Name: 検出技術その場で革新的な RNA 側坐齧歯動物の核内ドーパミン D1-アルファ受容体の同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学ぶRNA in situハイブリダイゼーション法を用いて、ラットの側坐核におけるドーパミンD1-アルファ受容体の発現パターンを可視化する手法です。単一RNA分子の検出により、性別差を含む受容体分布を高解像度で解析できます。

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本作品は、国立衛生研究所 HD043680、MH106392、DA013137、および NS100624 の健康 (NIH) の補助金によって支えられました。部分的な基金は、医用生体行動科学 NIH T32 のトレーニングの許可によって提供されました。

実験プロトコルは、動物のケアおよび使用委員会 (IACUC)、サウスカロライナ州の大学によって承認された (連邦保証番号: A3049-01)。
1. 新鮮な冷凍脳セクションの準備
<ol><li>N/F344 ラット系統を使用: 各性のラット 3 匹 13 ヵ月齢、本体重量約 320 g。</li>
	<li>5% (セボフルランの過剰摂取) のセボフルラン濃度を調整します。呼吸停止の追加分、後セボフルラン投与を続行します。</li>
	<li>ネズミの首をはねるし、脳を削除します。</li>
	<li>水没 15 液体窒素でラット脳組織収穫の 5 分以内で s。</li>
	<li>1 h 用クライオスタットの-20 ° C と脳を平衡します。</li>
	<li>30 μ m のセクションをカットし、スライド (材料の表を参照してください) に転送します。</li>
	<li>核側坐地域、約 2.76 mm ~ 前14前方 2.28 mm からセクションを選択します。</li>
	<li>継続的にラットの脳定位固定脳の構造によると核側坐地域の嗅球からラット脳をスライスします。</li>
	<li>スライドにサンプルをマウントします。セクションを保つため、-20 ° c で 10 分間乾燥します。</li>
	<li>4 ° C で 1 時間前に冷蔵 4% のパラホルムアルデヒドのスライドをすぐに没頭します。</li>
	<li>室温 (RT) で増加するエタノール勾配にスライドを配置: 50% エタノールに 5 分。70% エタノールに 5 分。100% エタノールに 5 分。</li>
	<li>新鮮な 100% リピート江藤。</li>
	<li>吸水紙の上のスライドを配置し、空気が乾燥。</li>
	<li>バリア ペンで各セクションに障壁を描画 (材料の表を参照してください)。1 分間完全に乾燥バリアができます。</li>
</ol>2. 脳の前処理
<ol><li>オーブンをオンにし、温度を 40 ° C に設定</li>
	<li>4 前処理試薬 3 滴 (90 μ L) を追加 (材料表参照) 各脳セクション (スライドごとの 1 つのセクション) に。</li>
	<li>セクション 30 分室温で孵化させなさい</li>
	<li>新鮮な 1 × PBS で RT。 繰り返し 1 分の 1x PBS でスライドが水没します。 注: スライドに 15 分よりも長く 1x PBS で滞在しないでください。</li>
</ol>3. RNA In Situハイブリダイゼーション蛍光多重アッセイ
<ol><li>暖かい水のお風呂で 40 ° C で 10 分間のターゲット プローブと右に冷却してから</li>
	<li>RNA 試薬の場所 (例えば、アンプ 1 4 FL) 室温</li>
	<li>スライド ラックの背面吸水紙と場所でスライドから余分な液体を削除する (テーブルの材料を参照してください)。</li>
	<li>サンプルのスライスに Drd1α プローブ (C1) の 3 滴 (90 μ L) を追加します。40 ° C で 2 時間インキュベートします。</li>
	<li>洗浄バッファー x 新鮮な 1 としたリピートで 2 分間洗浄バッファー x 1 のスライドが水没します。</li>
	<li>スライド ラックの背面吸水紙と場所でスライドから余分な液体を削除する (テーブルの材料を参照してください)。</li>
	<li>サンプルのスライス上アンプ 1 フロリダの 3 滴 (90 μ L) を追加します。40 ° C で 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>新鮮な 1wash バッファーを使用したリピートで 2 分間 1 洗浄バッファーのスライドが水没します。</li>
	<li>スライド ラックの背面吸水紙と場所でスライドから余分な液体を削除する (テーブルの材料を参照してください)。</li>
	<li>サンプルのスライスにアンプ 2 fl (90 μ L) を 3 滴を追加します。40 ° C で 15 分間インキュベートします。</li>
	<li>洗浄バッファー x 新鮮な 1 としたリピートで 2 分間洗浄バッファー x 1 のスライドが水没します。</li>
	<li>スライド ラックの背面吸水紙と場所でスライドから余分な液体を削除する (テーブルの材料を参照してください)。</li>
