Name: 레이블 없는 형광 현미경 검사 법에 의해, 인간의 저항 동맥에 콜라겐과 엘라 스 틴 압력 종속 마이크로아키텍처가 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 배우세요 레이블 없는 형광 현미경법을 이용하여 인간 저항동맥의 콜라겐과 엘라스틴 미세구조를 압력에 따라 평가하는 방법을. 이 기법은 혈관 생물학 및 생체역학 연구에 활용됩니다.

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저자는 실험실과 현미경의 사용에 대 한 덴마크어 분자 생체 이미징 센터에서 학부의 자연과학 대학 남부의 덴마크를 감사합니다. Myography 및 이미징 Kristoffer Rosenstand 및 Ulla Melchior에 압력을 가진 우수한 기술 지원을 인정 됩니다.

저자는 공개 없다.

이 작품이 나타냅니다 접근을 위한 표준화 된, 결합 된 이미징 및 압력 myography, 저항 동맥과 압력 관련 된 변화는 동맥의 구조에서의 기계적 특성의 동시 평가 대 한 귀중 한 우리의 제안을 0에서 100 mmHg의 압력 범위 벽. 그러나 제시 방법은 사용자 지정 건설된 장비를 사용 하 여 개발 되었다,, 어떤 압력 myograph 2 광자 여기 형광 현미경에 맞는 경우 사용할 수 있습니다, 두 장비의 디자인 수 동맥 벽의 영상. 모양, 폭 및 목적과 조건 되는 이미징 수행 됩니다의 거리에 특별 한 주의 지불 합니다. 똑바로 현미경 샘플 및 목표 간의 굴절율 차이 피하기 위해 거꾸로 현미경 물 침수 목표의 사용을 권장 하는 반면 물 찍기 목표를 사용을 해야 합니다. 또한, 관심에 지불 되어야 합니다 coverslip 두께 목적과 목표 (있는 경우)에서 보정 칼라를 사용 하 여 하는 coverslip 사이 불일치에 대 한 보정을 적용 하거나 coverslip 두께 목표와 일치 하 여 사용.
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병원 성 기여 및 저항 동맥 리 모델링의 효과 고혈압, 당뇨병 및 변화 증후군1,2,3,,45에 설명 되어 있습니다. Microvascular 벽의 기계 및 마이크로아키텍처 속성 사이의 관계를 파악 하는 것은이 협회의 수학적 모델을 개발 하기 위한 필수적입니다. 이러한 모델 리 모델링 프로세스를 이해 하는 것을 향상 됩니다 고 철 모델 동맥 벽의 개장 대상 질환 관련 약리 전략을 테스트 하는 데 유용의 개발을 지원 합니다.
동맥 벽의 마이크로아키텍처 기계적 측정을 통합 하 여 동맥 벽 역학에 관한 방법과 마이크로아키텍처는 세포 외 기질 (ECM)의 대형에서 거의 독점적으로 수행 이해에 초점을 맞춘 사전 연구 쥐 또는 돼지6,7,,89,10,11에서 탄성 도관 동맥. 벽의 마이크로 구조의 화상 진 찰은 일반적으로 콜라겐, 엘라 스 틴과 제 2 고조파 발생의 autofluorescence를 활용 하는 비선형 광학 기술을 사용 하 여 수행 됩니다. Spatiotemporal 이미징을의 기질, 엘라 스 틴과 콜라겐, 얼룩이 지기를 위한 필요 없이 두 가지 주요 구성 요소 수 있습니다. 영상 전체 두께에 동맥 벽의 큰 도관 동맥 두꺼운 tunica 매체에 있는 빛의 분산 때문에 도전 이다. 그러나 어떻게 동맥 벽의 구조적 구성 요소의 마이크로아키텍처 관찰된 기계적 성질에 관련 된 결정, 3 차원 정보는 기계적 테스트 하는 동안 얻어야 합니다. 인간의 대동맥 같은 큰 동맥이 필요 합니다 biaxial 장착, 기계적 테스트 및 동맥 벽7,,910, 의 1-2 cm2 조각에 관심 영역의 이미징 12. 벽의 일부만 몇 군데 및 기계적으로 테스트할 수.
