Name: 조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 Intasomes의 정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 학습하세요 프로토타입 거품 바이러스 인타솜의 조립 및 정화 방법을 통해 생화학적, 구조적, 동역학적 연구를 수행하는 기술을 익히세요. 이 방법은 레트로바이러스학 분야에서 통합 메커니즘과 역학을 이해하는 데 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 작품은 NIH AI099854 및 AI126742 키에 의해 지원 되었다.

1. 어 닐 링 vDNA의
<ol><li>결합 1 X 10 버퍼 (10 X 10 재고: 100 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 10 mM EDTA), 10 µ M (5' 3' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG, 100 µ M 재고), 올리고 1과 10 µ M 1.5 mL의 최종 볼륨에 올리고 2 (5' 3' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA, 100 µ M 재고) . Aliquot 25 µ L 60 0.2 mL 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 튜브로. 참고: 응용 프로그램에 따라 올리고 fluorophores 또는 5'-끝에 올리고 2의 또는 태그 기본 13 5'-끝 올리고 1에서 내부 아미노 T으로 수정할 수 있습니다. 수정 된 올리고 어 닐 링 전에 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 정화 한다. 우리는 intasome 어셈블리 효율을 10 배 감소 5'-끝 Cy3 또는 Cy5 fluorophore의 라벨 올리고 2 나타났습니다. 내부 fluorophore 라벨 어셈블리 효율을 감소 하지 않습니다.</li>
	<li>다음 시간과 온도 thermocycler를 사용 하 여 anneal: 1에서 99 주기 94.0 ˚C 3 분에 주기 (94.0 ˚C 1 분, 93.6 ˚C 1 분) 주기 당 0.8 ˚C 두 온도 감소 (마지막 주기는 14.8 ˚C 1 분, 14.4 ˚C 1 분) 4.0 ˚C에 저장 하 고.</li>
	<li>모든 60 튜브에서 어 닐 링 반응 결합. 2 0.5 mL 3 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) ultracentrifugal 필터 농도 단위 500 µ L을 로드 합니다. 실 온 (RT)에서 10 분 동안 14000 x g에서 microcentrifuge 원심 분리에 의해 단련 된 vDNA을 집중 한다. 참고: retentate 볼륨 각 농도 단위 µ L ~ 50 이어야 한다.</li>
	<li>삭제를 통해 흐름. 각 필터 단위를 나머지 단련된 vDNA의 250 µ L를 추가 합니다. 스핀을 반복 하 고 삭제를 통해 흐름. 450 µ L 테로 세 번 세척 하 여 테 버퍼 (10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA)에 exchange를 버퍼링 합니다.</li>
	<li>필터 장치 및 실시간에 2 분 동안 1000 x g에서 스핀 반전 각 필터 단위에 대 한 최종 retentate 볼륨 ~ 50 µ L. retentates과 1.5 mL 스크류 캡 튜브에 결합 해야 합니다.</li>
	<li>vDNA의 260 nm 자외선 (UV) 흡 광도 측정 합니다. 마지막 어 금 니 DNA 농도 계산 하기 위해이 값을 사용 합니다. 이 vDNA의 소멸 계수 (ε260) 622,803 c m-1 M-1 이며 그 분자량은-20 ˚C에 23,972 검사 저장소.</li>
</ol>2. Intasome 어셈블리