	<li>サンプルのスライス上アンプ 3 FL の 3 滴 (90 μ L) を追加します。40 ° C で 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>洗浄バッファー x 新鮮な 1 としたリピートで 2 分間洗浄バッファー x 1 のスライドが水没します。</li>
	<li>スライド ラックの背面吸水紙と場所でスライドから余分な液体を削除する (テーブルの材料を参照してください)。</li>
	<li>アンプ 4-フロリダ-オルト A サンプルのスライス上の 3 滴 (90 μ L) を追加します。40 ° C で 15 分間インキュベートします。</li>
	<li>洗浄バッファー x 新鮮な 1 としたリピートで 2 分間洗浄バッファー x 1 のスライドが水没します。</li>
	<li>スライドから余分な液体を削除する、すぐに取付試薬 2 滴 (材料表参照) 各セクションに。</li>
	<li>22 mm 22 mm coverslip の場所 (材料表参照) 各脳セクションの上。</li>
	<li>乾燥するまで、2-8 ° C で暗闇の中でスライドを保存します。</li>
	<li>共焦点顕微鏡をオンにし、60 X 目的に切り替えます。</li>
	<li>共焦点顕微鏡画像を Z スタックを取得します。共焦点レーザー顕微鏡の詳細手順の補足のビデオを参照してください。</li>
	<li>Drd1α 核側坐領域内のセルのラベルの画像を取得 (励起: 488 nm;放出: 515/30 nm)。 注: セクションが潜伏ステップ間乾く脳をてはいけないです。</li>
</ol>4. データ解析
<ol><li>染色パターンを半定量的に解析:「不連続な点」。<ol>
<li>イメージから個々 のセルを識別するために DAPI 染色として核マーカーを実行します。しかし、まだそれは細胞の核や細胞の不規則な形状の種類を複数持っているので、脳の特定の部分を分析することは困難です。ここでは、2 つの経験豊富な研究者は個別にセル領域を定義する画像から各セルを割り当てます。</li>
		<li>視覚的に特定の基準 (図 1 b) を使用して、セルごとのドット数に基づく代表的な共焦点画像内の各セルをスコアします。</li>
		<li>各カテゴリーの総細胞数を決定し、すべてのティッシュ セクション (図 2 a) の男女別各部門内のセルのパーセントの周波数を表示する相対頻度グラフを作成する細胞数 x100 で割ります別に (図 2 e)。</li>
		<li>個別にすべてティッシュ セクション (図 2 b) と男性と女性のためのセルの累積度数を確認する細胞数 x100 で事前のすべてのカテゴリ内のセルの合計を除算 (図 2 f)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>染色パターン (省略可能)「離散ドット」を統計的に分析します。<ol>
<li>自然 (すなわち、最高の電池式 (9) に最下位セル式 (1) から各ランクのカテゴリに該当するセルの数) の序数は、カテゴリカル変数を提供するセルあたりのドットの数を調べてさらに統計解析。</li>
		<li>記述統計量の検査の後、3 つの主なアプローチを使用: マントルピース Haenszel 統計, マン-ホイットニーの U 検定やクラスカル-ウォリス検定。正確な統計的手法に依存なりますが興味、統計的決定ツリー (図 4) の実験の設計と研究の質問は 1 つの分析的なアプローチに関する意思決定に役立つ可能性があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>染色パターンの利益 (率 ROI) の領域の信号強度の定量化:「クラスター」。<ol>
<li>次の式を使用して各画像の信号強度を計算します。 信号強度 = ROI 画像 - (平均背景強度 × 全体のイメージ領域) の合計強度</li>
		<li>セルあたりおおよそ信号式を計算する投資収益率イメージ内のセルの合計数をカウントします。セル/画像の数と同様、信号強度/画像のグループの違いは、信号式/携帯で見られるグループの相違に貢献するかもしれないメカニズムを考慮する興味のある (図 3B-3 D)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>染色パターン (省略可能)「クラスター」統計的に分析。<ol>
<li>さらに統計分析の連続的な変数を提供する信号式/セルを調べます。デザインに含まれる独立したサンプルの t 検定、分散分析 (ANOVA)、被験者間要因の数に基づいてなど、2 つのアプローチを使用します。統計的決定ツリー (図 4) は、最も適切な統計方法についての意思決定に役立つ可能性があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+dopamine+D1+receptor+in+schizophrenia%3A+insights+for+cognitive+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction.</a> Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).</li>
