Name: 탐지 기술 현장에서 혁신적인 RNA에 의해 설치류 핵 Accumbens에서 도파민 D1-알파 수용 체의 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 배우세요 새로운 RNA 현장 하이브리드화 기법을 사용하여 설치류 핵 어컴벤스에서 도파민 D1-알파 수용체의 mRNA 분포를 시각화하는 방법을. 이 기법은 중추신경계 질환 관련 도파민 기능 이상을 연구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

현재 작품은 HD043680, MH106392, DA013137, 및 NS100624 건강 (NIH)의 국가 학회에 의해 지원 되었다. 부분 기금 NIH T32 훈련 그랜트 생물 행동 과학에 의해 제공 되었다.

실험 프로토콜 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 사우스 캐롤라이나 대학에 의해 승인 되었다 (연방 보증 번호: A3049-01).
1입니다. 신선한 냉동된 뇌 섹션의 준비
<ol><li>F344/N 쥐 긴장을 사용 하 여: 각 성의 3 쥐 13 개월, 몸 무게 약 320 g.</li>
	<li>5% (sevoflurane의 과다) sevoflurane 농도 조정 합니다. 추가 분에 대 한 중지를 호흡 후 sevoflurane 노출을 계속 합니다.</li>
	<li>목을 벨 쥐 하 고 두뇌를 제거 합니다.</li>
	<li>15 액체 질소에 쥐 뇌 잠수함 s 조직 수확의 5 분 이내.</li>
	<li>-20 ° c에서 1 h cryostat 뇌 equilibrate</li>
	<li>30 µ m 섹션을 잘라내어 슬라이드 ( 재료의 표참조)에 전송.</li>
	<li>핵 accumbens 지역 Bregma14앞쪽 2.28 m m 약 2.76 m m에서에서 섹션을 선택 하십시오.</li>
	<li>지속적으로 쥐의 stereotaxic 두뇌 구조에 따라 핵 accumbens 영역을 통해 후 각 전구에서 쥐 뇌를 슬라이스.</li>
	<li>샘플 슬라이드에 탑재 합니다. 건조 10 분 동안-20 ° C에서 섹션을 유지.</li>
	<li>즉시 미리 냉장된 4% paraformaldehyde 1 h 4 ° c.에 대 한 슬라이드를 담가</li>
	<li>실 온 (RT)에서 증가 에탄올 그라데이션에서 슬라이드 배치: 50% EtOH 5 분; 70% EtOH 5 분; 그리고 100% EtOH 5 분.</li>
	<li>신선한 100%와 반복 EtOH.</li>
	<li>흡수 성 종이에 슬라이드를 배치 하 고 건조 한 공기.</li>
	<li>장벽 펜으로 각 섹션 주위 방 벽을 그리기 ( 재료의 표참조). 1 분 동안 완전히 건조 하는 배리어를 하자.</li>
</ol>2입니다. 뇌 섹션의 전처리
<ol><li>오븐에 설정 하 고 설정 온도 40 ° c</li>
	<li>전처리 4 시 약 3 방울 (90 µ L)을 추가 ( 재료의 표참조) 각 뇌 섹션 (슬라이드 당 하나의 섹션)에.</li>
	<li>실시간에서 30 분에 대 한 섹션을 품 어</li>
	<li>신선한 1 x PBS와 실시간 반복에서 1 분 동안 1 x PBS에 슬라이드 잠수함 참고: 슬라이드 1 x PBS 15 분 이상에 체류 하지 해야 합니다.</li>
</ol>3. RNA 제자리에서 교 잡 형광 다중 분석 결과
<ol><li>따뜻한 물 욕조에 40 ° C에서 10 분 동안 대상 조사와 다음 실시간에 멋진</li>
	<li>RNA 시 장소 (예를 들어, 앰프 1-4 층)에서 실시간</li>
	<li>슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>샘플 조각에 Drd1α 프로브 (C1)의 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 2 h 40 ° c.에 대 한 품 어</li>
	<li>워시 버퍼 x 신선한 1 실시간 반복에서 2 분 동안 세척 버퍼 x 1에 슬라이드를 잠수함.</li>
	<li>슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>앰프 1-샘플 조각에 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 40 ° c.에 30 분 동안 품 어</li>
	<li>슬라이드 1 워시 버퍼 실시간 반복에서 2 분에 대 한 신선한 1wash 버퍼와 잠수함</li>
	<li>슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>샘플 조각에 앰프 2 층의 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 40 ° c.에서 15 분 동안 품 어</li>
	<li>워시 버퍼 x 신선한 1 실시간 반복에서 2 분 동안 세척 버퍼 x 1에 슬라이드를 잠수함.</li>