<ol><li>가능 하면 변수 온도와 작은 방에 intasome 어셈블리를 수행 합니다. 약 18-22 ˚C를 온도 조정 합니다. 참고: 우리의 경험 4 ˚C에서 intasome 어셈블리 비효율적입니다.</li>
	<li>저 어 접시에 볶음 바 2 리터 비 커에 투 석 버퍼 (20 mM 두번째-트리 스 프로 판, pH 7.5, 200 m NaCl, 2 m m dithiothreitol (DTT), 25 µ M ZnCl2m)의 1 리터를 준비 합니다. 적어도 6 h에 대 한 18-22 ˚C 방에 버퍼 equilibrate</li>
	<li>intasomes를, 50 mM 두번째-트리 스 프로 판, pH 7.5, 500 mM NaCl, 120 µ M PFV에, 및 150 µ L의 전체 볼륨에 50 µ M vDNA 결합. 참고: PFV에 오염 nuclease 활동7,8의 무료 되어야 합니다. PFV에서 농도 경우 너무 희석 120 µ M에서 150 µ L 볼륨에 맞게 다음 200 µ L 최종 볼륨을 증가 하는 것이 가능 하다. 이 단계는 중요 한 요소는 vDNA (2.4:1) 하에서의 어 금 니 비율을 유지 하 고 충분 한 복잡 한 착 색 인쇄기는 동안 시각화 있습니다.</li>
	<li>10 m m 6-8 kDa MWCO 투 석 튜브와 두 배 증류수 (ddH2O), 또는 높은 순도 물을 사용할 수 있는 클립의 ~ 10 cm 긴 조각을 청소. 튜브의 한쪽 끝을 클립. 참고: 투 석 배관 주의 실험실 공간에서 어떤 가능한 오염 든 지 방지 하기 위해 처리 되어야 합니다.</li>
	<li>투 석 배관 린스 버퍼 (50mm 두번째-트리 스 프로 판, pH 7.5, 500 mM NaCl)의 15 mL를 확인 합니다. 1-2 mL 린스 버퍼와 3 번 투 석 튜브의 내부를 헹 굴. 피 펫과 얇은 젤 팁 로드 가능한 린스 버퍼의 제거.</li>
	<li>필요한 경우 사용 하 여 깨끗 한 면도날 또는 메스 얇은 젤 로드 팁 튜브의 끝에 도달할 수 있도록 투 석 튜브를 잘라.</li>
	<li>피 펫 및 얇은 젤 팁 로드 투 석 튜브에 2.3 단계에서 intasome 어셈블리를 전송. 투 석 배관, 튜브 내에서 도입 하는 공기의 양을 최소화의 오픈 엔드 클립. 투 석 버퍼 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>Dialyze 부드러운 교 반 튜브 회전 하지만 소용돌이와 하룻밤 (16-20 h). 투 석 배관 침수 및 모바일 인지 확인 합니다. 약 1 시간 후 튜브 안에 보이는 침전을 관찰 합니다. 참고: Cy3와 Cy5 붙일 표시 vDNA 침전 더 분명 하다. 이것은 끝 표시와 내부적으로 레이블이 형광 vDNA 마찬가지입니다.</li>
</ol>3. Intasome 가용 화
<ol><li>2 준비 넓은 깨끗 한 표면에 새로운 메스 또는 면도칼 블레이드와 2-4 m m 200 µ L 팁의 끝에서 제거 하 여 피 펫 팁을 낳았다. 참고: 도움말 3.3-3.5 단계에서 사용 됩니다.</li>
	<li>투 석 버퍼에서 투 석 튜브를 제거 합니다. 클립 근처 튜빙의 끝에 남아 있을 수 있습니다 투 버퍼 intasome 샘플의 희석을 방지 하기 위해 작은 피 펫 팁는 micropipette을 사용 하 여 모든 초과 투 버퍼를 제거 하. 투 석 튜브의 한쪽 끝에서 클립을 제거 합니다.</li>
	<li>사용 넓은 얼음에 1.5 mL 튜브에 투 석 배관 내부 침전 물의 포함 하 여 샘플을 전송 하려면 3.1 단계에서 피 펫 팁을 낳았다. 참고 복구 된 자료;의 총 볼륨 총 볼륨은 일반적으로 ~ 140 µ L.</li>
	<li>침전 된 샘플은 200 m m NaCl; 320 mM NaCl의 최종 농도에 소금 재고 5 M NaCl 솔루션의 적절 한 볼륨을 추가 하 여 증가. 예를 들어 150 µ L의 샘플을 추가 3.9 µ L 5 M NaCl과 1.1 µ L ddH2O 155 µ L. 전송 얼음 양동이와 마지막 볼륨에 대 한 샘플 4 ˚C 찬 방으로.</li>