<li>Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology%2C+signaling%2C+and+pharmacology+of+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors.</a> Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).</li>
<li>Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supranormal+stimulation+of+D1+dopamine+receptors+in+the+rodent+prefrontal+cortex+impairs+spatial+working+memory+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance.</a> J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).</li>
<li>Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dopamine+receptor+subtypes+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+the+rat+regulate+set-shifting%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting.</a> Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).</li>
<li>Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dopamine+therapeutics+for+cognitive+deficits+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).</li>
<li>Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prepulse+inhibition+and+latent+inhibition%3A+the+role+of+dopamine+in+the+medial+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).</li>
<li>Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+D1+dopamine+signaling+is+necessary+for+temporal+expectation+during+reaction+time+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance.</a> Neuroscience. 255, 246-254 (2013).</li>
<li>Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+Neurotransmission+in+the+Nucleus+Accumbens+Modulates+Social+Play+Behavior+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).</li>
<li>Abi-Dargham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+dopamine+D1+receptors+and+working+memory+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia.</a> J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).</li>
<li>Shinohara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D1+receptor+subtype+mediates+acute+stress-induced+dendritic+growth+in+excitatory+neurons+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+contributes+to+suppression+of+stress+susceptibility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice.</a> Mol Psychiatry. 19, (2017).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385, 634-636 (1997).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).</li>
</ol>

