Name: Immunophenotyping Orthotopic Homograft (Syngeneic) Murine 기본 KPC 췌 장 Ductal 선 암의 Cytometry로의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 배우세요 췌장관상선암(PDAC) 마우스 동종이식 모델의 면역표현형 분석 방법을. FACS를 활용하여 종양 면역미세환경을 프로파일링하고 면역세포 표지자를 식별하는 기술을 익혀 종양 면역 연구에 활용하세요.

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저자는 박사 조디 Barbeau-중요 한 읽기 및 원고, 편집에 대 한 감사 드리고 그리고 삽화를 디자인 하기 위한 랄 프 마누엘을 감사 합니다. 저자는 또한 크라운 생명 종양 면역-종양학 바이오 마커 팀과 그들의 기술 노력에 대 한 종양 Vivo에서 팀을 감사 하 고 싶습니다.

모든 프로토콜 및 목 또는 동물의 사용 및 관리 절차 검토 하 크라운 생명 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 연구의 행위 사전 승인 합니다. 관심과 동물의 사용 일반적으로 실시 됩니다 AAALAC (평가 및 실험 동물 관리 인증 협회) 국제 지침에 따라 관리를 사용 하 여 실험실 동물의, 국가 연구 가이드에 보고 위원회 (2011 년). 모든 동물 실험 절차 SPF (특정 병원 체 무료) 시설에서 무 균 조건 하에서 것 및에 따라 가이드와 함께 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 (예: 다른 정부 기관에서 실시 국가 학회 건강의). 프로토콜 시설 기관에서 동물 실험의 윤리 위원회에 의해 승인 될 필요가 있을 것 이다 (예: 기관 IACUC 위원회).
1입니다. 종양이 식 위한 준비
<ol><li>
동물 주택
	<ol>
<li>상업적인 사육 업체에서 일반 C57BL/6 마우스를 가져옵니다.</li>
		<li>다음과 같은 조건에서 개별 통풍이 장에 하우스 마우스 (5): 온도: 20-26 ° C; 습도 30-70%; 사이클을 조명: 12 h 빛 및 어두운 12 h.</li>
		<li>매주 변경 사용 옥수수 옥수수 속 침구입니다.</li>
		<li>다이어트에 대 한 전체 연구 기간 동안 방사선 살 균 건조과 립 식품을 제공 합니다.</li>
		<li>물, 동물 식 수 살 균을 무료로 이용할을 제공 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
기증자 종양 조각 준비
	<ol>
<li>종양-베어링 기증자 쥐의 캘리퍼스 측정 하 여 균형, 및 종양 볼륨 (TV)를 사용 하 여 무게를 통해 체중 (BW)를 모니터링 하 여 시작 합니다.</li>
		<li>TV 500-1200 m m3에 도달 하면 프로토콜에 의하여 생물 후드에 동물을 안락사.</li>
		<li>Iodophor 면봉을 사용 하 여 종양 주위의 피부를 소독.</li>
		<li>수술로 종양을 제거 (섹션 3에서에서 설명 하는 세부 사항: 검 시 및 종양 수확) PBS의 20 mL를 포함 하는 페 트리 접시에 종양을 배치 (미디어 또는 동물을 euthanizing 이전 4 ° C를 버퍼에 미리 진정).</li>
		<li>오염 혈액이 있는 경우에, 다른 페 트리 접시에 종양을 전송 하 고 PBS 가진 종양을 씻어.</li>
		<li>어떤 여분의 피부, 혈관, 석 회화 및 괴 제거 반으로 종양을 잘라.</li>
		<li>그대로 조각의 종양 선택 및 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브에 그들을 배치 그리고 PBS의 20 mL를 추가 약리학 연구에 대 한 별도 동물 방에 튜브를 전송.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Orthotopic 및 피하 (SC) Engraftment
<ol><li>
SC 접종
	<ol>
<li>잘라 종양 2 mm 직경 조각 각 trocar, SC 주입 또는 나중 orthotopic 주입 (아래 참조)에 1 덩어리를 퍼 팅, 메스를 사용 하 여.</li>