어떤 종류의 작은 동맥에 대 한 (예를 들어, 인간의 pericardial13, 폐14 및 피하15 동맥, 쥐 mesenteric 동맥16,,1718, 19 , 20, 마우스 cremaster, mesenteric, 대뇌, 대 퇴 및 경 동맥21,22,23,,2425,26, 전체 벽 두께의 27) 이미징이 가능 하며 기계적 테스트와 결합 될 수 있다. 기계적 성질 및 벽에서 구조적 조치의 동시 녹음 수 있습니다. 그러나, 직접 수학적 모델링 ECM의 3 차원 구조에서 관찰 된 변경 및 저항 동맥 벽의 변경 된 기계적 성질 사이 관계의 우리의 지식의 최선을 보고 되었습니다 따라 최근 인간의 저항 동맥13,15.
이 작품에서는, 수동 기계 테스트 및 엘라 스 틴과 콜라겐 고립 된 인간의 저항 동맥의 동맥 벽에서의 마이크로 아키텍처의 동시 3-차원 영상 비보 전 방법을 설명 합니다. 관심의 어떤 종의 저항 동맥에 이미징 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 이미지 분석 내부 탄력 있는 lamina 분기 각도 및 adventitial 콜라겐 직진도13 피지28를 사용 하 여 측정을 얻기 위해 설명 합니다. 콜라겐과 엘라 스 틴 볼륨 밀도 Ilastik 소프트웨어29 를 사용 하 여 결정 하며 마지막으로, 동맥 벽 역학의 수학적 모델에 기계 및 이미징 데이터를 포함 합니다.
설명 하는 수학적 모델링을 함께 기술 조사 설명 하 고 이해 하는 체계적인 접근 방법을 제공 하는 영상 및 이미지 분석의 목표는 저항 동맥의 ECM에 압력 유도 된 변화 관찰. 설명된 방법 20, 40, 100 mmHg에서 ECM의 구조를 비교 하 여 가압, 동안 선박에 ECM에 변화를 측정에 집중 된다. 이러한 압력은 각각의 더 준수 (20 mmHg), 뻣 뻣 한 (100 mmHg) 및 중간 (40 mmHg) 상태에서 동맥 벽의 구조를 결정 하기 위한 선정 됐다. 그러나, vasoactive 구성 요소, 히스테리시스 및 흐름에 의해 유도 된 변화를 포함 하 여 라이브 동맥의 혈관 벽에 어떤 과정 든 지 수 측정할 수, 조사 하 여 문제의 연구 가설에 따라.
라이브 동맥의 압력 (또는 다른) 유도 공부 하 고 변화는 ECM에 대 한 압력 myograph와 함께에서 2 광자 여기 형광 현미경 (TPEM)의 사용을 강조 했다. 첫째,이 동시 취득은의 높은 품질의 3 차원 레이블 없는 인수와 함께 동맥 벽 (직경 및 벽 두께)의 전체 3 차원 구조를 사용 하면 때문에 상세한 콜라겐과 엘라 스 틴의 이미지 엘라 스 틴 autofluorescence 및 콜라겐 두 번째 고조파 발생 신호 (SHG)30의 활용 하 여 설명13 마이크로아키텍처가. 둘째, TPEM 수 저-에너지 근처-적외선 여기 빛, photodamage 조직과 따라서, 혈관 벽 내에서 정확 하 게 동일한 위치에서 반복된 이미지의 최소화는 허용, 허용 반복 측정 분석의 관찰 변경합니다.
고정 동맥 압력의 공초점 이미지를 사용 하 여 다른 접근 방법의 사용 TPEM에 액세스 하지 않고 사용자가 뿐만 아니라 설명된 메서드를 사용 하는 기회 수 있도록 설명 되어 있습니다. ECM 구조와 볼륨 밀도 대 한 정보 예:31,32에 의해 설명 된 대로 직렬 구분 조직의 2 차원 분석에서 검색할 수 있습니다. 그러나,이 메서드를 사용 하 여 상태를 변경 하는 동안 뿐만 아니라 동맥의 길이 비늘 통해 3 차원 구조 정보를 검색 하는 가능성의 부족, 그것은 압력의 수사를 위해이 접근을 사용 하 여 권장 하지 고 치료는 ECM에서 3 차원 변화를 유도 한다.
여기에서 설명한 메서드를 적용할 수 사관에 대 한 최소 요구 cannulation 및 형광 현미경 confocal 또는 2 광자 여기와 함께에서 동맥의 가압에 대 한 설치 프로그램에 액세스입니다. 다음 프로토콜에서 설명 하는 설치 사용자 지정 내장된 거꾸로 2 광자 여기 형광 현미경에 내장 경도 힘 변환기와 맞춤식 압력 myograph 이다.