	<li>사용 넓은 단계 resuspend를 pipetting으로 침전을 solubilize 3.1에서에서 피 펫 팁을 낳았다. 적어도 1 h. 침전의 대부분 솔루션에가 서 관찰에 대 한 모든 20 분을 반복 합니다. 참고: resuspend 침전에 Pipetting 수 중지 때 명백한 침전 시간 점 사이 더 이상 눈에 띄게 감소. VDNA는 레이블이 또는 내부적으로 분류 때 침전 육안 검사에 따라 ~ 90%로 감소 된다. Cy5 끝 vDNA를 표시, 경우 침전 감소만 ~ 20%; vDNA 라는 fluorophore 엔드와 침전의 대부분 solubilize 하지 것 이다. 효과적으로 solubilized 침전의 양 변수 이며, 실험적으로 결정 되어야 합니다.</li>
</ol>4. Intasome 정화
<ol><li>버퍼 (20 mM 두번째-트리 스 프로 판, pH 7.5, 320 mM NaCl, 10% 글리세롤)를 실행 하는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)의 250 mL를 준비 합니다. 살 균 필터 버퍼 0.2 µ m와 단위 필터와 4 ˚C에 저장 합니다. 참고: 모든 정화 단계 4 ˚C 차가운 방에 수행 됩니다.</li>
	<li>복사해올된 agarose 초 열 equilibrate (직경 = 10 밀리미터; 길이 = 300 mm; 볼륨 침대 24 mL =; 샘플 량 = 25-500 µ L, 최대 압력 = 1.5 MPa; 제외 제한 = 4 x 107 다; 분자 무게 분리 5, 5000 kDa 사이의 참조 테이블 매트 erials) 0.4 mL/min의 유량에서 초 실행 버퍼. 참고:이 정화 그들이 효과적으로 Superose 12 10/300 GL 또는 Superose 6 증가 등 44 kDa에서 300 kDa 분리 수 있다면 다른 크기 제외 열에 적응 시킬 수 있습니다. Superose 12 10/300 GL는 낮은 해상도, 봉우리의 더 많은 중복을 선도. 반대로, Superose 6 증가 높은 해상도 하 고 더 나은 분리를 제공 합니다.</li>
	<li>펠 렛의 모든 나머지 침전을 4 ˚C에서 10 분 동안 14000 x g에서 microfuge에서 intasome 샘플 원심 조심 스럽게 제거는 상쾌한. 200 µ L 주입 루프 (~ 200 μ를 저장할 수 있는 튜브) 상쾌한을 로드 합니다. SEC 열에 샘플을 적용 됩니다. 참고: 작은 로드 볼륨 수 초에 의해 더 큰 해상도</li>
	<li>25 mL 초 실행 버퍼 및 수집 270 µ L. 95 분수와 함께 elute 관찰 SEC 크로마 세 A280/A260 봉우리 (그림 1)를 표시 합니다. 참고: 첫 번째 집계 (~9.0-11.5 mL 차입), PFV tetramer intasome 피크 (~12.0-14.75 mL 차입) 및 무료 vDNA 피크 (~15.0-18.0 mL)와 모노 머 PFV에 이어야 한다.</li>
</ol>5. 통합 가닥 전송 분석 결과, 분수 선택 및 저장
<ol><li>각 intasome 피크 분수 및 50의 2 µ L 결합 ng 3 kb supercoiled 플라스 미드 DNA (재고 농도 50 ng / µ L) 15 µ L의 최종 반응 볼륨에서 반응 버퍼 (10 mM tris 두번째 프로 판, pH 7.5, 110 m NaCl, 5mm MgSO4, 4 µ M ZnCl2, 10 m DTT m m)에. 5 분 동안 37 ˚C에서 품 어.</li>