	<li>슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>앰프 3-샘플 조각에 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 40 ° c.에 30 분 동안 품 어</li>
	<li>워시 버퍼 x 신선한 1 실시간 반복에서 2 분 동안 세척 버퍼 x 1에 슬라이드 잠수함</li>
	<li>슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>앰프 4-플로리다-Alt A 샘플 조각에의 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 40 ° c.에서 15 분 동안 품 어</li>
	<li>워시 버퍼 x 신선한 1 실시간 반복에서 2 분 동안 세척 버퍼 x 1에 슬라이드를 잠수함.</li>
	<li>슬라이드에서 과잉 액체를 제거 하 고 즉시 장착 시 약의 2 방울의 장소 ( 테이블의 자료를 참조) 각 섹션에.</li>
	<li>22 m m 22 m m coverslip 장소 ( 테이블의 자료를 참조) 각 뇌 섹션.</li>
	<li>건조까지 2-8 ° C에서 어둠 속에서 슬라이드를 저장 합니다.</li>
	<li>Confocal 현미경 켜고 60 X 목표 전환.</li>
	<li>Confocal 현미경으로 Z-스택 이미지를 얻을. 공초점 이미지의 세부 절차에 대 한 보충 비디오를 참조 하십시오.</li>
	<li>핵 accumbens 영역에서 셀을 표시 하는 Drd1α의 이미지 (여기: 488 nm; 방출: 515/30 nm). 참고: 섹션 인큐베이션 단계 사이 밖으로 건조 하는 두뇌를 게 하지 마십시오.</li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>반 정량적 얼룩 패턴 분석: "개별 점".<ol>
<li>이미지에서 개별 셀을 지정 하려면 DAPI 얼룩 핵 표식으로 수행 합니다. 그러나, 그것은 여전히 핵 세포의 불규칙 한 모양으로 여러 종류의 세포는 뇌 조직의 특정 부분을 분석 어렵다. 여기, 두 경험이 풍부한 연구자 별도로 각 셀 셀 영역을 정의 하는 이미지에서 할당 합니다.</li>
		<li>시각적으로 특정 조건 (그림 1B)를 사용 하 여 셀 당 도트 수에 따라 대표 confocal 이미지 내의 각 셀 점수.</li>
		<li>각 카테고리에 총 셀 수를 결정 하 고 모든 조직 단면도 (그림 2A)와 남성 및 여성에 대 한 각 범주 내에서 세포의 백분율 주파수를 표시 하는 상대 주파수 그래프를 만들 총 셀 수 x100로 나누면 별도로 (그림 2E).</li>
		<li>모든 이전 범주 내에서 셀의 합계를 별도로 셀과 남성과 여성에 대 한 모든 조직 단면도 (그림 2B)에 대 한 누적 횟수를 확인 하려면 총 셀 수 x100 나누어 (그림 2F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>통계적으로 분석 하는 "개별 점" 얼룩 패턴 (선택 사항).<ol>
<li>여 지 없이 변수 (즉, 낮은 셀 식 (1)에서 가장 높은 셀 식 (9) 각 순위 범주에가 셀 수) 자연에 서 수를 제공 하는 셀 당 도트 수 검사 추가 통계 분석에 대 한.</li>
		<li>검사 후 기술 통계의, 세 가지 주요 방법을 사용 하 여: 벽난로-Haenszel 통계, 맨-휘트니 U 테스트 및 Kruskal-월리스 테스트. 비록 정확한 통계 접근에 의존 될 것입니다 관심, 통계 의사 결정 트리 (그림 4)의 실험 설계 및 연구 질문의 분석 방법에 관한 결정에 도움이 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>얼룩 패턴에 대 한 관심 (ROI)의 신호 강도 계량: "클러스터".<ol>
<li>다음 수식을 사용 하 여 각 이미지의 신호 강도 계산. 신호 강도 = 투자 수익 이미지-(평균 배경 강도 × 총 이미지 영역)의 총 강도</li>
		<li>셀 당 대략적인 신호 식 계산 ROI 이미지 내의 셀의 총 수를 계산 합니다. 신호 강도/이미지 셀/이미지의 수에 있는 그룹 차이 신호 식/셀에서 본 그룹 차이에 기여할 수 있는 메커니즘을 고려 하는 관심 있을 수 있습니다 (그림 3B-3D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>"클러스터" (선택 사항) 패턴을 얼룩이 지는 통계적으로 분석 합니다.<ol>
<li>신호 식/추가 통계 분석에 대 한 연속 변수를 제공 하기 위해 셀을 검사 합니다. 독립 샘플 t-테스트 및 분산 분석 (ANOVA), 과목 사이의 요인의 수에 따라 두 가지 방법, 디자인에 포함 된 사용 합니다. 통계적 의사 결정 트리 (그림 4)는 가장 적절 한 통계적 접근에 관한 결정에 도움이 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+dopamine+D1+receptor+in+schizophrenia%3A+insights+for+cognitive+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction.</a> Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).</li>