		<li>코 콘 1%에 의해 유지 되는 5 %isoflurane 받는 사람 동물 anesthetize 동물 자신의 righting 반사를 잃고 긴장, 시작 하 고 결국 움직이지 될 것 이다. 마 취의이 깊이에서 그들은 수 있습니다 쉽게 될로 들었습니다 고통 스러운 자극; 마 취 통증 같은 응답 결 석까지를 허용 합니다.</li>
		<li>일단 마 취, 오른쪽 측면 위치에 실험 보드에 쥐를 수정 합니다. 소독 iodophor 면봉, 특히 종양 주변 영역을 사용 하 여 마우스.</li>
		<li>메스, 왼쪽된 측면, 그냥 엉덩이 두개골에 0.5 ~ 1.0 cm 피부 절 개를 만들.</li>
		<li>무딘 집게와 2 ~ 3 센티미터, forelimb 쪽으로 피부 아래 터널.</li>
		<li>Aseptically 매체에서 종양의 한 큐브를 전송 하 고 피하 터널 깊숙한 곳.</li>
		<li>시각적으로 확인 종양 깊은 터널에서 (그리고 피부 절 개에 아닙니다).</li>
		<li>클립을 상처와 상처를 닫습니다.</li>
		<li>그들은 sternal recumbence를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 동물 게시물 접종을 모니터링 합니다. 마 취에서 그들의 전체 복구 후 그들의 감 금 소에 다시 동물을 반환 합니다. 마 취 로그를 완료 하 고 동물 건강 차트를 시작. 3 일 동안 매일 받는 사람 동물의 무게</li>
		<li>표준 절차에 대 한 종양 성장 모니터링에 대 한 그룹 당 5-10 쥐를 예방.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
췌 장 orthotopic 주입
	<ol>
<li>마 취와 진통<ol>
<li>2 mL 마 취 제 주입 및 5.91 살 균 분사 물 또는 0.06-0.1의 복용량 볼륨에 식 염 수에 혼합 0.42 mL xylazine 주입 (20 mg/mL)을 사용 하 여 mL/20-25 g 몸 무게. 참고:에 따라 동물 복지, 진통은 필요한 모두 예약 및 게시 작업. 0.05-0.1 mg buprenorphine /kg, 사우스 첫 번째 접종 전 작업이 며, 다음 복용 3 시간 매 4 시간 post 작업 계속.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Orthotopic 이식에 대 한 외과 수술<ol>
<li>2.2.1 단계 마다 근육 주사 (IM)를 통해 마우스 anesthetize</li>
			<li>동물은 완전히 마 취 후 오른쪽 측면 위치에 실험 보드에 쥐를 수정 합니다.</li>
			<li>오른쪽 측면 위치에 쥐를 유지. 요오드와 함께 다음 75% 에틸 알코올로 드 iodinate 비장 주위 피부를 소독.</li>
			<li>비장 중간 지점을 발견 하 고 1 cm 수직 절 개 노출 비장 하 복 부에.</li>
			<li>아래 비장 췌 장 조직의 일부가 밖으로 부드럽게 플랫 팁 핀셋으로 그리고 받는 사람 마우스의 마우스 homograft 종양 조각 췌 장에 씨 마우스에서 9-0 흡수 성 수술 용 봉합 사로 봉합 합니다.</li>
			<li>두 배 솔 기 6-0 비단 봉합과 복 부를 닫습니다. 압축 하 여 항상성을 얻을.</li>
			<li>마무리 종양 이식 후 출혈도 종양 조직 발생, 만약에 따뜻한 동물을 계속.</li>
			<li>Sternal recumbency;을 유지 하기 위해 충분 한 식을 차릴 때까지 동물을 모니터링 마 취에서 완전히 회복 후 동물을 동물을 반환 합니다. 종양 생쥐 비장 근처 복 palpating 하 여 베어링을 모니터링 하 고 orthotopic 종양 방위 쥐 밖으로 선택 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
종양 방위 쥐 건강 모니터링
	<ol>
<li>매일에 소비를 된 물과 식품을 확인 하십시오.</li>
		<li>Ungroomed 머리 코트, 덩어리, 두께, 비정상적인 호흡 또는 복수에 대 한 마우스 모양을 확인 합니다.</li>