	<li>아니 추가 PFV intasome와 부정적인 컨트롤을 포함 합니다. (20 mg/mL 재고 솔루션) 0.75 µ L 성분 K와 반응 및 0.75 µ L SDS 중지 (10% 주식 솔루션). 1 헤 게 샘플 나중 분석-20 ˚C에서 필요에 따라 55 ˚C에서 품 어. 참고:이 분석 결과 통합 활동의 질적 평가. 각 분수의 intasome 어 금 니 농도이 분석 결과 이전 결정 되지 않습니다. 분수 통합 가닥 전송 분석 결과에 포함 되어 저장 될 수 있다 통합까지 (를 포함 하 여 하룻밤 저장) 얼음에 활동은 확인 되 고 선택한 분수는 aliquoted. 여기 우리는 pMP2, pUC19 파생9를 사용합니다. 우리는 또한 성공적으로 5.4 kb 플라스 미드 pcDNA 3.1을 사용 했습니다. 으로 확인 될 수 있는 모든 플라스 미드 원형, 선형, 편안 하 고 supercoiled 형태의 통합을 위한 대상으로 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>1의 X 태 버퍼 (40 m m 트리 아세테이트, 1 mM EDTA) 0.1 μ g/mL ethidium 평범한 사람 (EtBr, 10 mg/mL 재고 솔루션)10에서 볼륨 (w/v) agarose 젤 당 120 mL 1% 무게를 준비 합니다. Agarose 솔루션을 용 해 하 고 15 cm x 10 cm 젤 캐스팅 쟁반에 부 어. 5 밀리미터 넓은, 0.75 m m 두께 웰 스도 15 잘 빗을 삽입 합니다. 참고: 좁은 우물 1.5 m m 두꺼운 우물에 비해 더 나은 밴드 해상도 얻을.</li>
	<li>허용 주위 온도에서 응고 하 젤. 0.1 μ g/mL EtBr로 1 X 태에서 젤 담가.</li>
	<li>5.2 단계에서 각 통합 반응 3 µ L 50% 글리세롤을 추가 합니다. 전체 반응 볼륨 젤을 로드 합니다. 마커의 10 kb DNA 크기 (150 ng / µ L 재고 농도); 샘플의 양쪽에 차선 1 µ L 로드 즉, DNA 크기 마커 샘플 레인 측면 해야 합니다.</li>
	<li>외부 레인에서 6 µ L 오렌지 G 염료 (0.25% 오렌지 G, 30% 글리세롤)을 로드 합니다. 정 전압, 1 시간, 또는 오렌지 G 염료 전면 젤의 끝에 도달할 때까지 주위 온도에 10 V/cm (100 V)에서 젤을 실행 합니다.</li>
	<li>바로 형광 스캐너 (532 nm 여기, 610 nm 방출 필터) EtBr을 감지로 설정 agarose 젤 이미지. Fluorophore vDNAs 라는 사용 된 경우 또한 해당 fluorophore 설정으로 이미지. 참고: 예를 들어 감지 Cy5 DNA, 633 nm 여기 및 670 nm 방출 필터를 사용 하 여 이미지 표시. 공동된 통합 제품 (CI, 선형 DNA) ~ 3 kb 크기 true로 실행 한다, unreacted supercoiled 플라스 미드 (SC) 빠른 (~ 2 kb), 실행 해야 하 고 반 사이트 통합 제품 (HSI, 편안한 원형 DNA) 느린 (~3.5 kb)를 실행 해야 합니다. Unreacted vDNA ~ 40 크기 true로 실행 해야 혈압.</li>
	<li>이미징 소프트웨어7각 레인에서 밴드를 계량. CI, HSI, 또는 SC; 각 레인에 DNA의 분수를 계산 vDNA이이 계산에 포함 되지 않습니다. 참고: 통합 효율성, 또는 선형 제품으로 변환 하는 SC의 분수 3 밴드 (HSI + CI + SC)의 총 픽셀 볼륨에 의해 공동된 통합 제품 (CI)의 픽셀 볼륨을 나누어 계산 했다. Intasomes 라는 fluorophore 있다면, HSI와 CI 제품 형광으로 quantitated 또한 수 있습니다.</li>
	<li>가장 공동 통합 활동 분수를 선택 합니다. 참고: 우리의 경험에서 공동으로 행 한 피크 통합 활동 tetrameric PFV intasomes로 식별 단백질 피크와 일치 합니다. 이 분수의 각각의 A280 을 측정 하 고 최종 intasome 농도 계산. Ε280 의 야생 PFV에 여기에 설명 된 두 개의 vDNAs tetramer에 대 한 908,339 c m-1M-1 이며 분자 무게는 225.5 kDa. 농도 SEC 크로마 피크로 가닥 전송 분석 결과에 같은 패턴을 따라야 한다.</li>
	<li>5 µ L aliquots 각 분수를 배포 하 고 스냅 액체 질소에서 동결. Aliquots-80 ˚C에 저장 합니다. 저장을 위해 선택 하는 분수는 일반적으로 200-600 nM 사이.</li>
</ol>