<li>Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology%2C+signaling%2C+and+pharmacology+of+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors.</a> Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).</li>
<li>Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supranormal+stimulation+of+D1+dopamine+receptors+in+the+rodent+prefrontal+cortex+impairs+spatial+working+memory+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance.</a> J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).</li>
<li>Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dopamine+receptor+subtypes+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+the+rat+regulate+set-shifting%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting.</a> Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).</li>
<li>Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dopamine+therapeutics+for+cognitive+deficits+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).</li>
<li>Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prepulse+inhibition+and+latent+inhibition%3A+the+role+of+dopamine+in+the+medial+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).</li>
<li>Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+D1+dopamine+signaling+is+necessary+for+temporal+expectation+during+reaction+time+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance.</a> Neuroscience. 255, 246-254 (2013).</li>
<li>Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+Neurotransmission+in+the+Nucleus+Accumbens+Modulates+Social+Play+Behavior+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).</li>
<li>Abi-Dargham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+dopamine+D1+receptors+and+working+memory+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia.</a> J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).</li>
<li>Shinohara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D1+receptor+subtype+mediates+acute+stress-induced+dendritic+growth+in+excitatory+neurons+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+contributes+to+suppression+of+stress+susceptibility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice.</a> Mol Psychiatry. 19, (2017).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385, 634-636 (1997).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).</li>
</ol>

