역에 첫 번째 사이트의 스테이지를 배치하는 데만 사용됩니다. 스테이지가 샘플 위에 있고 사이트 수를 올바르게 입력했는지 확인합니다.

파장 설정을 최적화하여 HDR(High Dynamic Range)에서 초점이 맞춰진 이미지를 얻을 수 있습니다. 그런 다음 Summary(요약) 탭을 다시 열고 Acquire Plate(플레이트 획득)를 클릭합니다. 분석이 끝나면 디스플레이 탭을 선택합니다.

Image Overlay(이미지 오버레이) 풀다운 메뉴에서 Show well information(웰 정보 표시)을 선택하여 왼쪽 상단 모서리에 사이트 번호를 표시합니다. 사이트를 스크롤하여 초점이 맞지 않거나 조직에 조직 주름 또는 기포 및 찢어짐이 포함된 사이트를 제외합니다. 이 대표 이미지에서는 정의된 관심 영역 내의 모든 사이트에 대한 고배율 썸네일이 표시됩니다.

분석에서 제외해야 하는 사이트를 식별하기 위해 각 사이트를 검토해야 합니다. 예를 들어, 이 실험에서, 제149기지는 초점이 맞지 않았고, 제219기지에는 거품이 있었으며, 제54기지에는 접힌 부분이 있었다. 이 세 곳 모두 분석에서 제외되었습니다.

여기서, 다중-파장 세포 스코어링 모듈에 의해 생성된 해당 오버레이는 실험 사양에 따라 맞춤화된 바와 같이 사이트 59에서 수행된 자동화된 분할의 결과를 보여줍니다. 세분화 후, 각 마커, 두 마커, 마커 없음, 평균 염색 면적 및 평균 형광 강도에 대해 양성으로 염색된 세포의 비율에 대한 정량적 데이터를 얻을 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 슬라이드 장착형 조직 샘플의 이미징 및 세분화를 위한 자동화된 워크플로우를 생성하기 위해 광시야 고함량 분석 시스템을 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.