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<li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

Retroviral 기능 통합을 수행 하 고 바이러스 성 수명 주기를 계속 하는 바이러스 성 게놈 DNA와 복잡 한 multimeric를 형성 한다. Intasome 당 단위체에의 수는 tetramers, octamers, 또는 가능 하 게 더 높은 순서 multimers11,12,,1314수 있습니다. PFV intasomes는 모방 하는 바이러스 성 게놈 DNA 이중 가닥 DNA 올리고도 재조합 tetramer 종료3. 이러한 intasomes 구조와 동적 연구3,5,13<s...

호스트 게놈으로 바이러스 성 게놈의 통합 모든 레트로 바이러스1의 라이프 사이클에는 필수 단계입니다. 바이러스 성 효소 integrase (IN) catalyzes 호스트 DNA에 바이러스 성 DNA 게놈의 각 끝의 공유 결합. 세포 감염 동안에 통합을 중재 하는 사전 통합 복잡 한의 일부가입니다. 재조합에 더블 좌초 DNA 올리고 흉내 낸 바이러스 성 DNA 끝에 complexed는 대상 DNA 생체 외에서2에 통합을 수행할 수 있습니다. 일반적인 통합 분석 결과 생체 외에서 supercoiled 플라스 미드 DNA 대상으로 사용합니다. 플라스 미드를 모두 바이러스 성 DNA 올리고 (vDNA)의 통합 선형 제품 귀착되 고 공동된 통합 (그림 2A) 이라고 불린다. 통합 분석 결과 생체 외에서 covalently 편안한 원에서 결과 대상 플라스 미드에 참가 한 vDNA와 제품을 얻을 또한 수 있습니다. 이 반 사이트 통합 제품 분석 결과 체 외의 인 것 처럼 보인다.
재조합에 및 vDNA 통합에서 생체 외에서수행할 수 있습니다 하지만 그들은 역학의 연구 또는 통합 복합물의 구조에 대 한 이상적인 약 단위체에 관련 시각화 모호한 것 때. 순화 통합 복합물, 또는 "intasomes," 동적 단일 분자 분석 또는 구조 연구에 필요한 있습니다. PFV에 및 vDNAs 수 있습니다 조립 될 투 석 하 여 상대적으로 높은 소금 농도 버퍼에서 낮은 염 농도3,4. 투 석, 한 침전 동안 양식. 이 침전 물은 투 석에서 제거 되 고 소금 농도 증가. 더 높은 소금 농도 촉진 포함 PFV intasomes solubilizes. intasomes 다음 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 정화 된다. 재조합 프로토 타입 거품 바이러스 (PFV)에 225 µ M5농도에서 솔루션에 단위체로 존재 하기 위하여 보였다. 초 분류 (44.4 kDa) 단위체 PFV와 무료 vDNA (24.0 kDa)에서 효과적으로 tetramer PFV에 및 2 개의 vDNAs를 포함 하는 PFV intasomes (225.5 kDa)를 구분 합니다. PFV intasomes 냉동 수 있습니다 그리고-80 ˚C에 저장의 적어도 6 개월에 대 한 통합 활동을 유지 합니다.
재조합 PFV intasomes 아미노산 대체 또는 잘림 돌연변이 또는 fluorophores 또는 biotin4,6으로 표시 하는 vDNAs에 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 순화 PFV intasomes는 쉽게 DNA에서 생체 외에서supercoiled 플라스 미드 대상으로 통합을 수행합니다. Intasomes과 대량 생 화 확 적인 통합 분석 돌연변이, 억제제, 또는 다른 화학 첨가제에의 효과 테스트할 수 있습니다. Biotinylated intasomes는 핵 산 또는 단백질 선호도 조사를 사용할 수 있습니다. PFV intasomes는 두 vDNA 끝 또는 목표에 intasome 검색을 시각화 하기 위해 총 내부 반사 형광의 가입 사이 시간을 측정 하려면 자기 핀셋에 의해 단일 분자 현미경 분석에 대 한 허용 주위 온도에 기능적 DNA6. 또한, PFV intasomes 구조적으로 먼저 retroviral 통합3분야에 크게 영향을 미치는 특징 이었다.

<table><tbody><tr><td>DNA 올리고머</td><td></td><td>IDT N/A</td><td>맞춤형 DNA 올리고</td></tr><tr><td>트리스 울트라 퓨어</td><td>고지라 정밀 화학 UTS1003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>울트라퓨어 EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL 원심 필터</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z677094-24EA</td><td>3 kDa MWCO</td></tr><tr><td>DTT</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS 프로판,>=99.0% (적정)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6755-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>겔-로딩 팁, 1 - 200 &mu; L</td><td>Corning</td><td>CLS4853-400EA</td><td></td></tr><tr><td>면도날; 단일 날; 100/pk.; 100개 팩</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>멸균 일회용 필터 유닛 PES 멤브레인 > 250mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>투석 튜빙 클립</td><td>Spectrum Labs</td><td>132734</td><td></td></tr><tr><td>6-8 kDa 10 mm 투석 튜빙</td><td>Spectrum Medical</td><td>132645</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17517201</td><td></td></tr><tr><td>고음질 표준 아가로스</td><td>AGTC Bioproducts</td><td>AG500D1</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>오렌지 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>0-267</td><td></td></tr><tr><td>Hyladder 10kb, 500</td>레인 <td>Denville Scientific</td><td>CB4225-4</td><td></td></tr></tbody></table>