선언 하는 관심의 없습니다 충돌을 확인 하 고 있습니다.

이 프로토콜에 우리가 현장에서 교 잡 신선한 냉동 두뇌 분할 영역 핵 accumbens (NAc)에 Drd1α 수용 체 식과 티로신 hydroxylase (TH) 식 substantia nigra (SNR) 지역에서 평가 하의 소설 기법을 설명 합니다. 우리는 또한 다른 얼룩 패턴에 대 한 데이터 분석의 방법 제공: "개별 점" 또는 "클러스터".
교 잡 시험 현장에서 성공적인 멀티플렉스 형광 RNA에 대 한 중요 한 단계가 포함 되어 있습니다. 일단 목이 쥐 그리고 두뇌 제거 액체 질소 5 분 이내에 뇌 동결 4 %paraformaldehyde 고정까지-20 ° C에서 뇌 섹션을 유지. 전처리 4의 외피의 30 분 후 슬라이드 15 분 이상 1 x PBS에 체류 하지 해야 합니다. 뇌를 섹션 증폭 단계 사이 밖으로 건조 하지 마십시오. Confocal 영상 보여주는 명확한 얼룩 신호 조직 샘플에서 높은 품질의 이미지를 제공 하는 매우 도움이 됩니...

부전 striatal 도파민 시스템의 여러 neurocognitive 질병에서 관찰 하는 임상 증상의 진행에 포함 된다. 도파민 D1 수용 체는 두뇌의 전 두 엽 피 질 (PFC) 지역과 striatal에 존재 하 고 무 겁 게 영향 인지 프로세스1, 작동 메모리, 시간 처리, 및 기관차 동작2,3 등 , 4 , 5 , 6 , 7. 이전 연구는 도파민 D1 수용 체의 변화 주의 적자 과다 장애 (ADHD)8, 정신 분열 증9, 에 neurocognitive 증상의 진행과 관련 된 했다 해명 10 , 스트레스 감수 성11. 특히, 정신 분열 증, 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 연구 엽 외피가 있는 도파민 D1 수용 체의 바인딩을 능력 높은 인식 적자와 부정적인 증상11의 존재에 관련 된 표시. 전 두 엽 피 질 도파민 D1 수용 체에 의해 통제에서 흥분 성의 뉴런의 수지상 성장 스트레스 민감성을 완화 한다. 또한, 내측 전 두 엽 피 질 (mPFC) 신경 수용 체 D1의 최저 사회 패배 스트레스로 사회적 회피12향상 시킬 수 있습니다.
여기, RNA 교 잡 제자리에서 신선한-냉동 조직 샘플 셀에 단일 RNA 분자를 시각화의 새로운 기술을 소개 합니다. 현재 기술은 현재 문학 내에서 존재 하는 방법에 비해 여러 장점이 있습니다. 첫째, 현재 프로시저는 조직의 공간 및 형태학 컨텍스트를 유지 하 고 신선한 요구 하는 다른 절차, 조직에 포함 되지 않은 현재 방법으로 결합 될 수 있습니다 있도록 신선한 냉동 조직 샘플에서 수행 되었다. 포 르 말린 고정 및 파라핀 끼워 넣어진 조직에 유사한 절차는 단일 전송 해상도는 RNA 제자리에서 교 잡 기술은13를 사용 하 여 달성 될 수 있다 설명 했다. 우수한 감도 낮은 복사 번호 식으로 다른 핵 산 탐지 방법으로 얻을 수 없는 개별 셀 수준에서 유전자 발현을 비교 하는 기회를 제공 하는 단일 전사 수준에서 RNA의 검출 같은 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기술. 현재 메서드의 단일 대상 RNA 사본에 때 교배 하 고 순차적으로 신호 증폭 분자 검출에의 묶인 매우 구체적인 RNA 프로브를 통해 높은 신호 대 잡음 비율을 사용 하 여 이미지를 유지 하는 또한, 시스템입니다. 마지막으로, 현재 기술 우리의 조사 시스템 관련 마커 단백질에 의해 감지와 같은 단 하나의 클래스를 제한 하는 것 보다는 그것의 특정 대상 독점 프로브, 여러 생물 학적 시스템을 평가 하는 기회 제공 immunohistochemistry 방법입니다.
우리의 연구에서 우리 둘 다 남성과 여성 F344/N 쥐의 핵 accumbens (NAc)에 Drd1α 수용 체 식과 티로신 hydroxylase (TH) 식 substantia nigra (SNR)에서 평가를이 소설 RNA 제자리에서 교 잡 사용. 교 잡 제자리에서 혁신적인 RNA 우리 모두 다 통풍 관 및 다 출시 동시에 영향을 미치는, striatal 다 시스템의 복잡성에 대 한 우리의 이해를 향상 시키는 메커니즘을 조사를 활성화. 신선한 냉동 뇌 조각 및 다른 얼룩 패턴에 대 한 데이터 분석의 방법 제공 절차, 설명: "개별 점" 또는 "클러스터".

