조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 Intasomes의 정화

재조합 retroviral integrase와 바이러스 성 DNA 끝을 흉내 낸 DNA 올리고는 intasome로 알려진 복잡 한 효소 활성을 형성할 수 있다. Intasomes 생화학, 구조, 및 키네틱 연구에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 intasomes를 정화 하는 방법을 자세히 설명 합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 생화학적, 구조적 및 동역학 연구에 사용될 수 있는 프로토타입 거품 바이러스 인타솜을 조립하고 정제하는 것입니다. 이 방법은 통합의 역학 및 역학과 같은 레트로바이러스학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이질적인 종 혼합이 아닌 통합 복합체를 격리할 수 있다는 것입니다.

이 방법의 시각적 시연은 최적의 인타솜 수율을 보장하기 위해 통합 복합체의 회수 및 용해가 중요하기 때문에 유익합니다. 시작하려면 1XTEN 완충액, 10 마이크로 몰 올리고 -1 및 10 마이크로 몰 올리고 -2를 1.5 밀리리터의 최종 부피로 결합합니다. 그런 다음, 혼합물 25 마이크로 리터를 60 0.2 밀리리터 중합 효소 변화 반응 튜브로 분취합니다.

텍스트 프로토콜에 나열된 시간과 온도로 thermocycler를 사용하여 DNA를 어닐링합니다. 반응 후 60개 튜브 모두의 어닐링 반응을 결합합니다. 그런 다음 0.5 밀리리터 3 킬로달톤 분자량 차단 초원심 필터 농축 단위 2개의 500 마이크로리터를 로드합니다.

마이크로 원심분리기에서 원심분리에 의해 어닐링된 바이러스 DNA를 14, 000회 g로 실온에서 10분 동안 농축합니다. 플로우 스루(flow through)를 폐기한 후 나머지 어닐링된 바이러스 DNA 250마이크로리터를 각 필터 장치에 추가합니다. 약 50마이크로리터가 남을 때까지 회전을 반복하고 흐름을 버립니다.

그런 다음 450마이크로리터의 TE로 세 번 세척하여 샘플을 TE 버퍼로 교환합니다. 완충액 교환 후 필터 장치를 뒤집고 실온에서 2분 동안 1000회 g으로 회전합니다. 각 여과 장치의 최종 잔류 부피는 약 50마이크로리터여야 합니다. 잔류물을 결합하여 1.5ml 나사 캡 튜브로 옮깁니다.

마지막으로 바이러스 DNA의 260나노미터 자외선 흡수도를 측정하여 DNA 농도를 계산합니다. 인타솜을 조립하기 위해 50 밀리몰 비스-트리스 프로판 pH 7.5, 500 밀리몰 염화나트륨, 120 마이크로몰 PFV 인테그라제 및 50 마이크로몰 바이러스 DNA를 총 150 마이크로리터 부피에 결합합니다. 직경 10mm, 분자량 차단 투석 튜브 6-8개, 10cm 길이의 조각과 관련 클립을 이중 증류수 또는 사용 가능한 가장 높은 순도의 물로 세척합니다.

튜브의 한쪽 끝을 끼우고 1-2mm의 헹굼 버퍼로 투석 튜브 내부를 세 번 헹굽니다. 피펫과 얇은 젤 로딩 팁으로 헹굼 버퍼를 최대한 많이 제거합니다. 그런 다음 피펫과 얇은 겔 로딩 팁을 사용하여 intasome 어셈블리를 투석 튜브로 옮깁니다.

어셈블리가 투석 튜브의 바닥으로 직접 배출되었는지 확인하십시오. 투석 튜브의 열린 끝을 잘라 튜브 내부에 유입되는 공기의 양을 최소화합니다. 그런 다음 튜브를 투석 버퍼에 넣습니다.

튜브가 회전하지만 소용돌이가 되지 않도록 부드러운 저어주기로 밤새 투석합니다. 투석 튜브가 물에 잠겨 있고 움직일 수 있는지 확인하십시오. 약 1시간 후 침전물이 튜브 내부에서 볼 수 있어야 합니다.

깨끗한 표면에서 새 면도기 또는 메스 날로 200마이크로리터 팁 끝에서 2-4밀리리터를 제거하여 두 개의 넓은 구멍 피펫 팁을 준비합니다. 투석 버퍼에서 투석 튜브를 제거합니다. 인타솜 샘플의 희석을 방지하려면 클립 근처의 튜브 끝에 남아 있을 수 있는 투석 버퍼가 있는 경우 작은 피펫 팁이 있는 마이크로피펫을 사용하여 과도한 투석 버퍼를 제거합니다.