조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 intasomes의 정화

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A 기능 및 레트로 바이러스 라이프 사이클의 필요한 단계를 정의 하는 것은 주인 게놈으로 바이러스 성 게놈의 통합. 모든 레트로 바이러스는 호스트 DNA 가닥 전송으로 알려진 바이러스의 공유 결합 catalyzes integrase (IN) 효소를 인코딩합니다. 통합은 모델링 된 시험관에 재조합 retroviral in 되며 DNA 올리고 바이러스 성 게놈의 끝을 흉내 낸 수 있습니다. 더 밀접 하 게 통합 반응에서 발생 하 비보에, 통합을 정리 하기 위해 단지 감소 된 소금 농도 버퍼에서 투 석 하 여 재조합 및 합성 올리고에서 조립 된다. intasome 라는 통합 복잡 한, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 순화 될 수 있습니다. 프로토 타입 거품 바이러스 (PFV)의 경우는 intasome에 tetramer 및 2 개의 DNA 올리고 이며 단위체에 무료 올리고 DNA 머에서 쉽게 분리 된다. PFV intasomes의 통합 효율성 다양 한 역학을 보다 잘 이해 하려면 실험 조건 및 retroviral 통합의 역학 분석 될 수 있습니다.

PFV intasomes 재조합 및 vDNA에서 조립 된다. 조립 후 intasomes 초 (그림 1)에 의해 정화 된다. 각 분수의 통합 활동을 supercoiled DNA 대상과 agarose 젤 전기 이동 법 (그림 2)와 분석 이다. 이 젤은 감지 EtBr (fluorophore, fluorophore 표시 vDNA 사용 하는 경우)로 설정 하는 형광 스캐너와 몇 군데. 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여, 밴드 픽셀 볼륨 통합 효율성 (그림 3)를 계산 하기 위해 사용할 수 있습니다. 높은 통합 효율성과 분수는 나중에 사용에 대 한 고정 스냅. 냉동된 분수 통합 활동 (그림 4), 조립된 intasomes의 장기 저장에 대 한 수 있도록 유지 합니다...

재조합 retroviral integrase와 바이러스 성 DNA 끝을 흉내 낸 DNA 올리고는 intasome로 알려진 복잡 한 효소 활성을 형성할 수 있다. Intasomes 생화학, 구조, 및 키네틱 연구에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 intasomes를 정화 하는 방법을 자세히 설명 합니다.

