세포종과 치료 줄기 세포 시드 장비의 Intracranial 주입의 이미지 기반 절제

이 절차의 전반적인 목표는 생쥐의 뇌암을 외과적으로 절제하고 종양 귀환 치료 줄기 세포가 파종된 골격을 수술 후 절제강에 이식하는 것입니다. 이 방법은 외과적 절제술이 수술강에 세포를 이식하는 데 어떤 영향을 미치는지, 수술 후 뇌암에 대한 새로운 치료제가 얼마나 효과적인지, 골격 기반 전달 시스템이 치료 결과에 어떤 영향을 미치는지와 같은 세포 치료 및 신경 종양학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간 환자의 임상 치료 표준을 밀접하게 모방하는 방식으로 쥐에서 뇌암 중재를 연구할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 골격에서 전달되는 줄기 세포 치료에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 나노 입자, 소분자, 종양 용해성 바이러스 또는 기타 새로운 치료법과 같은 다른 중재에도 적용할 수 있습니다. 마우스에 이식하기 48시간 전에 먼저 PLA 골격을 약 2 x 2mm의 절제 구멍 크기 조각으로 절단하여 골격을 준비합니다. 70% 에탄올에 15분 동안 담가 골격을 살균합니다.

15분 후 골격을 PBS에 담그십시오. 그런 다음 10%의 소 태아 혈청과 1%의 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 Dulbecco의 변형된 독수리 배지에 골격을 놓고 파종을 위해 세포를 준비합니다. 세포를 준비하기 위해 먼저 0.05%트립신을 사용하여 배양된 MSC를 들어 올립니다.

섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후 세포가 들어 올려졌는지 확인하십시오. 그런 다음 플라스크에 DMEM을 추가하여 트립신을 비활성화합니다.

다음으로, 플라스크 내용물을 15ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 그런 다음 5분 동안 100배 g으로 원심분리를 통해 각 골격에 대해 5배 10배 펠릿 5번째 MSC를 펠릿

원심분리 후 상층액을 흡인하고 MSC를 5 곱하기 10 당 5 마이크로 리터의 DMEM에서 5 번째 세포로 재현탁합니다. 그런 다음 집게로 DMEM 침지에서 비계를 제거하고 6웰 플레이트의 뚜껑에 놓습니다. 뚜껑에서 골격을 들어 올려 과도한 DMEM 방울을 남깁니다.

비계를 새롭고 건조한 위치에 다시 뚜껑에 놓습니다. 3-5회 반복합니다. 그런 다음 부분적으로 건조된 비계를 파종을 위해 새 6웰 플레이트에 넣습니다.

부분적으로 건조된 스캐폴드는 최적의 세포 파스팅 결과를 제공합니다. 골격이 너무 젖으면 세포가 골격에서 미끄러져 아래 플레이트에 달라붙습니다. 골격이 너무 건조하면 액적이 전체 골격에 퍼지지 않아 초기 세포 분포가 불량해집니다.

피펫을 사용하여 MSC 튜브를 부드럽게 혼합하여 현탁액을 균질화하는데, 일부 세포가 바닥에 가라앉았을 수 있기 때문입니다. 갓 혼합된 MSC 현탁액 2.5마이크로리터를 골격에 직접 천천히 피펫팅하여 골격 상단에 작은 물방울을 만듭니다. 세포 방울의 급격한 증발을 방지하기 위해 각 웰의 가장자리에 300마이크로리터의 DMEM을 추가합니다.

섭씨 37도에서 30분 동안 배양하여 세포가 골격에 부착되도록 합니다. 배양 후 집게를 사용하여 웰 플레이트에서 골격을 부드럽게 뒤집습니다. 2.5마이크로리터의 갓 혼합된 MSC 현탁액을 파종하여 골격당 파종된 5번째 세포에 총 5배 10을 제공합니다.

세포가 골격에 부착될 수 있도록 30분 동안 배양한 후 6웰 플레이트의 각 웰에 2밀리리터를 추가하여 DMEM의 골격을 덮습니다. 미디어가 그 아래로 흐르도록 스캐폴드를 부드럽게 들어 올립니다. 이 상태에서 섭씨 37도에서 이식 수술 전 48시간 동안 배양합니다.