<table><tbody><tr><td>HybEZ 오븐 시스템</td><td>고급 세포 진단&nbsp;</td><td>310010</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 프로브 - Rn-Drd1a</td><td>고급 세포 진단&nbsp;</td><td>317031</td><td>색상 채널 1, 녹색</td></tr><tr><td>RNAscope 프로브 - Rn-Th-C2</td><td>고급 세포 진단&nbsp;</td><td>314651-C2</td><td>컬러 채널 2, 오렌지</td></tr><tr><td>RNAscope 형광 멀티플렉스 시약 키트</td><td>고급 세포 진단&nbsp;</td><td>320850</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge 소수성 장벽 펜</td><td>벡터 연구소</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Merritt 수의학 공급</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek 수직 24 슬라이드 랙</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9837976</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek 염색 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0731403</td><td></td></tr><tr><td>정밀 범용 수조</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TSGP28</td><td></td></tr><tr><td>전처리 4</td><td>고급 세포 진단&nbsp;</td><td>320850</td><td>키트의 부품</td></tr><tr><td>ProLong Gold 안티-페이드 시약</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Amp 1-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>키트</td></tr><tr><td>부품 Amp 2-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>키트 부품</td></tr><tr><td>Amp 3-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>키트 부품</td></tr><tr><td>Amp 4-FL-Alt</td><td>A 고급 셀 진단&nbsp;</td><td>320850</td><td>키트의 부품</td></tr><tr><td>EZ-C1 소프트웨어 패키지</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>버전 3.81b</td></tr><tr><td>SAS/STAT 소프트웨어</td><td>SAS Institute, Inc.,</td><td></td> <td>버전 9.4</td></tr></tbody></table>

탐지 기술 현장에서 혁신적인 rna에 의해 설치류 핵 accumbens에서 도파민 d1-알파 수용 체의 식별

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

중앙 신경 조직에서 D1-알파 하위 수용 체 (Drd1α)은 가장 풍부한 도파민 (DA) 수용 체, 조절 신경 성장 및 개발에 중요 한 역할을. 그러나, Drd1α 수용 체 이상 행동 응답을 중재 하 고 변조 작업 메모리 기능을 기본 메커니즘을 아직 명확 하지 않다. 새로운 RNA 제자리에서 교 잡 분석 결과 사용 하 여, 현재 연구 식별 도파민 Drd1α 수용 체와 티로신 hydroxylase (TH) RNA 식 핵 accumbens (NAc) 지역과 substantia nigra 지역 (SNR)에 다 관련 회로에서 각각. Drd1α 식은 NAc에 얼룩 패턴 "개별 점"을 보여줍니다. 분명 성 다름 Drd1α 식에서 관찰 되었다. 반면, 일 "클러스터 된" 얼룩 패턴을 보여 줍니다. 일 식에 관한 여성 쥐 남성 동물을 기준으로 셀 당 더 높은 신호 식 표시. 여기에 제시 된 방법을 중앙 신 경계 질환의 진행 하는 동안 변경 내용을 도파민 시스템 장애에서를 조사 소설 현장에서 교 잡 기술을 제공 합니다.

현재의 연구는 관찰 F344/N 쥐 (그림 1A)에서 NAc의 도파민 D1-알파 수용 체 (Drd1α)에서 RNA 식에 대 한 패턴을 얼룩이 지기 "개별 점". 개별 형광 신호 쉽게 확인 하 고 각 셀 내에 단일 RNA 사본을 나타내는 단일 "점"으로 볼 수 있습니다. "이산 점 들" 얼룩 패턴을 표시 하는 NAc에서 이미지에 대 한 우리 반 정량 분석 (그림 1A, 그림 2A및 2B)를 사용 하 여 식의 동적 범위를 평가 합니다. 각 셀은 "0-9에서" 셀 당 도트 수에 따라 득점 했다. 이 "교배 신호"-점수 (H 점수) 방법 따라서 평가할 수 범위와 변화 Drd1α 식에 대 한 개별 셀에 걸쳐.
<p class="jove_content" fo:keep-together.w...

핵 accumbens에 있는 도파민 D1-알파 수용 체의 식별은 중앙 신 경계 질환 중 D1 수용 체 역 기능을 명확히 중요 합니다. 우리는 새로운 RNA 제자리에서 교 잡 분석 결과 시각화 특정 뇌 영역에 하나의 RNA 분자를 수행.