		<li>복 부 간 또는 비장에 자발적인 종양 확인를 만져합니다</li>
		<li>매주 균형을 사용 하 여 마우스의 무게.</li>
		<li>쥐 샘플 수집 및 검 시에 대 한 희생은 다음과 같은 임상 증상의 관찰 하는 경우: BW 손실 > 20%; 장애인 이동성 (먹거나 마실 수 없는); 상당한 ascites 및 확대 복 부; 일반적으로 이동할 수 없습니다 호흡에 노력입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 검 시 및 종양 수확
<ol><li>시각 및 종료 전에 만져 서 종양의 존재에 대 한 촉진 하 여 검사 합니다.</li>
	<li>종료, 먼저 승인 된 프로토콜에 따라 마우스를 안락사 하 고 복 부를 열고 시각적으로 췌 장 종양에 대 한 검사.</li>
	<li>게시물 치명적 수술으로 종양을 잘라내어 차가운 PBS에 추가. 사용 되는 이산화탄소의 배달을 위해 포트와 특별 한 뚜껑 청소, 충전, 반투명 안락사 챔버에 모든 동물을 배치 합니다.</li>
	<li>동물에 최소한의 고통으로 급속 한 무 의식 생산 유량에 챔버로 가스를 방전. CO2 에 대 한 최적의 유량 약 2-2.5 L/min 이어야 한다.</li>
	<li>시각을 모든 동물 받을 적절 한 가스 농도 euthanize 절차 동안의 식을 회복 하지 할 안락사 절차 중 각 동물을 관찰 합니다.</li>
	<li>동물 복구할 수 있는 가능성을 최소화 하기 위해 명백한 임상 죽음 후 적어도 1 분 동안 가스 흐름을 유지 (만약 apneic 하지만 죽지).</li>
	<li>인접 한 비 종양 조직을 제거 합니다. 청소 종양은 신속 하 게 촬영 될 수 있습니다. RPMI-1640에 종양 조직을 넣고 분리 전에 얼음에 계속. 참고: 동물 시체는 체포 하 고 기다리고 제거 적절 한 냉장고에 저장.</li>
</ol>4. 종양 조직 분리 및 단일 셀 준비
<ol><li>
시 약 준비 참고: 종양 분리 키트 포함 효소 d (동결 건조 된 분말), 효소 R (동결 건조 된 분말), 1 (동결 건조 된 분말) 효소 A의 유리병과 버퍼 a.의 1 mL의 1 유리병 2 병<ol>
<li>RPMI-1640의 3 mL와 함께 각 유리병에 동결 건조 된 분말을 재구성 하 여 효소 D를 준비 합니다. Aliquots 반복된 동결-해 동 주기를 피하기 위해 적절 한 볼륨을 준비 합니다.</li>
		<li>RPMI 1640의 2.7 mL와 함께 유리병에 동결 건조 된 분말을 재구성 하 여 효소 연구를 준비 합니다. Aliquots 반복된 동결-해 동 주기를 피하기 위해 적절 한 볼륨을 준비 합니다.</li>
		<li>버퍼는 키트와 함께 제공 되는 A의 1 mL와 함께 유리병에 동결 건조 된 분말을 재구성 하 여 효소 A를 준비 합니다. 와 동 하지 마십시오. Aliquots 반복된 무료-재개-사이클을 피하기 위해 적절 한 볼륨을 준비 합니다.</li>
		<li>각 gentleMACS C-튜브에 RPMI-1640, 효소 D의 100 µ L, 효소 R의 50 µ L 및 효소 A의 12.5 µ L의 2.35 mL을 추가 하 여 효소 혼합을 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
종양 분리
	<ol>
<li>각 종양에 대 한 종양 소화 믹스 한 C-튜브 준비, 섹션 4.1 소화 버퍼 희석 및 준비를 참조 하십시오.</li>
		<li>사용 3 mL 소화 버퍼 종양 조각 < 0.8 g, 그리고 종양 완벽 하 게 소화.</li>
		<li>코드 연구, 종양, 마우스 ID, 치료 그룹, 및 종양 무게와 레이블을 지정 합니다.</li>
		<li>마우스에서 종양을 수집, 차가운 PBS에 종양을 세척 하 고 청소 종양 (예: 혈관, 지방, 근 막 등)에 연결 하는 조직.</li>
		<li>살 균 6 잘 플레이트의 한 잘에서 소화 미디어에 종양을 넣어.</li>
		<li>멸 균 핀셋/집게와 장소와 메스와 조각에서 종양을 개최. 작은 조각 (~ 1 m m3)에 침입 하는 종양을 충분히 슬라이스.</li>