형광 해부 실체현미경의 무대에 입체식 프레임을 배치하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 이소플루란 노즈 콘 어댑터를 통해 지속적인 흡입 마취 공급으로 마취된 마우스를 정위 프레임에 고정합니다. 발열 패드로 체온을 유지하십시오.

각막의 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 바르십시오. 그런 다음 두피의 절개 부위를 알코올 3개와 베타딘 물티슈 3개로 소독합니다. 각 팔다리에 발가락 핀치 반사 검사를 수행하고 음성 반응을 확인하여 적절한 마취를 확인합니다.

집게를 사용하여 두피를 꼬집고 부드럽게 들어 올립니다. 수술용 가위로 정중선 선형 주부-꼬리 절개를 한 후 PBS로 절개 부위를 세척하고 화장솜 팁 어플리케이터로 원을 그리며 칫솔질로 피하 지방을 제거합니다. 이전에 설정된 두개골 창이 완전히 보이도록 피부를 정렬합니다.

18게이지 바늘을 사용하여 두개골 창 바로 안쪽의 경막을 부드럽게 뚫습니다. 절개 부위가 창 내부를 완전히 따라갈 때까지 반복합니다. 미세한 집게를 사용하여 경막을 벗겨내어 경막을 제거하면 기저에 있는 실질과 종양이 드러납니다.

그런 다음 실내 조명을 어둡게 하고 실체 현미경 형광 모드를 켭니다. U87 mCherry 및 반딧불이 루시퍼라제 발현 종양을 찾습니다. 200마이크로리터 피펫 팁을 진공 펌프의 튜빙 끝에 로드합니다.

그런 다음 진공 펌프를 켭니다. 신호가 남지 않을 때까지 형광 조직을 부드럽게 흡인하여 종양을 절제합니다. 출혈을 조절하려면 차가운 PBS로 세척하고 면 팁 어플리케이터로 일정한 압력을 가하십시오.

식염수, 면 팁 어플리케이터를 사용한 일정한 압력 및/또는 SURGICEL과 같은 지혈제를 조합하여 골격을 이식하기 전에 출혈을 멈춥니다. 적절하게 조절하지 않으면 잠재적으로 위험한 혈종이 형성될 수 있습니다. 절제 후 진공 펌프를 끄고 피펫 팁을 폐기하십시오.

형광을 끄면 실내 조명이 다시 켜집니다. 이식 직전에 MSC 파종된 PLA 스캐폴드를 PBS에 천천히 담궈 원치 않는 매체 및 관련 구성 요소를 제거합니다. 골격을 절제강에 이식합니다.

필요한 경우 1마이크로리터의 피브리노겐과 1마이크로리터의 트롬빈을 추가하여 골격을 제자리에 고정합니다. 경막을 제거하고 두개골 창의 뼈 덮개를 이미 버린 상태에서 피부를 닫고 수술용 접착제를 바르고 상처를 봉합합니다. 흡입된 마취제에서 동물을 제거하고 가열된 표면에서 회복되도록 합니다.

이러한 위상차, 형광 및 결합 이미지는 mCherry 및 반딧불이 루시퍼라제 마커를 발현하기 위해 렌티바이러스 구조로 설계된 U87 암세포를 보여줍니다. 이러한 위상차, 형광 및 결합 이미지는 PLA 스캐폴딩 재료에 파종된 진단용 GFP-Renilla luciferase 또는 치료용 GFP-TRAIL을 발현하도록 조작된 줄기세포의 해당 이미지를 보여줍니다. 이 명시야 및 형광 오버레이 이미지는 종양의 위치를 보여줍니다.

여기에서 잔여 종양 병소가 있는 수술 후 절제강이 보입니다. 이 이미지는 MSC-TRAIL이 파종된 이식된 PLA 스캐폴드를 보여줍니다. 여기에서 사후 뇌 조직이 골격이 겹쳐진 상태에서 볼 수 있습니다.

이 형광 오버레이는 GFP-TRAIL 세포를 강조합니다. 일단 마스터하면 이 기술을 제대로 수행하면 각 마우스에 대해 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 클리닉에서 볼 수 있는 것과 유사하게 마우스에서 마우스로 이루어지는 절제 범위에 내재적 변동이 있을 것이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 뇌종양의 외과적 절제술을 수행하는 방법과 골격 기반 줄기 세포 요법을 포함한 치료 개입에 미치는 영향을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.