탐지 기술 현장에서 혁신적인 RNA에 의해 설치류 핵 Accumbens에서 도파민 D1-알파 수용 체의 식별

이 새로운 RNA 현장 혼성화 분석의 전반적인 목표는 중추신경계 질환 중 도파민성 기능 장애를 명확히 하는 데 중요한 특정 뇌 영역에서 단일 RNA 분자를 시각화하는 것입니다. 이 방법은 도파민 이상, 행동 반응 중재 및 작업 기억 기능 조절과 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 중추 신경계 질환이 진행되는 동안 도파민 시스템 기능 장애를 조사하기 위한 새로운 현장 혼성화 기술을 제공한다는 것입니다.

이 방법은 주어진 뇌 영역에서 표적 mRNA의 전반적인 발현 수준에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 주어진 영역의 세포 전체에 mRNA 전사체가 어떻게 분포되어 있는지 결정하는 데에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 성체 쥐의 뇌를 채취한 후 5분 이내에 액체 질소에 15초 동안 담가둡니다. 다음으로, 섭씨 영하 20도의 뇌를 한 시간 동안 냉동 유지조에서 평형을 이룹니다.

한 시간 후, 브레그마 앞쪽 2.76mm에서 2.28mm까지 측좌핵을 포함하는 30미크론 절편을 절단하고 슬라이드에 장착합니다. 그런 다음 섭씨 영하 20도에서 10분 동안 섹션을 건조시킵니다. 그런 다음 슬라이드를 미리 냉각된 4% 파라포름알데히드에 섭씨 4도에서 1시간 동안 담그십시오.

다음으로, 실온에서 증가하는 에탄올 구배에 슬라이드를 배치한 다음 슬라이드를 새로운 100% 에탄올로 5분 더 옮깁니다. 그런 다음 공기 건조를 위해 흡수지에 슬라이드를 놓습니다. 배리어 펜으로 각 섹션 주위에 배리어를 그립니다.

장벽을 1분 동안 완전히 건조시킵니다. 뇌 부분을 사전 치료하려면 오븐을 켜고 온도를 섭씨 40도로 설정하십시오. 각 뇌 섹션에 전처리 시약을 3방울 떨어뜨립니다.

그런 다음 실온에서 30분 동안 섹션을 배양합니다. 그런 다음 실온에서 1분 동안 슬라이드를 1X PBS에 담그고 1분 동안 새 1X PBS로 슬라이드를 옮깁니다. 슬라이드는 15분 이상 1X PBS에 머물지 않아야 합니다.

멀티플렉스 분석을 실행하려면 수조에서 대상 프로브를 섭씨 40도에서 10분 동안 예열한 다음 실온으로 냉각합니다. RNA 시약을 실온에 놓습니다. 흡수성 종이로 슬라이드에서 여분의 액체를 제거하고 슬라이드 랙에 다시 놓습니다.

그런 다음 각 샘플 슬라이스에 Drd1alpha 3방울을 프로브로 추가하고 섭씨 40도에서 2시간 동안 샘플을 배양합니다. 그 후, 1X 세척 버퍼에 슬라이드를 넣고 실온에서 2분 동안 두 번 세척합니다. 그런 다음 흡수성 종이로 슬라이드에서 여분의 액체를 제거하고 슬라이드 랙에 다시 놓습니다.

배양 단계 사이에 뇌 부분이 건조해지지 않도록 한다. 각 샘플 슬라이스에 AMP 1FL 3방울을 추가하고 섭씨 40도에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 그 후, 실온에서 매번 2분 동안 1X 세척 버퍼로 슬라이드를 두 번 세척합니다.

그런 다음 흡수성 종이로 슬라이드에서 여분의 액체를 제거하고 슬라이드 랙에 다시 놓습니다. 그런 다음 각 샘플 슬라이스에 AMP 2FL 3방울을 추가합니다. 섭씨 40도에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.

다음으로, 실온에서 2분 동안 1X 세탁 버퍼에 슬라이드를 두 번 담급니다. 흡수성 종이로 슬라이드에서 여분의 액체를 제거하고 슬라이드 랙에 다시 놓습니다. 각 샘플 슬라이스에 AMP 3FL 3방울을 추가하고 섭씨 40도에서 30분 동안 샘플을 배양합니다.

다음으로, 1X 세척 버퍼에 슬라이드를 넣고 실온에서 2분 동안 두 번 세척합니다. 흡수성 종이로 슬라이드에서 여분의 액체를 제거하고 슬라이드 랙에 다시 놓습니다. 그런 다음 각 샘플 슬라이스에 AMP 4FL ALT A 3방울을 추가하고 섭씨 40도에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.

실온에서 2분 동안 1X 세척 버퍼로 슬라이드를 두 번 세척합니다. 슬라이드에서 과도한 액체를 제거하고 즉시 각 섹션에 장착 시약 두 방울을 떨어뜨립니다. 다음으로, 각 뇌 부분에 22mm x 22mm 커버슬립을 놓습니다.

그런 다음 슬라이드를 건조할 때까지 섭씨 2도에서 8도의 어두운 곳에 보관하십시오. 이미징을 위해 컨포칼 현미경을 켜고 60X 대물렌즈로 전환하십시오. Z 스택 이미지를 획득하고 측좌핵 영역에서 Drd1alpha 표지 세포의 이미지를 획득합니다.

불연속적인 점 염색 패턴을 나타낸 측좌핵의 이미지에 대해 반정량적 분석을 사용하여 동적 발현 범위를 평가했습니다. 각 셀은 셀당 점 수에 따라 0에서 9까지 점수가 매겨졌습니다. 따라서 이 혼성화된 신호 점수 방법은 개별 세포에서 Drd1alpha 발현의 범위와 가변성을 평가할 수 있습니다.

다음은 불연속적인 점 염색 패턴을 가진 수컷 및 암컷 쥐에서 Drd1alpha 발현의 대표적인 컨포칼 이미지입니다. 중첩된 데이터 구조를 설명하기 위해 각 범주에 대한 평균 개수 값을 계산하고 통계 분석에 사용했습니다. 수컷과 암컷 쥐의 중간 세포 수 차이를 평가하기 위해 Mann-Whitney U 테스트를 수행했습니다.

각 범주에 속하는 세포의 빈도는 상대 빈도와 누적 빈도(cumulative frequency)를 사용하여 분석됩니다. 암컷 동물은 수컷 동물에 비해 순서가 낮은 범주에 속하는 세포의 빈도가 더 높으면서 분포에서 상당한 변화를 보였습니다. 전반적으로, 결과는 측좌핵에서 Drd1alpha 발현의 명확한 성별 차이를 시사합니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 7시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 온도 변화나 조직의 건조로 인해 mRNA가 손상되고 신뢰할 수 있는 신호를 얻는 데 방해가 될 수 있으므로 신속하게 작업해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 피질 조직에서 현장 혼성화 기법을 수행하고, 선택한 뇌 영역 내에서 신호 mRNA 전사체를 형광 이미지화하고, 통계 분석을 위해 mRNA 전사체 분포를 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.