宣言する利害の対立がないです。

このプロトコルに交配その場で新鮮凍結脳スライス (NAc) 側坐核における Drd1α 受容体の発現と中脳 (SNR) 地域におけるチロシン水酸化酵素 (番目の) 式を評価するための手法について述べる。我々 はまたさまざまな染色パターンのためのデータ分析方法を提供:「離散ドット」または「クラスター」。
交配分析その場で成功した多重蛍光 RNA のための重要なステップが含まれています。ラットを decapitating 脳を外し 5 分内で液体窒素で脳をフリーズ一度、-20 ° C で 4% パラホルムアルデヒドの固定までの脳のセクションを保ちます。4 前処理のインキュベーションの 30 分後 15 分以上 1x PBS でスライドに滞在しないでください。脳のセクションは増幅ステップ間を乾燥をさせてください。共焦点レーザー顕微鏡は、組織サンプルで示す明確な染色信号の高品質の画像を提供するため非常に便利です。ハイブリダイゼーション オーブンを使用して迅速かつ効率的にサンプルにもたらす 40 ° C
<p class="jove_content...

線条体ドーパミン系機能障害は複数の神経認知症にみられる臨床症状の進行に関与しています。ドーパミン D1 受容体が前頭前皮質 (PFC) と脳の線条体領域に存在し、認知1メモリ、一時的な処理、および機関車の動作2,3を含むに大きく影響,4,5,6,7. 以前の研究は、ドパミン D1 受容体の変化は、注意欠陥多動性障害 (ADHD)8、統合失調症9,の神経認知症状の進行と関連付けられたことを解明10ストレス感受性11。具体的には、統合失調症、陽電子放射断層撮影 (PET) 研究に認知障害や陰性症状11の存在する前頭皮質におけるドパミン D1 受容体の結合能が関連性が高いことが示されました。前頭前皮質のドーパミン D1 受容体による規制で興奮性ニューロンの樹枝状結晶の成長には、ストレス感受性が軽減されます。さらに、内側前頭前皮質 (mPFC) ニューロンの D1 受容体のノックダウンは、社会的敗北ストレス誘発性の社会的回避12を高めることができます。
RNAの in situハイブリダイゼーション新鮮凍結組織サンプルでのセルに単一の RNA 分子を可視化する手法を紹介します。現在の技術では、現在の文献内に存在する方法上の複数の利点を持っています。まず、現在のプロシージャは組織の空間的および形態学的コンテキストを保存し、他のプロシージャは、新鮮なを必要とする、非埋め込まれた組織は、現在の方法と組み合わせることができるように新鮮凍結組織サンプルで行った。ホルマリン固定パラフィン包埋組織における同様の手順は、単一の転写の解像度は、RNAの in situハイブリダイゼーション テクニック13を使用して達成することができます説明しています。単一の転写レベルで RNA の検出は、低コピー数の表現だけでなく、核酸検出の他の方法では達成できない細胞レベルでの遺伝子発現を比較する機会に優れた感度を提供しますポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) のテクニック」などさらに、現在のメソッドは、単一のターゲット RNA 転写産物にハイブリダイズと検出信号増幅の分子カスケードを順番にバインドされている、非常に特定の RNA プローブを介して高い信号対雑音比の画像を維持します。システム。最後に、現在の技術によるタンパク質検出などのシステム関連マーカーの 1 つだけのクラスに私たちの調査を制限するのではなく、そのターゲット固有の専用プローブでは、複数の生物学的システムを評価する機会を提供します免疫組織化学的方法。
私たちの研究では、側坐核 (NAc) Drd1α 受容体の発現と中脳 (SNR) でチロシン水酸化酵素 (番目の) 式を評価する男性と女性/N の F344 ラットの交配その場で新規 RNA を使いました。交配その場で革新的な RNA では、DA 取り込みと DA 放出の両方に同時に影響を及ぼす、線条体ドパミン DA システムの複雑さの理解を向上させるメカニズムを調査することができました。新鮮凍結脳をスライスし、さまざまな染色パターンのためのデータ分析方法を提供するため、我々 はプロシージャを記述するここでは、:「離散ドット」または「クラスター」。

<table><tbody><tr><td>HybEZオーブンシステム</td><td>アドバンストセルダイアグノスティックス&nbsp;</td><td>310010</td><td></td></tr><tr><td>RNAscopeプローブ - Rn-Drd1A</td><td>アドバンストセル診断&nbsp;</td><td>317031</td><td>カラーチャネル 1、緑色</td></tr><tr><td>RNAscope プローブ - Rn-Th-C2</td><td>アドバンスト セル診断&nbsp;</td><td>314651-C2</td><td>カラーチャネル 2、Orange</td></tr><tr><td>RNAscope 蛍光マルチプレックス試薬キット</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge疎水性バリアペン</td><td>ベクトル研究所</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plusスライドフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>12-550-154%&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Merritt 獣医用品</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek 垂直 24 スライドラック</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>NC9837976</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek 染色皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>NC0731403</td><td></td></tr><tr><td>精密 汎用バス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>TSGP28</td><td></td></tr><tr><td>前処理4</td><td>先進的細胞診断&nbsp;</td><td>320850</td><td>パーツ</td></tr><tr><td>キット ProLong Gold 退色防止試薬</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Amp 1-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>パーツ</td></tr><tr><td>キット Amp 2-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>パーツ</td></tr><tr><td>キット Amp 3-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>パーツ</td></tr><tr><td>キット Amp 4-FL-Alt A</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>キットのパーツ</td></tr><tr><td>EZ-C1 ソフトウェアパッケージ</td><td>ニコンインスツルメンツ</td><td></td><td>バージョン 3.81b</td></tr><tr><td>SAS/STAT ソフトウェア</td><td>SAS Institute, Inc.,</td><td></td> <td>version 9.4</td></tr></tbody></table>