		<li>C 관으로 다시 종양 조각을 놓고 나머지 소화 버퍼를 사용 하 여 세척 접시를 다음 소화까지 얼음에 배치 된 C-튜브에 액체를 전송 합니다.</li>
		<li>히터는 dissociator에 스위치.</li>
		<li>빈 위치의 소매에 거꾸로 종양 분리 C 튜브를 놓고 관 입장 무료 선택의 상태를 조정 합니다. 프로그램 목록 표시 됩니다 필요한 폴더의 선택에 의해 다음 분리 프로그램 (37_c_m_TDK_1)을 선택 합니다.</li>
		<li>프로그램의 종료 후 C-튜브 dissociator와 스핀 짧게 (300 x g, 4 ° C) 작은 샘플을 벗어.</li>
		<li>다시 샘플을 일시 중단 하 고 50 mL 튜브 위에 셀 여과기에 넣어. 워시 버퍼를 제공 하는 단일 셀 서 스 펜 션의 10 mL와 함께 셀 스 트레이너를 통해 세포를 씻어.</li>
		<li>5 분에 대 한 300 x g 에서 튜브 원심, 삭제는 상쾌한 고 다시 중단 워시 버퍼의 5 mL와 함께 셀 수 가능한 셀 trypan 블루 / 셀 카운터를 사용 하 여 1 x 106 셀 튜브 또는 샘플 셀 concentraton 조정. 되도록 얼룩 특정 올바른 isotype 제어 항 체를 포함</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 면역 패널 설계 및 흐름 데이터 수집
<ol><li>
패널 디자인
	<ol>
<li>표 1을 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunostaining
	<ol>
<li>Fc-블록 샘플 셀: 셀 1 µ g/mL Fc-블록, 어둠 속에서 15 분 동안 얼음 또는 4 ° C 냉동에 외피 다음 버퍼를 얼룩이 지기의 200 µ L에 다시 중단.</li>
		<li>(예원하는 항 체/형광 패널을 사용 하 여 얼룩 셀. T-cell 패널, 대 식 세포 패널, 등.): 항 체 혼합물 각 샘플, 어둠 속에서 얼음에 30 분 이상 얼룩에 Fc 블로킹 버퍼에 희석을 추가.</li>
		<li>각 튜브를 얼음 차가운 PBS의 1 mL을 추가 하 고 다시 일시 중단 셀 부드럽게, 다음 5 분 삭제 결과 상쾌한에 대 한 300 x g 에서 원심 분리.<ol>
<li>셀을 두 번 씻고를 반복 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>필요한 경우 세포내 표식에 대 한 얼룩, 다음 단계 6-10, 그렇지 않으면 10 단계로 이동.</li>
		<li>다시 펄스 소용돌이 의해 셀 펠 릿을 일시 중지 하 고 각 샘플에 대 한 준비 고정/Permeabilization 작업 솔루션의 200 µ L를 추가 합니다. 다시, 소용돌이 펄스와 다음 4 ° C에서 품 어 하룻밤 (선호) 또는 어둠 속에서 실 온에서 30 분.</li>
		<li>셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 제거는 상쾌한.</li>
		<li>Permeabilization 버퍼 (Permeabilization 버퍼, 희석 증류수 H2O와 x 10에서 만든) x 1의 1 mL 다음 원심 분리 하 여 추가 하 고 상쾌한의 decanting 여 두 번 세척.</li>
		<li>세포내 마커 항 체 Permeabilization 버퍼 x 1에 추가 하 고 어둠 속에서 30 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>셀 Permeabilization 버퍼 x 1의 1 mL로 두 번 씻는 다. 원심 및 상쾌한 가만히 따르다.</li>
		<li>Resuspend 얼룩 버퍼의 150 µ L에서 세포 고는 cytometer 분석. 때문에 고정 및 permeabilization 절차, FSC (앞으로 빛 분산형) / 셀 인구의 SSC (들 피해 라) 배포 셀 사는 다른 것입니다. 따라서, 게이트 및 전압 수정 필요 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
FMO 컨트롤 (컨트롤-형광) 참고: 다 색 흐름 분석 면역 세포 종양 침투의 분석을 위해 특히 중요 하다. 따라서, 주어진된 패널에 여러 형광으로 확산 하는 데이터의 컨텍스트에서 셀 게이트를 식별 하는 방법의 찾을 필요가 있다. FMO (1 마이너스 형광) 컨트롤은이 목적을 위해 중요 한 방법.<ol>