조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 Intasomes의 정화

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

이 절차의 전반적인 목표는 생화학적, 구조적 및 동역학 연구에 사용될 수 있는 프로토타입 거품 바이러스 인타솜을 조립하고 정제하는 것입니다. 이 방법은 통합의 역학 및 역학과 같은 레트로바이러스학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이질적인 종 혼합이 아닌 통합 복합체를 격리할 수 있다는 것입니다.이 방법의 시각적 시연은 최적의 인타솜 수율을 보장하기 위해 통합 복합체의 회수 및 용해가 중요하기 때문에 유익합니다. 시작하려면 1XTEN 완충액, 10 마이크로 몰 올리고 -1 및 10 마이크로 몰 올리고 -2를 1.5 밀리리터의 최종 부피로 결합합니다. 그런 다음, 혼합물 25 마이크로 리터를 60 0.2 밀리리터 중합 효소 변화 반응 튜브로 분취합니다.텍스트 프로토콜에 나열된 시간과 온도로 thermocycler를 사용하여 DNA를 어닐링합니다. 반응 후 60개 튜브 모두의 어닐링 반응을 결합합니다. 그런 다음 0.5 밀리리터 3 킬로달톤 분자량 차단 초원심 필터 농축 단위 2개의 500 마이크로리터를 로드합니다.마이크로 원심분리기에서 원심분리에 의해 어닐링된 바이러스 DNA를 14, 000회 g로 실온에서 10분 동안 농축합니다. 플로우 스루(flow through)를 폐기한 후 나머지 어닐링된 바이러스 DNA 250마이크로리터를 각 필터 장치에 추가합니다. 약 50마이크로리터가 남을 때까지 회전을 반복하고 흐름을 버립니다.그런 다음 450마이크로리터의 TE로 세 번 세척하여 샘플을 TE 버퍼로 교환합니다. 완충액 교환 후 필터 장치를 뒤집고 실온에서 2분 동안 1000회 g으로 회전합니다. 각 여과 장치의 최종 잔류 부피는 약 50마이크로리터여야 합니다. 잔류물을 결합하여 1.5ml 나사 캡 튜브로 옮깁니다.마지막으로 바이러스 DNA의 260나노미터 자외선 흡수도를 측정하여 DNA 농도를 계산합니다. 인타솜을 조립하기 위해 50 밀리몰 비스-트리스 프로판 pH 7.5, 500 밀리몰 염화나트륨, 120 마이크로몰 PFV 인테그라제 및 50 마이크로몰 바이러스 DNA를 총 150 마이크로리터 부피에 결합합니다. 직경 10mm, 분자량 차단 투석 튜브 6-8개, 10cm 길이의 조각과 관련 클립을 이중 증류수 또는 사용 가능한 가장 높은 순도의 물로 세척합니다.튜브의 한쪽 끝을 끼우고 1-2mm의 헹굼 버퍼로 투석 튜브 내부를 세 번 헹굽니다. 피펫과 얇은 젤 로딩 팁으로 헹굼 버퍼를 최대한 많이 제거합니다. 그런 다음 피펫과 얇은 겔 로딩 팁을 사용하여 intasome 어셈블리를 투석 튜브로 옮깁니다.어셈블리가 투석 튜브의 바닥으로 직접 배출되었는지 확인하십시오. 투석 튜브의 열린 끝을 잘라 튜브 내부에 유입되는 공기의 양을 최소화합니다. 그런 다음 튜브를 투석 버퍼에 넣습니다.튜브가 회전하지만 소용돌이가 되지 않도록 부드러운 저어주기로 밤새 투석합니다. 투석 튜브가 물에 잠겨 있고 움직일 수 있는지 확인하십시오. 약 1시간 후 침전물이 튜브 내부에서 볼 수 있어야 합니다.깨끗한 표면에서 새 면도기 또는 메스 날로 200마이크로리터 팁 끝에서 2-4밀리리터를 제거하여 두 개의 넓은 구멍 피펫 팁을 준비합니다. 투석 버퍼에서 투석 튜브를 제거합니다. 인타솜 샘플의 희석을 방지하려면 클립 근처의 튜브 끝에 남아 있을 수 있는 투석 버퍼가 있는 경우 작은 피펫 팁이 있는 마이크로피펫을 사용하여 과도한 투석 버퍼를 제거합니다.투석 튜브의 이 끝에서 클립을 제거합니다. 어셈블리를 복구 할 때 가능한 한 많은 용액을 수집하고 침전시키는 것이 중요합니다. 넓은 구멍의 프로펫 팁을 사용하여 투석 튜브 내부의 침전물을 포함한 샘플을 얼음 위의 1.5ml 튜브로 옮깁니다.회수된 물질의 총 부피를 기록하십시오. 총 부피는 일반적으로 약 140마이크로리터입니다. 침전물이 있는 샘플은 200밀리몰의 염화나트륨입니다.적절한 부피의 스톡 5몰 염화나트륨 용액을 추가하여 소금을 최종 농도인 320밀리몰 염화나트륨으로 증가시킵니다. 샘플이 담긴 얼음 양동이를 섭씨 4도의 냉장실로 옮깁니다. 넓은 구멍의 피펫 팁을 사용하여 피펫팅으로 침전물을 다시 현탁시키고 용해시킵니다.최소 1시간 동안 20분마다 반복합니다. 침전물의 대부분은 용액으로 들어가야 합니다. 인타좀을 정제하려면 가교 결합된 아가로스 크기 배제 크로마토그래피 또는 SEC 컬럼을 분당 0.4밀리리터의 유속으로 SEC 러닝 버퍼와 평형화합니다.14, 000 번 g의 microfuge에서 intasome 샘플을 섭씨 4도에서 10 분 동안 원심분리하여 잔류 침전물을 펠릿화합니다. 