탐지 기술 현장에서 혁신적인 RNA에 의해 설치류 핵 Accumbens에서 도파민 D1-알파 수용 체의 식별

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

이 새로운 RNA 현장 혼성화 분석의 전반적인 목표는 중추신경계 질환 중 도파민성 기능 장애를 명확히 하는 데 중요한 특정 뇌 영역에서 단일 RNA 분자를 시각화하는 것입니다. 이 방법은 도파민 이상, 행동 반응 중재 및 작업 기억 기능 조절과 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 중추 신경계 질환이 진행되는 동안 도파민 시스템 기능 장애를 조사하기 위한 새로운 현장 혼성화 기술을 제공한다는 것입니다.이 방법은 주어진 뇌 영역에서 표적 mRNA의 전반적인 발현 수준에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 주어진 영역의 세포 전체에 mRNA 전사체가 어떻게 분포되어 있는지 결정하는 데에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 성체 쥐의 뇌를 채취한 후 5분 이내에 액체 질소에 15초 동안 담가둡니다. 다음으로, 섭씨 영하 20도의 뇌를 한 시간 동안 냉동 유지조에서 평형을 이룹니다.한 시간 후, 브레그마 앞쪽 2.76mm에서 2.28mm까지 측좌핵을 포함하는 30미크론 절편을 절단하고 슬라이드에 장착합니다. 그런 다음 섭씨 영하 20도에서 10분 동안 섹션을 건조시킵니다. 그런 다음 슬라이드를 미리 냉각된 4% 파라포름알데히드에 섭씨 4도에서 1시간 동안 담그십시오.다음으로, 실온에서 증가하는 에탄올 구배에 슬라이드를 배치한 다음 슬라이드를 새로운 100% 에탄올로 5분 더 옮깁니다. 그런 다음 공기 건조를 위해 흡수지에 슬라이드를 놓습니다. 배리어 펜으로 각 섹션 주위에 배리어를 그립니다.장벽을 1분 동안 완전히 건조시킵니다. 뇌 부분을 사전 치료하려면 오븐을 켜고 온도를 섭씨 40도로 설정하십시오. 각 뇌 섹션에 전처리 시약을 3방울 떨어뜨립니다.그런 다음 실온에서 30분 동안 섹션을 배양합니다. 그런 다음 실온에서 1분 동안 슬라이드를 1X PBS에 담그고 1분 동안 새 1X PBS로 슬라이드를 옮깁니다. 슬라이드는 15분 이상 1X PBS에 머물지 않아야 합니다.멀티플렉스 분석을 실행하려면 수조에서 대상 프로브를 섭씨 40도에서 10분 동안 예열한 다음 실온으로 냉각합니다. RNA 시약을 실온에 놓습니다. 흡수성 종이로 슬라이드에서 여분의 액체를 제거하고 슬라이드 랙에 다시 놓습니다.그런 다음 각 샘플 슬라이스에 Drd1alpha 3방울을 프로브로 추가하고 섭씨 40도에서 2시간 동안 샘플을 배양합니다. 그 후, 1X 세척 버퍼에 슬라이드를 넣고 실온에서 2분 동안 두 번 세척합니다. 그런 다음 흡수성 종이로 슬라이드에서 여분의 액체를 제거하고 슬라이드 랙에 다시 놓습니다.배양 단계 사이에 뇌 부분이 건조해지지 않도록 한다. 각 샘플 슬라이스에 AMP 1FL 3방울을 추가하고 섭씨 40도에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 그 후, 실온에서 매번 2분 동안 1X 세척 버퍼로 슬라이드를 두 번 세척합니다.