<table><tbody><tr><td>Fine Science Tools</td><td>15401-12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine Science Tools</td><td>11251-23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 시그마-알드리치, 브롤로슬래시; ndby, 덴마크.</td><td>해부 목적</td><td></td>의 <td>761028</td></tr><tr><td>Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark</td><td>1.63, 2.13, 210mm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Smiths medical Intl, UK</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethicon</td><td>Ethilon 11-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Custom built</td><td></td><td>DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt</td><td></td></tr><tr><td>Mettler toledo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 시그마-알드리치, 브롤로슬래시; ndby, 덴마크.</td><td>B3259</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 시그마-알드리치, 브롤로슬래시; ndby, 덴마크.</td><td>A7030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 시그마-알드리치, 브롤로슬래시; ndby, 덴마크.</td><td>C5670</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 시그마-알드리치, 브롤로슬래시; ndby, 덴마크.</td><td>G7021</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 시그마-알드리치, 브롤로슬래시; ndby, 덴마크.</td><td>E3889</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Merck Millipore, Hellerup, Denmark</td><td>1.00496.9010</td><td>인산염 완충 (pH 6.9) 4% 포름알데히드 용액&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 시그마-알드리치, 브롤로슬래시; ndby, 덴마크.</td><td>H3784</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 시그마-알드리치, 브롤로슬래시; ndby, 덴마크.</td><td>P9666&</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nbsp; 시그마-알드리치, 브롤로슬래시; ndby, 덴마크.</td><td>P5655</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 시그마-알드리치, 브롤로슬래시; ndby, 덴마크.</td><td>M2643</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 시그마-알드리치, 브롤로슬래시; ndby, 덴마크.</td><td>S2002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>년&nbsp; 시그마-알드리치, 브롤로슬래시; ndby, 덴마크.</td><td>S5886</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 시그마-알드리치, 브롤로슬래시; ndby, 덴마크.</td><td>S5761</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 시그마-알드리치, 브롤로슬래시; ndby, 덴마크.</td><td>1.06462</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>10010015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 시그마-알드리치, 브롤로슬래시; ndby, 덴마크.</td><td>PHR1423</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 시그마-알드리치, 브롤로슬래시; ndby, 덴마크.</td><td>Z370525</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tocris Bioscience, Bristol, UK</td><td>538944</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>Custom built</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectra Physics, Mountain View, CA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu, Ballerup, Denmark</td><td>H7422P-40</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AHF analysentechnik AG (T&uuml; Bingen, Germany)에 의해 작성되었습니다.</td><td>ChromaET 460 nm 장역 통과 이색성</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AHF analysentechnik AG (T&uuml; Bingen, Germany)에 의해 작성되었습니다.</td><td>Semrock FF01-520/35-25 BrightLine 필터</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AHF 분석기 AG (T&uuml; Bingen, Germany)에 의해 작성되었습니다.</td><td>크로마 ET402/15X&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scotch TM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>커버슬립 두께는 현미경에서 사용된 대물렌즈(#1 또는 #1.5)와 일치해야 하며, 또는 커버슬립</td><td></td><td></td>과 일치하도록 조정 칼라를 설정합니다</tr></tbody></table>.