検出技術その場で革新的な rna 側坐齧歯動物の核内ドーパミン d1-アルファ受容体の同定

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

中枢神経系 D1 α サブタイプ受容体 (Drd1α) は最も豊富なドーパミン (DA) の受容体で、神経の成長・発達の調節に重要な役割を果たしています。しかし、Drd1α 受容体異常行動応答を仲介してワーキング メモリ機能の変調メカニズムはまだ明らかではありません。交配アッセイの in situ新規 RNA を使用すると、現在の研究特定 RNA 発現核側坐 (NAc) エリアに位置し中脳領域 (SNR)、DA 関連回路から受容体とチロシン水酸化酵素 (TH) ドーパミン Drd1αそれぞれ。NAc の Drd1α 式は、「離散ドット」染色パターンを示しています。Drd1α 式で明確な性差が認められました。対照的に、第 5 回は、「クラスター化された」染色パターンを示します。番目の式について雌ラットはオスの動物と相対的にセルごとのより高い信号式を表示されます。紹介した方法は、中枢神経系疾患の進行中にドーパミン システムの機能不全の変化を調査するため小説の in situハイブリダイゼーション手法を提供します。

現在の研究は観察/N の F344 ラット (図 1 a) で NAc のドーパミン D1-アルファ受容体 (Drd1α) における RNA 発現のパターンを汚す「離散ドット」です。個々 の蛍光信号は容易に識別された、セル内の 1 つの RNA 転写産物を表す単一の「ドット」として見ることができます。「離散ドット」染色パターンを表示する、NAc からイメージの半定量分析 (図 1 a図 2 a・ 2 b) を使用して、式のダイナミック レンジを評価しました。各セル「0-9」セルあたりのドットの数に基づいてからの得点だった。この「交配させられた信号」-スコア (H スコア) 法評価できる従って範囲と Drd1α 式の変動個々 セルの間で。
染色...

側坐核ドーパミン D1-アルファ受容体の同定は、中枢神経系疾患の中に D1 受容体の機能不全を明らかにするため重要です。特定の脳領域の RNA 分子を可視化する交配アッセイの in situ新規 RNA を行った。