상등액을 조심스럽게 제거한 후 200마이크로리터 주입 루프에 로드합니다. SEC 열에 샘플을 적용합니다.25 밀리리터의 SEC 러닝 버퍼로 용리하고 270 마이크로리터의 분획 95개를 수집합니다. SEC 크로마토그램에 3개의 A280 및 A260 피크가 표시되는 것을 관찰합니다. 15마이크로리터의 최종 반응 부피에서 반응 완충액에 있는 50나노그램의 3킬로베이스 슈퍼 코일 플라즈마 DNA에 각 인타솜 피크 분율 2마이크로리터를 결합합니다.또한 PFV 인타솜이 첨가되지 않은 음성 대조군을 포함합니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 0.75 마이크로리터의 proteinase K와 0.75 마이크로리터의 SDS로 반응을 중지합니다.그런 다음 섭씨 55도에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 다음으로, 각 통합 반응에 50% 글리세롤 3마이크로리터를 추가합니다. 전체 반응 부피를 부피 아가로스 겔당 1% 중량으로 로드합니다.또한 10킬로베이스 DNA 크기 마커 1마이크로리터를 샘플의 양쪽에 있는 레인에 로드합니다. 바깥쪽 차선에서 6마이크로리터의 주황색 G 염료를 로드합니다. 주변 온도에서 1시간 동안 또는 주황색 G 염료 전면이 젤 끝에 도달할 때까지 일정한 전압, 센티미터당 10볼트에서 젤을 실행합니다.즉시 에티듐 브로마이드를 검출하도록 설정된 형광 스캐너로 아가로스 겔을 이미지화합니다. 이 이미지는 3킬로베이스에서 실제 크기로 실행되는 대역으로 통합 상태를 보여주어야 합니다. 이미징 소프트웨어로 각 레인의 대역을 정량화한 후, 가장 일치된 적분 활성을 가진 분획을 선택합니다.각 분획을 5마이크로리터 분취량으로 분포시킵니다. 마지막으로, 부분 표본을 섭씨 영하 80도에서 보관하기 전에 액체 질소에 스냅 동결합니다. PFV 인타솜 어셈블리 정제의 대표적인 크로마토그램이 표시됩니다.세 개의 봉우리가 보입니다. 중앙 피크는 올바르게 조립된 인타솜과 관련이 있습니다. 중앙 크로마토그래피 피크의 분수로 표시되는 적분 효율이 표시됩니다.인타솜은 동결 및 해동이 없는 활성과 동결 및 해동과 함께 활성을 테스트했습니다. 동결 및 해동은 통합 반응 생성물의 에티듐 브로마이드 염색 아그라오스 겔에서 차이를 나타내지 않았습니다. 여기에서는 초코일 플라스비드, 조화 통합 산물, 반쪽 시력 통합 산물 및 미반응 바이러스 DNA가 표시됩니다.에티듐 브로마이드 이미지로부터 적분 효율을 정량화하면 동결 및 해동 후 적분 활성의 손실이 없음을 확인할 수 있습니다. 이를 통해 장기간 보관할 수 있습니다. 표지 분자와 위치는 PFV 인타좀 어셈블리의 효율성에 영향을 미칩니다.라벨링되지 않은 인타솜과 내부 Cy5 라벨은 동등한 조립 효율을 나타냅니다. 그러나 최종 라벨 Cy5 또는 비오틴은 조립 효율을 감소시킵니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 이틀 안에 완료할 수 있습니다.이 절차에 따라 생화학 및 단일 분자 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 통합, 역학 및 역학에 관한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 PFV 인타좀을 조립, 정제 및 기능적으로 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

를 통해 식물 세포에 여러 바이러스 구성 요소의 배포를 동기화하는 간단하고 효율적이며 강력한...

간편하고 강력한 생체내에서과 체외에서</em바이러스 조립 유학을위한> 접근법

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엘라스틴과 같은 단백질을 체외에서 정의된 수분자 구조 및 화물 캡슐화로 조립하도록 지시

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호흡기 싱크량 바이러스의 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드의 생성 및 조립

이 원고에서는 F-actin 세포 골격을 거대한 unilamellar 지질 소포 (리포솜이라고도 함)로 캡슐화하는 실험 기술과 리포솜 막의 내부 전단지에 피질 생모방 F- 액틴 층을 형성하는 방법을 보여줍니다.

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

학습하세요 프로토타입 거품 바이러스 인타솜의 조립 및 정화 방법을 통해 생화학적, 구조적, 동역학적 연구를 수행하는 기술을 익히세요. 이 방법은 레트로바이러스학 분야에서 통합 메커니즘과 역학을 이해하는 데 중요한 통찰을 제공합니다.

조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 Intasomes의 정화

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