레이블 없는 형광 현미경 검사 법에 의해, 인간의 저항 동맥에 콜라겐과 엘라 스 틴 압력 종속 마이크로아키텍처가 평가

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

저항 동맥 개장의 병원 성 기여는 고혈압, 당뇨병 및 변화 증후군에서 설명 됩니다. 조사 및 건강 및 질병에 있는 인간의 저항 동맥의 기계적 성질을 이해 하기 위한 microstructurally 동기 수학적 모델의 개발을 이해를 돕기 위해 잠재력을가지고 어떻게 질병 및 치료 인간의 미세 혈관을 영향을 줍니다. 이러한 수학적 모델을 개발, microvascular 벽의 기계 및 마이크로아키텍처 속성 사이의 관계를 해독 하기 위해 필수적 이다. 이 작품에서는, 우리는 수동 기계 테스트 및 엘라 스 틴과 콜라겐 고립 된 인간의 저항 동맥의 동맥 벽에서의 마이크로 아키텍처의 동시 레이블-무료 3 차원 영상에 대 한 vivo 예 방법을 설명합니다. 관심의 어떤 종의 저항 동맥에 이미징 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 이미지 분석 측정 내부 탄력 있는 lamina 분기 각도 adventitial 콜라겐 직진도 피지 및 Ilastik 소프트웨어를 사용 하 여 결정 ii) 콜라겐과 엘라 스 틴 볼륨 밀도 사용 하 여 i) 압력 유도 된 변화에 대 한 설명 합니다. 그러나 가급적 모든 기계 및 이미징 측정 라이브, 끼얹는다 동맥에 수행 됩니다, 그리고, 다시 가압된 혈관의 후 고정 이미지와 표준 비디오 현미경 압력에에서 myography를 사용 하 여 다른 접근 방법 논의 했다. 이 대체 방법은 분석 방법에 대 한 다른 옵션이 있는 사용자를 제공 한다. 동맥 벽 역학의 수학적 모델에 기계 및 이미지 데이터의 포함을 논의 하 고 향후 개발 및 추가 프로토콜을 제안 하는.

이 작품에 사용 된 이미지에 대 한 맞춤식 압력 myograph는 그림 1에 표시 됩니다. 작은 볼륨 (2 mL)와 ii) 가까이, 그리고 유리 바닥 (그림 1B) 병렬 cannulae 포지셔닝을 위한 가능성 i)는 챔버는 myograph의 디자인에 대 한 특별 한 주의 지불 했다. 챔버의 바닥에는 50 × 24 mm #1.5 유리 coverslip (교체) 맞는. 압력 컨트롤러는 표준 1 L 유리 병 및 혈압 (커 프 스 제거)에서 건축 되었다. 흐름 요구 사항 myograph 설정, 서보 압력 컨트롤러를 사용 하 여 것이 좋습니다.
그림 2 에서는 실험 프로토콜에 명시 된 기간 동안 단일 이미지와 이미...

우리는 동시에 기계적 테스트 설명 하 고 절연, 동맥 벽의 3D 이미징 라이브 인간의 저항 동맥, 및 엘라 스 틴과 콜라겐 공간 조직 및 볼륨 밀도의 정량화에 대 한 피지 및 Ilastik 이미지 분석. 우리는 동맥 벽 역학의 수학적 모델에 이러한 데이터를 사용 하 여 논의.