検出技術その場で革新的な RNA 側坐齧歯動物の核内ドーパミン D1-アルファ受容体の同定

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

この新しい RNA in-situ ハイブリダイゼーションアッセイの全体的な目標は、中枢神経系疾患におけるドーパミン作動性機能障害の解明に重要な特定の脳領域の単一 RNA 分子を可視化することです。この方法は、ドーパミン作動性異常、行動反応の媒介、作業記憶機能の調節など、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、中枢神経系疾患の進行中のドーパミン系機能障害を調査するための新しいin-situハイブリダイゼーション技術を提供することです。この方法は、特定の脳領域における標的mRNAの全体的な発現レベルに関する洞察を得ることができますが、mRNA転写産物が特定の領域の細胞全体にどのように分布しているかを決定するためにも適用できます。この手順を開始するには、成体ラットの脳を採取してから5分以内に、液体窒素に15秒間浸します。次に、クライオスタットでマイナス20°Cの脳を1時間平衡化します。1時間後、側坐核を含む30ミクロンの切片をブレグマの前方2.76ミリメートルから2.28ミリメートルに切断し、スライドにマウントします。次に、切片をマイナス20°Cで10分間乾燥させます。その後、スライドを予め冷やした4%パラホルムアルデヒドに摂氏4度で1時間浸します。次に、スライドを室温で増加するエタノール勾配に置き、スライドを新鮮な100%エタノールにさらに5分間移します。その後、スライドを吸収紙の上に置いて風乾させます。バリアペンで各セクションの周りにバリアを描きます。バリアを1分間完全に乾かします。脳切片を前処理するには、オーブンの電源を入れ、温度を摂氏40度に設定します。各脳部分に3滴の前処理試薬を追加します。次に、切片を室温で30分間インキュベートします。次に、スライドを室温で1X PBSに1分間浸し、スライドを新鮮な1X PBSにさらに1分間移します。スライドは1X PBSに15分以上留まってはいけません。マルチプレックスアッセイを実行するには、ターゲットプローブをウォーターバスで摂氏40度で10分間温めた後、室温まで冷却します。RNA試薬を室温で置きます。吸収紙でスライドから余分な液体を取り除き、スライドラックに戻します。次に、各サンプルスライスにプローブとしてDrd1alphaを3滴加え、サンプルを摂氏40度で2時間インキュベートします。その後、スライドを1X洗浄バッファーで2分間、室温で2回洗浄します。次に、吸収紙でスライドから余分な液体を取り除き、スライドラックに戻します。インキュベーションステップの合間に脳の切片を乾燥させないでください。各サンプルスライスにAMP 1FLを3滴加え、サンプルを摂氏40度で30分間インキュベートします。その後、スライドを1X洗浄バッファーで2回、室温で毎回2分間洗浄します。次に、吸収紙でスライドから余分な液体を取り除き、スライドラックに戻します。その後、各サンプルスライスにAMP 2FLを3滴加えます。サンプルを摂氏40度で15分間インキュベートします。次に、スライドを1X洗浄バッファーに2分間、室温で2回浸します。吸収紙でスライドから余分な液体を取り除き、スライドラックに戻します。各サンプルスライスにAMP 3FLを3滴加え、サンプルを摂氏40度で30分間インキュベートします。次に、スライドを1X洗浄バッファーで2分間、室温で2回洗浄します。吸収紙でスライドから余分な液体を取り除き、スライドラックに戻します。次に、各サンプルスライスにAMP 4FL ALT Aを3滴加え、サンプルを摂氏40度で15分間インキュベートします。スライドを1Xウォッシュバッファーで2分間、室温で2回洗浄します。スライドから余分な液体を取り除き、すぐに各セクションに2滴の封入試薬を置きます。次に、22 mm x 22 mm のカバースリップを各脳部分の上に置きます。次に、スライドを暗所で摂氏2〜8度で乾くまで保管します。イメージングには、共焦点顕微鏡の電源を入れ、60倍対物レンズに切り替えます。Zスタック画像を取得し、側坐核領域のDrd1alpha標識細胞の画像を取得します。離散的なドット染色パターンを示した側坐核からの画像について、発現のダイナミックレンジを半定量分析を使用して評価しました。各セルは、セルあたりのドット数に基づいて 0 から 9 まで採点されました。したがって、このハイブリダイズシグナルスコア法は、個々の細胞間でのDrd1alpha発現の程度および変動性を評価することができる。これは、離散的なドット染色パターンを持つ雄および雌ラットにおけるDrd1α発現の代表的な共焦点画像です。ネストされたデータ構造を説明するために、各カテゴリの平均カウント値が計算され、統計分析に使用されました。Mann-Whitney U検定は、雄と雌のラットにおける細胞数の中央値の違いを評価するために実施されました。各カテゴリのセルの度数は、相対度数と累積度数を使用して分析されます。雌動物は、雄動物と比較して下位のカテゴリーの細胞の頻度が高いほど、分布に有意な変化を示しました。全体として、結果は側坐核におけるDrd1α発現の明確な性差を示唆しています。このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば7時間で完了します。この手順を試みる際には、温度変化や組織の乾燥がmRNAを損傷し、信頼性の高いシグナルを得る能力を妨げる可能性があるため、迅速に作業することを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、皮質組織でin-situハイブリダイゼーション技術を実行する方法、選択した脳領域内のmRNA転写産物を蛍光画像化する方法、統計解析のためのmRNA転写産物の分布を特徴付ける方法について十分に理解できるはずです。

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JoVE Journal

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神経科学

このビデオでは、セロトニン症候群に罹患したラットの脳組織において、オリゴヌクレオチドプローブを用いたセロトニン受容体RNA合成の検出を実演しています。このプロトコールには、組織の前処理、プローブハイブリダイゼーション、および顕微鏡下でセロトニン受容体RNA発現を可視化および定量するための酵素検出が含まれます。...