그런 다음 흡수성 종이로 슬라이드에서 여분의 액체를 제거하고 슬라이드 랙에 다시 놓습니다. 그런 다음 각 샘플 슬라이스에 AMP 2FL 3방울을 추가합니다. 섭씨 40도에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.다음으로, 실온에서 2분 동안 1X 세탁 버퍼에 슬라이드를 두 번 담급니다. 흡수성 종이로 슬라이드에서 여분의 액체를 제거하고 슬라이드 랙에 다시 놓습니다. 각 샘플 슬라이스에 AMP 3FL 3방울을 추가하고 섭씨 40도에서 30분 동안 샘플을 배양합니다.다음으로, 1X 세척 버퍼에 슬라이드를 넣고 실온에서 2분 동안 두 번 세척합니다. 흡수성 종이로 슬라이드에서 여분의 액체를 제거하고 슬라이드 랙에 다시 놓습니다. 그런 다음 각 샘플 슬라이스에 AMP 4FL ALT A 3방울을 추가하고 섭씨 40도에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.실온에서 2분 동안 1X 세척 버퍼로 슬라이드를 두 번 세척합니다. 슬라이드에서 과도한 액체를 제거하고 즉시 각 섹션에 장착 시약 두 방울을 떨어뜨립니다. 다음으로, 각 뇌 부분에 22mm x 22mm 커버슬립을 놓습니다.그런 다음 슬라이드를 건조할 때까지 섭씨 2도에서 8도의 어두운 곳에 보관하십시오. 이미징을 위해 컨포칼 현미경을 켜고 60X 대물렌즈로 전환하십시오. Z 스택 이미지를 획득하고 측좌핵 영역에서 Drd1alpha 표지 세포의 이미지를 획득합니다.불연속적인 점 염색 패턴을 나타낸 측좌핵의 이미지에 대해 반정량적 분석을 사용하여 동적 발현 범위를 평가했습니다. 각 셀은 셀당 점 수에 따라 0에서 9까지 점수가 매겨졌습니다. 따라서 이 혼성화된 신호 점수 방법은 개별 세포에서 Drd1alpha 발현의 범위와 가변성을 평가할 수 있습니다.다음은 불연속적인 점 염색 패턴을 가진 수컷 및 암컷 쥐에서 Drd1alpha 발현의 대표적인 컨포칼 이미지입니다. 중첩된 데이터 구조를 설명하기 위해 각 범주에 대한 평균 개수 값을 계산하고 통계 분석에 사용했습니다. 수컷과 암컷 쥐의 중간 세포 수 차이를 평가하기 위해 Mann-Whitney U 테스트를 수행했습니다.각 범주에 속하는 세포의 빈도는 상대 빈도와 누적 빈도(cumulative frequency)를 사용하여 분석됩니다. 암컷 동물은 수컷 동물에 비해 순서가 낮은 범주에 속하는 세포의 빈도가 더 높으면서 분포에서 상당한 변화를 보였습니다. 전반적으로, 결과는 측좌핵에서 Drd1alpha 발현의 명확한 성별 차이를 시사합니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 7시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 온도 변화나 조직의 건조로 인해 mRNA가 손상되고 신뢰할 수 있는 신호를 얻는 데 방해가 될 수 있으므로 신속하게 작업해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 피질 조직에서 현장 혼성화 기법을 수행하고, 선택한 뇌 영역 내에서 신호 mRNA 전사체를 형광 이미지화하고, 통계 분석을 위해 mRNA 전사체 분포를 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