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

이 방법론의 전반적인 목표는 세포외 기질의 미세구조와 동맥벽의 역학 사이의 관계를 분석하기 위해 살아있는 인간 저항 동맥의 이미지를 얻기 위한 표준화된 절차를 제공하는 것입니다. 이 방법은 압력이 전체 기하학적 구조와 혈관 벽의 미시구조에 어떻게 변화를 유도하는지와 같은 혈관 생물학 및 역학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이미징을 위해 샘플에 라벨을 붙일 필요가 없다는 것입니다.이 방법은 저항 동맥 역학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 프로토콜의 수정된 버전은 기관지와 같은 다른 튜브 모양의 장기나 인간의 방광 또는 장 벽의 스트립에 적용할 수 있습니다. 먼저, 수술 중 절제 즉시 관심 조직 샘플을 수집하고 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 혈관을 준비합니다. 캐뉼레이션 동맥을 수은 5mm까지 가압합니다.그런 다음 이광자 레이저를 활성화하고 여기 파장을 820나노미터로 설정하여 이미징을 위한 광학 경로를 설정합니다. 460 나노미터 길이의 이색성 거울을 삽입하여 광 승수 사이에 방출광을 분할하고 두 채널에서 동시에 방출을 수집합니다. 520나노미터를 중심으로 한 30-60나노미터 광대역 통과 필터를 사용하여 엘라스틴 자가형광을 수집하고 410나노미터를 중심으로 하는 다른 필터를 사용하여 콜라겐 2차 고조파 생성 신호를 수집합니다.이제 레이저 체류 시간과 픽셀을 10마이크로초로 설정합니다. 100% 시야각을 위해 해상도를 512 x 512 픽셀로 설정합니다. 연속 스캔이 가능하고 가능한 한 낮은 여기, 광 출력 및 픽셀 체류 시간을 사용하여 사진이 라이브 동맥을 손상시키는 것을 방지합니다.그런 다음 동맥을 수동으로 스캔하여 최대 직경을 가진 평면을 찾습니다. 다음으로, 동맥의 가장 넓은 직경을 덮는 직사각형 슬라이스를 선택하고 픽셀 크기가 픽셀당 300나노미터 이하인 단일 프레임을 스캔합니다. 나중에 분석할 수 있도록 이 이미지를 저장합니다.동맥의 최대 직경에서 루멘 직경과 벽 두께를 결정하려면 먼저 피지에서 이미지를 로드합니다. 메인 메뉴를 클릭하여 스케일을 설정한 다음 분석으로 이동한 다음 스케일을 설정합니다. 여기에 픽셀당 마이크로미터와 픽셀 비율을 입력합니다.다음으로, 피지 라인 도구를 선택하고 동맥 내강의 각 측면에 있는 두 개의 내부 탄성 얇은 판 사이에 선을 그립니다. 그런 다음 Control M을 클릭하여 결과 테이블의 길이를 보고합니다. 계속해서 더 많은 선을 그려 각 벽의 두께를 측정하고 최종 측정값을 저장합니다.개구수가 1 이상인 60X 대물렌즈로 변경합니다. 콜라겐과 엘라스틴 미세구조를 5mm 수은에서 동맥벽의 전체 두께를 스캔하여 이미지화합니다. 다음으로, Z 스택 시작 및 끝 깊이와 Z 단계 간격 및 픽셀 밀도를 정의합니다.Z 스택을 설계할 때 관심 영역이 후속 분석에서 곡률 추론을 피할 수 있을 만큼 충분히 작은지 확인하십시오. 완료되면 각 채널을 별도로 저장하도록 설정합니다. 마지막으로, 1-3개의 서로 다른 관심 영역을 찾고 좋은 품질의 3D 이미지 스택을 얻습니다.엘라스틴 자가형광이 표백하는 경우 너무 높은 여기광 출력을 사용하고 있는 것입니다. 이것은 피해야 합니다. 진행 중인 실험을 완료하기 위해 희석된 농도의 에오신을 첨가하여 엘라스틴 자가형광을 향상시킬 수 있습니다.완료되면 최대 수은 100mm의 압력에서 전체 프로세스를 반복하고 각 압력 단계 후에 근경 챔버의 버퍼를 섭씨 37도의 새로운 HBS로 교체합니다. 이미지 분석을 시작하려면 피지에서 엘라스틴 이미지 스택을 엽니다. 그런 다음 이미지로 이동하여 스택을 클릭하고 Z 프로젝트를 선택하여 작업할 이미지를 선택하고 프로젝션 유형에 대해 최대 강도를 선택합니다.최대 강도 투영을 TIFF 이미지로 저장합니다. 그런 다음 가능한 한 많은 내부 탄성 층류 섬유 분기점을 선택하고 각도 도구를 사용하여 측정합니다. 각 이미지를 체계적으로 작업하고 완료되면 피지 결과 시트를 저장합니다.외래 콜라겐의 물결 모양을 측정하려면 피지에서 콜라겐 이미지 스택을 엽니다. 그런 다음 스택으로 내려가는 이미지로 이동하고 Z 프로젝트를 선택하여 작업할 이미지를 선택하고 최대 강도 투영을 설정합니다. 이제 이미지, 유형, 8비트를 차례로 클릭하여 이미지 유형을 8비트 TIFF 이미지로 변경합니다.최대 강도 투영을 TIFF 이미지로 저장합니다. Fiji를 클릭하고 plugins에서 Neuron J를 선택하여 Neuron J 플러그인을 엽니다. 그런 다음 Neuron J에서 8비트 TIFF 파일을 열고 열리면 추적 추가를 클릭하고 각 섬유의 시작과 끝을 클릭하여 분석할 섬유를 선택합니다.그런 다음 트레이싱 측정으로 이동하여 대화 상자에서 디스플레이 추적 및 정점 측정을 선택합니다. 콜라주 섬유 직진도를 계산하려면 먼저 피지 추적 창의 값을 Excel에 복사합니다. 추적 창의 길이 값은 분석된 콜라겐 섬유의 전체 길이를 측정한 것입니다.둘째, 피지 정점 창의 첫 번째 및 마지막 XY 좌표를 분석한 각 콜라겐 섬유 다발에 대한 사본을 Excel로 복사합니다.그런 다음 피타고라스 정리를 사용하여 분석된 콜라겐 섬유 L0의 각 끝을 연결하는 직선의 길이를 계산합니다. 콜라겐 섬유 직진도는 최종적으로 L0/Lf로 계산됩니다. 방금 보여진 프로토콜에 따라 동맥의 가장 넓은 부분을 식별했으며 이 시점에서 최대 혈관 직경과 혈관 벽 두께를 측정하기 위해 무표지 형광 현미경을 사용하여 동맥을 스캔했습니다.높은 개구수 대물렌즈에 대한 더 높은 배율을 사용하면 혈관 직경과 벽 두께뿐만 아니라 콜라겐과 엘라스틴의 미세구조도 측정할 수 있습니다. 엘라스틴 섬유 분지각 및 콜라겐 직진도의 미세구조는 적절한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 연속적인 이미지 섹션에서 결정할 수 있습니다. 이를 통해 콜라겐과 엘라스틴의 미시구조에서 압력으로 인한 변화와 서로 다른 압력에서 증분 탄성 계수 사이의 관계를 직접 분석할 수 있습니다.이 절차에 따라 이미지에서 다른 정보도 추출할 수 있습니다. 이것은 혈관 종축을 따라 있는 외래 콜라겐의 배향 천사일 수도 있고, 튜니카 매질에서 세포외 기질의 미세구조일 수도 있습니다. 이 방법을 사용하여 이미지에서 추출한 정량적 측정은 건강한 인간 순환과 사망한 인간 순환이 서로 다른 조건에 어떻게 반응하는지 설명하기 위해 수학적 모델에 제공될 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 압력이 저항 동맥벽의 미세구조에서 어떻게 변화를 유도하는지에 대한 정보를 추출하기 위해 이미징 실험 및 후속 이미지 분석을 설계하는 방법에 대해 철저히 이해해야 합니다. 이광자 여기 형광 현미경으로 작업할 때 가시광선과 비가시광선에 대한 노출을 피해야 한다는 점을 기억하십시오.