オリゴヌクレオチドプローブを用いたラット脳切片におけるRNA発現の研究のためのin situハイブリダイゼーション

本書の目的は、 キイロショウジョウバエの胚、細胞、および組織から抽出されたRNA上の強化されたノーザンブロットプロトコルの手術の手順を視覚化し、議論することである。このプロトコルは、小さなRNA種の効率的な検出のために特に有用である。...

低分子RNA種のノーザンブロット検出における強化キイロショウジョウバエ

RNA in situハイブリダイゼーション(ISH)は、細胞や組織内のRNAの可視化を可能にします。ここでは、RNAscope...

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出<em&gt;その場での</em&gt;ハイブリダイゼーション

このプロトコルは、パラホルムアルデヒド接頭辞を持つ脳に理想的な迅速かつ簡素化されたin situハイブリダイゼーション法を説明しています。したがって、新鮮な凍結組織を使用しながら、長時間の複雑なステップの必要性を減らすことができます。...

ラピッド<em&gt;その場で</emセロトニン症候群のラットのパラホルムアルデヒド接頭辞脳にオリゴヌクレオチドプローブを使用して&gt;ハイブリダイゼーション

パーキンソン病（PD）では、黒質（SNC）ドーパミン作動性ニューロンは、運動機能障害につながる、退化します。ここでは、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）プロモーター配列によって駆動されるeGFPを発現するマウスから腹側中脳の神経細胞を培養する培養物から個々の蛍光ニューロンを収穫し、RNA-seqのを使用して、それらのトランスクリプトームを測定するためのプロトコルを報告しています。...

RNA配列決定およびTH-プロモーター駆動EGFP発現を使用して中脳培養における生活ドーパミン作動性ニューロンの信頼性の高い同定

ここでは、分子ビーコン、スピニングディスク共焦点顕微鏡、オープンソース分析を用いたライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNA人身売買の可視化、検出、分析、追跡のためのプロトコルを提示する。ソフトウェア。...

ライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNAの可視化と追跡

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレース方法について説明する。...

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング

ここでは、ラットの実質的なニグラ・パルス・コンパクでのドーパミン作動性ニューロン数の半定量的決定のための自動化された方法を提示する。...

自動画像解析を用いたげっ歯類モデルのサブスタチングニグラにおけるドーパミン作動性ニューロン密度の半定量的決定

Situハイブリダイゼーション(ISH)におけるマルチプレックスは、成体マウスの全迷頭神経節複合体における2つのGタンパク質共役受容体および1つの転写因子の転写を同時に可視化するために採用された。このプロトコルは、迷走性の刺激性ニューロンの転写プロファイルの正確な地図を生成するために使用することができる。...

マウスバガル・アファレントニューロンにおけるGタンパク質結合受容体発現 の 検出

本研究は、多孔質膜挿入を用いて軸索mRNAを単離する堅牢な方法を提示し、全ニューロンと神経突起の分離およびRNA精製を可能にします。RTddPCRと組み合わせることで、低コピー転写体の絶対定量が可能となり、mRNA輸送および局所翻訳の研究を高感度、再現性、そして広範な実験応用で可能にします。...

多孔質膜挿入およびRTddPCRを用いた軸索mRNAの単離および定量

学ぶRNA in situハイブリダイゼーション法を用いて、ラットの側坐核におけるドーパミンD1-アルファ受容体の発現パターンを可視化する手法です。単一RNA分子の検出により、性別差を含む受容体分布を高解像度で解析できます。

検出技術その場で革新的な RNA 側坐齧歯動物の核内ドーパミン D1-アルファ受容体の同定

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