<li>이 위해, FMO 컨트롤 (Rx 당 적어도 2)에 대 한 각 그룹에 개별적으로 각 조직에 대 한 프로세스 추가 마우스를 포함 합니다. 분리, 후 조직 수영장. 예를 들어 4 Rx 그룹 연구, 8 추가 종양 한다 개별적으로 처리 되며 다음 FMOs에 대 한 하나의 샘플에 풀링된.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
흐름 장비 설치
	<ol>
<li>기계 (20 분 이상)을 워밍업 하는 동안 보상 비즈를 확인 합니다.</li>
		<li>CS 및 T 비즈를 사용 하 여 성능을 확인 하.</li>
		<li>전압 및 보상 설정: UltraComp 구슬, 소용돌이 빌려 사용 하기 전에 철저 하 게 비즈를 사용 하 여.</li>
		<li>각 형광 색소 활용 된 항 체에 대 한 별도 12 x 75 m m2 샘플 튜브를 레이블을 지정 합니다.</li>
		<li>각 튜브에 버퍼를 얼룩이 지기의 100 µ L를 추가 합니다. 각 튜브를 구슬의 1 전체 드롭 (약 60 µ L)를 추가 합니다.</li>
		<li>항 체를 추가 하 고 섹션 4에에서 명시 된 샘플 과정으로 정확 하 게 얼룩 절차를 수행 합니다.</li>
		<li>각, 버퍼 완전히 다시 소용돌이 통해 구슬 알갱이 일시 중단 하려면 얼룩의 0.5 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>주어진 실험 대상 조직 당 교류 cytometer PMT 전압을 설정 합니다.</li>
		<li>데이터 수집을 위한 교류 cytometer 통해 게이팅 FSC 그리고 SSC 독서 당 내의 비드 인구에 의해 실행 합니다.</li>
		<li>주위 설정된 유량 200-300 이벤트/s.</li>
		<li>주어진된 fluorescein [FITC]에 대 한 적절 한 보상을 설정-활용 된 항 체, 사용 된 FL1 대 FL2 점 플롯.</li>
		<li>사분면 게이트를 부정적인 구슬 낮은 왼쪽된 사분면 내 긍정적인 구슬 상단에는 또는 낮은 오른쪽 장소 사분면. 각 인구 (사분면 통계 창에서와 같이)의 메디아 형광 강도 (MFI)은 약까지 보상 값을 조정 (즉 FL2 %FL1 대 한, 두 구슬의 FL2 MFI 유사 해야).</li>
		<li>모든 튜브 5.4.11-5.4.12 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>샘플을 얼룩이 실제 인수를 진행 합니다. 보상 마법사를 실행 하 고 "날짜 실험 이니셜" 형식으로 설정을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 흐름 데이터 분석 및 프레 젠 테이 션
<ol><li>Flowjo / 칼루 차에 의해 데이터를 분석 합니다.</li>
</ol>

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모든 저자는 크라운 생명 과학, i n c.의 현재 풀 타임 직원

비록 연구 SC 종양을 사용 하 여 더 쉽게 실시 하 고, orthotopically 이식 종양 모델 수 있습니다 전 임상 약리학 연구 (특히 I/O 조사)에 대 한 관련성이 향상 된 translatability를 제공 하. 이 보고서는 관심이 독자/시청자 직접 그들의 각각 연구에 사용할 수 있는 기술 절차를 시각화 수 있도록 목표로 합니다. 우리의 프로토콜 입증 그 orthotopic PDAC 이식 효율적인 종양 성장, SC 주입 비슷한 발생할 수 있습니다. 우리의 관측은 또한 다른 implantations에서 TMEs의 다른 면역 프로 파일의 존재를 제안 것 같다. SC implantations에 비해 orthotopic 맞게 주요 과제는 복잡 한 기술은 필요 하다, 과정은 많은 시간이 소요, 이식에 대 한 수술 절차는 노동 집약은 또한 모니터링 orthotopic 종양에 어려움 인생에서 성장입니다.
Orthotopic 췌 장 종양 실험은 성공적으로 수행 되도록 4 개의 중요...