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Research

연구

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Bioengineering

생명공학

이러한 세포 마이 그 레이션으로 세포 프로세스 전통적으로 2 차원, 딱딱한 플라스틱 표면에 연구하고 있습니다. 이 보고서는 직접 단백질 지방화를 시각화하고보다 생리학 관련, 3 차원 매트릭스에서 마이 그 레이션 세포의 단백질 역학을 분석하는 기술을 설명합니다.

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

라만 분광법은 비 접촉에 적합한 기술, 살아있는 세포, 조직 - 엔지니어링 구조와 기본 조직의 라벨이없는 분석입니다. 소스 고유의 스펙트럼 지문가 생성 및 복수 변수 분석을 사용하여 분석할 수 있습니다.

라만 분광학을 사용하여 세포와 세포외 기질의 비 접촉, 레이블이없는 모니터링

출처: Alluri, H., et al. 혈액-뇌 장벽 기능 장애 연구를 위한 체외 허혈-재관류 손상 모델로서의 산소-포도당 결핍 및 재산소화. J. Vis. Exp. (2015). 이 비디오는 쥐의 뇌 미세혈관 내피 세포(RBMEC)에서 밀접 접합 단백질과 스트레스 섬유의 형광 국소화를 보여줍니다. 스트레스 단층에서는 형광 표지된 항체를 사용하여 밀착 접합 단백질을 표지하고, 형광단 표지된 팔로이딘은 응력 섬유를 표지합니다. 그런 다음 표지된 분자는 컨포칼 현미경을 통해 시각화됩니다.