identification-dopamine-d1-alpha-receptor-within-rodent-nucleus

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 마취된 쥐에 전극과 캐뉼라를 이식하여 전위차점 측좌핵의 도파민 방출을 측정하고 복부 피개 영역의 도파민 활성을 조절하기 위한 약물 주입을 보여줍니다.

VTA 도파민 뉴런 수용체 조작을 사용한 쥐 모델에서 도파민 방출 모니터링

이 비디오는 세로토닌 증후군의 영향을 받는 쥐의 뇌 조직에서 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 세로토닌 수용체 RNA 합성을 감지하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜에는 조직 전처리, 프로브 혼성화 및 효소 검출이 포함되어 현미경으로 세로토닌 수용체 RNA 발현을 시각화하고 정량화합니다.

쥐 뇌 절편에서 RNA 발현을 연구하기 위해 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 현장 혼성화

이 책의 목적은 시각화 및 초파리에서 추출한 RNA에 향상된 북부 얼룩 프로토콜의 동작 단계를 논의 배아, 세포 및 조직을 melanogaster하는 것입니다. 이 프로토콜은 작은 RNA 종의 효율적인 검출에 특히 유용하다.

작은 RNA 종의 북부 오 탐지의 향상된 초파리 Melanogaster

개별 도파민 뉴런의 단리 또는 직접 또는 간접 면역과 복측 피개 영역은 레이저 미세 절제를 캡처하여 설명된다. 적외선 레이저를 이용하여 유리 슬라이드 조직으로부터 단리 및 적외선 및 자외선 레이저의 조합을 이용하여 막 slide에서 파라미터 논의된다.

레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

RNA in situ hybridization (ISH)는 세포와 조직에서 RNA를 시각화할 수 있습니다. 여기에서는 RNAscope ISH와 면역조직화학 또는 조직학적 염료의 조합을 사용하여 마우스와 인간 뇌 섹션에서 축삭돌기에 국한된 mRNA를 검출하는 방법을 보여줍니다.

고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

파킨슨 병 (PD)에서 Substantia 그라 (SNC) 도파민 신경 세포는 운동 기능 장애로 이어지는, 퇴화. 여기에서 우리는 티로신 하이드 록 (TH) 프로모터 서열에 의해 구동 eGFP는 표현 마우스에서 복부 중뇌 신경 세포를 배양하는 문화에서 개별 형광 신경 세포를 수확하고, RNA-서열을 사용하여 사체를 측정하기위한 프로토콜을보고합니다.

RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

여기에서, 우리는 분자 비콘, 회전 디스크 공초점 현미경 및 오픈 소스 분석을 사용하여 살아있는 Drosophila melanogaster 계란 챔버에서 내인성 mRNA 인신 매매의 시각화, 탐지, 분석 및 추적을위한 프로토콜을 제시합니다. 소프트웨어.

라이브 드로소필라 멜라노가스터 에그 챔버에서 내인성 mRNA 를 시각화하고 추적

여기서 우리는 쥐 실질니그라 파스 콤팩트카에서 도파민성 뉴런 수의 반정적 측정을 위한 자동화된 방법을 제시한다.

자동 이미지 분석을 사용하여 설치류 모델의 실질적인 Nigra에서 도파민성 뉴런 밀도의 반정량 측정

시투 혼성화(ISH)의 멀티플렉스는 성인 마우스의 전체 vagal ganglionic 복합체에서 2개의 G 단백질 결합 수용체 및 1개의 전사 인자에 대한 성적증명서를 동시에 시각화하기 위해 사용되었다. 이 프로토콜은 vagal 포렌트 뉴런의 전사 프로파일의 정확한 지도를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

시투 혼성화에서 멀티플렉스를 사용하여 마우스 Vagal afferent 뉴런에서 G 단백질 결합 수용체 발현의 검출

본 연구는 다공성 막 삽입물을 이용해 축삭 mRNA를 분리하는 견고한 방법을 제시하여, 전체 뉴런과 신경돌의 분리 및 RNA 정제를 가능하게 합니다. RTddPCR과 결합하여 저복제 전사체의 절대적 정량화를 가능하게 하여, 높은 민감도, 재현성, 광범위한 실험적 적용성을 가진 mRNA 수송 및 국소 번역 연구를 용이하게 합니다.

다공성 막 삽입물과 RTddPCR을 이용한 축삭 mRNA의 분리 및 정량

배우세요 새로운 RNA 현장 하이브리드화 기법을 사용하여 설치류 핵 어컴벤스에서 도파민 D1-알파 수용체의 mRNA 분포를 시각화하는 방법을. 이 기법은 중추신경계 질환 관련 도파민 기능 이상을 연구하는 데 활용됩니다.

탐지 기술 현장에서 혁신적인 RNA에 의해 설치류 핵 Accumbens에서 도파민 D1-알파 수용 체의 식별

더 많은 동영상 탐색