투석 튜브의 이 끝에서 클립을 제거합니다. 어셈블리를 복구 할 때 가능한 한 많은 용액을 수집하고 침전시키는 것이 중요합니다. 넓은 구멍의 프로펫 팁을 사용하여 투석 튜브 내부의 침전물을 포함한 샘플을 얼음 위의 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

회수된 물질의 총 부피를 기록하십시오. 총 부피는 일반적으로 약 140마이크로리터입니다. 침전물이 있는 샘플은 200밀리몰의 염화나트륨입니다.

적절한 부피의 스톡 5몰 염화나트륨 용액을 추가하여 소금을 최종 농도인 320밀리몰 염화나트륨으로 증가시킵니다. 샘플이 담긴 얼음 양동이를 섭씨 4도의 냉장실로 옮깁니다. 넓은 구멍의 피펫 팁을 사용하여 피펫팅으로 침전물을 다시 현탁시키고 용해시킵니다.

최소 1시간 동안 20분마다 반복합니다. 침전물의 대부분은 용액으로 들어가야 합니다. 인타좀을 정제하려면 가교 결합된 아가로스 크기 배제 크로마토그래피 또는 SEC 컬럼을 분당 0.4밀리리터의 유속으로 SEC 러닝 버퍼와 평형

14, 000 번 g의 microfuge에서 intasome 샘플을 섭씨 4도에서 10 분 동안 원심분리하여 잔류 침전물을 펠릿화합니다. 상등액을 조심스럽게 제거한 후 200마이크로리터 주입 루프에 로드합니다. SEC 열에 샘플을 적용합니다.

25 밀리리터의 SEC 러닝 버퍼로 용리하고 270 마이크로리터의 분획 95개를 수집합니다. SEC 크로마토그램에 3개의 A280 및 A260 피크가 표시되는 것을 관찰합니다. 15마이크로리터의 최종 반응 부피에서 반응 완충액에 있는 50나노그램의 3킬로베이스 슈퍼 코일 플라즈마 DNA에 각 인타솜 피크 분율 2마이크로리터를 결합합니다.

또한 PFV 인타솜이 첨가되지 않은 음성 대조군을 포함합니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 0.75 마이크로리터의 proteinase K와 0.75 마이크로리터의 SDS로 반응을 중지합니다.

그런 다음 섭씨 55도에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 다음으로, 각 통합 반응에 50% 글리세롤 3마이크로리터를 추가합니다. 전체 반응 부피를 부피 아가로스 겔당 1% 중량으로 로드합니다.

또한 10킬로베이스 DNA 크기 마커 1마이크로리터를 샘플의 양쪽에 있는 레인에 로드합니다. 바깥쪽 차선에서 6마이크로리터의 주황색 G 염료를 로드합니다. 주변 온도에서 1시간 동안 또는 주황색 G 염료 전면이 젤 끝에 도달할 때까지 일정한 전압, 센티미터당 10볼트에서 젤을 실행합니다.

즉시 에티듐 브로마이드를 검출하도록 설정된 형광 스캐너로 아가로스 겔을 이미지화합니다. 이 이미지는 3킬로베이스에서 실제 크기로 실행되는 대역으로 통합 상태를 보여주어야 합니다. 이미징 소프트웨어로 각 레인의 대역을 정량화한 후, 가장 일치된 적분 활성을 가진 분획을 선택합니다.

각 분획을 5마이크로리터 분취량으로 분포시킵니다. 마지막으로, 부분 표본을 섭씨 영하 80도에서 보관하기 전에 액체 질소에 스냅 동결합니다. PFV 인타솜 어셈블리 정제의 대표적인 크로마토그램이 표시됩니다.

세 개의 봉우리가 보입니다. 중앙 피크는 올바르게 조립된 인타솜과 관련이 있습니다. 중앙 크로마토그래피 피크의 분수로 표시되는 적분 효율이 표시됩니다.

인타솜은 동결 및 해동이 없는 활성과 동결 및 해동과 함께 활성을 테스트했습니다. 동결 및 해동은 통합 반응 생성물의 에티듐 브로마이드 염색 아그라오스 겔에서 차이를 나타내지 않았습니다. 여기에서는 초코일 플라스비드, 조화 통합 산물, 반쪽 시력 통합 산물 및 미반응 바이러스 DNA가 표시됩니다.

에티듐 브로마이드 이미지로부터 적분 효율을 정량화하면 동결 및 해동 후 적분 활성의 손실이 없음을 확인할 수 있습니다. 이를 통해 장기간 보관할 수 있습니다. 표지 분자와 위치는 PFV 인타좀 어셈블리의 효율성에 영향을 미칩니다.

라벨링되지 않은 인타솜과 내부 Cy5 라벨은 동등한 조립 효율을 나타냅니다. 그러나 최종 라벨 Cy5 또는 비오틴은 조립 효율을 감소시킵니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 이틀 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차에 따라 생화학 및 단일 분자 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 통합, 역학 및 역학에 관한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 PFV 인타좀을 조립, 정제 및 기능적으로 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.