내피 세포에서 밀접한 접합 단백질과 스트레스 섬유의 형광 국소화(Fluorescence Localization of tight junction proteins and stress fibers in endothelial cells)

시간 경과 현미경 검사법과 이미지 처리 기술은 48시간 동안 환경적으로 통제된 생물 반응기에서 섬유아세포 매개 젤 다짐 및 피브린 섬유 재정렬을 관찰하고 분석하는 데 사용되었습니다.

섬유아세포 매개 피브린 겔 다짐 관찰 및 정량화

Dupuytren의 질병 (DD)는 손바닥의 fibroproliferative 질환이다. 여기서는 3 차원 (3D) 배양 계에서 배양 DD로부터 표본을 절제 프로토콜을 제시한다. 이러한 단기 배양 시스템은 3 차원 구조의 보존과 섬유 성 조직의 분자 특성을 허용한다.

인간의 Dupuytren의<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 근섬유 아세포의 연구와 세포 외 기질 상호 작용에 대한 문화

혈관 세포 기능은 세포 내 메신저의 활성에 따라 달라집니다.  여기에 설명된 것은 고립된 대동맥의 개별 내피 및 평활근 세포에서 생리학적 및 약리학적 자극에 반응하여 세포 내 칼슘 및 산화질소 수준을 측정할 수 있는 생체 외 이광자 이미징 방법입니다.

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징<sup&gt; 2 +</sup&gt; 고립 된 쥐 대동맥의 취급 및 내피 세포에서 산화 질소 생산과 부드러운 근육 세포

여기에 제시된 것은 혈관 동맥이 수납 및 가압되기 때문에, 모세관 침대 및 백혈구를 포함하는 혈관 나무 구성 요소뿐만 아니라 압력을 유지하는 동맥 관류 압력 및 흐름의 전 생체 모니터링에 의해 살아있는 뮤린 심장 조직에서 관상 동맥 미세 순환을 연구하는 프로토콜이다.

마우스 심장의 모세혈관, 동맥 및 페리사이클의 동적 측정 및 이미징

우리는 이질적인 구조적 및 기계적 죽상경화성 플라크 특성을 연구하기 위해 기계 이미징 파이프라인을 개발했습니다. 이 파이프라인은 콜라겐 섬유 배향의 국소 우세 각도와 분산, 파열 거동 및 섬유질 플라크 조직의 변형 지문의 상관 관계를 가능하게 합니다.

국소 콜라겐 구조와 죽상경화반 섬유조직의 기계적 특성 사이의 상관관계를 연구하는 방법

이 프로토콜은 레이저 광원 생성, 조직 샘플 준비, 이미징 수행 및 데이터 분석에 대한 세부 정보를 포함하여 SLAM(Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic) 현미경 기술에 대한 단계별 가이드를 제공합니다. SLAM은 조직 미세 환경을 조사하기 위해 4개의 상보적인 무표지 대비를 측정하여 비선형 현미경을 발전시킵니다.

동시 무표지 자가형광 다중 고조파 현미경

여기에서는 분자 또는 조직병리학적 분석을 위해 절편하기 전에 조직 안정화 젤을 혈관 내강에 주입하여 인간 동맥 구조를 보존하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

체외 내강내 젤 주입: 인간 저항 동맥의 현미경 분석을 위한 고급 접근 방식

배우세요 레이블 없는 형광 현미경법을 이용하여 인간 저항동맥의 콜라겐과 엘라스틴 미세구조를 압력에 따라 평가하는 방법을. 이 기법은 혈관 생물학 및 생체역학 연구에 활용됩니다.

레이블 없는 형광 현미경 검사 법에 의해, 인간의 저항 동맥에 콜라겐과 엘라 스 틴 압력 종속 마이크로아키텍처가 평가

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