췌 장 ductal 선 암 (PDAC) 하면 거의 절반 백만 mortalities 세계-넓은 매년 상위 5 암 살인범 중 하나. 몇 가지 효과적인 치료 옵션 및 아무 승인된 immunotherapies; 따라서, 새로운 치료 필사적으로 필요 합니다. 암은 점점 오늘 알려진 유전 질환 뿐만 아니라 PDAC를 포함 하 여 면역 질병으로 인식 되 고 있습니다. 면역 및 유전적 요인 치료 뿐만 아니라 질병의 예 후 결정 가능성이 결과. 종양은 호스트 면역 감시를 회피 하 고 결국 죽음을 미리. 이러한 면역 프로세스의 많은 내 발생 종양 microenvironment (TME)1,2,,34 어디 다른 종류의 면역 세포 작용 종양 세포와, 서로 다른 종양 stromal 구성 요소, 직접 또는 간접적으로 궁극적으로 질병 결과 결정 하는 cytokines. 따라서, TME, 또는 종양 immunophenotyping, 동등, 세는 법 및 면역 세포의 다른 계보의 지역화를 포함 하 여 종양 면역 구성의 특성은 항 종양 면역을 이해 하는 데 중요 합니다. PDAC, 경우 그것은 제안 되었습니다 그 높은 종양 침투 진압 대 식 세포 (TAM) 및 B 세포 T 세포 침투 활성화의 예방 및 섬유 증5,6의 높은 수준으로 이끈.
면역 TMEs을 실험적으로 조사 하는 일반적인 방법은 대리 종양 전 임상 동물 모델을 사용 하는 것, 주로 관련 마우스 종양 모델7, 특히 마우스 syngeneic (homograft) 또는 유전자 조작된 마우스 모델 (GEMM) 암, 마우스와 인간 종양과 면역8,9의 가정된 유사성에. 두 종10,11사이의 고유의 차이 현실에서 이해 된다.
종양 이식된 마우스는 자발적인 종양7, 즉 동기화 된 종양 개발, 부모의 GEMM 자연 종양 개발 달리 상당한 운영 이점이 있다. 자발적인 murine 종양의 homografts 1 차 종양 적 데 조작 생체 외에서미러링 원래 마우스 종양 조직-간주 됩니다 / 분자 병 리7, 뿐만 아니라 가능한 면역 프로필. 이러한 murine homografts는 종종 "환자 파생 xenografts (PDXs)의 마우스 버전" 간주 됩니다. 그들은 따라서 가능성이 있다 기존의 syngeneic 셀 라인 파생 마우스 종양12보다 더 나은 translatability. 특히, 많은 homografts는 특정 인간 질병 메커니즘, 예를 들면 종양 드라이버 돌연변이, 설계는, 그리고이 homografts 그러므로 그들의 임상 관련성에 이점이 있어야 특정 GEMM에서 파생 됩니다. 특히, KPC GEMM 형태학 상으로 주로 잘에 알맞게-차별화 된 선의 건축과 인간의 질병이 고 높은 기질 있는 나이의 15-20 주 이내 마우스 PDAC 개발. 이 모델은 또한 인간의 PDAC, 즉 Kra 90%와 인간의 PDAC, 각각5,6의 75%에서 발생 하는 돌연변이 P53 손실-의-기능을 활성화의 가장 일반적인 유전자 기능을이.
이식의 사이트는 또한 모델 translatability에 역할을 제안 되었습니다. 해당 orthotopic 환경 등 특정 주변 조직 환경 일반적으로 이식된 종양에 대 한 균일 한 피하 (SC) 반대로 진행 환경에 특정 종양에 대 한 틈새 수 있습니다. 그것은 특정 관심의 것 경우, 어떤 차이가 존재 하는 면역-microenvironment, 및 인간의 암에 관련성 두 이식 사이트 간에 예그리고/또한. PDAC 경우.
면역 프로 파일링 또는 immunophenotyping의 가장 중요 한 측면 중 하나는 종양 침투 면역 세포의 다른 계보, 숫자, 종양, 내 상대 비율으로 그들의 활성화 상태 및 위치를 결정 하는. 이 포함 하는 종양-infiltratrating lymphoctyes (TILs, T-와 B-), 종양 침투 대 식 세포 (Tam), 자연 킬러 세포 종양 침투 (NKs) 및 종양 상주 수지상 세포3,,1314 , 15 , 16 , 17, 그리고 특정 셀18,,1920, 등등의 subcellular 지 방화. 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 또는 흐름 cytometry는 일반적으로 셀의 특정 파라미터를 측정 하는 데 사용 되는 단일 셀 탐지 기술. 멀티 컬러 cytometry 조치 단일 셀3,,421 에 여러 마커 흐름과 숫자와 면역 세포의 다른 하위 집합의 상대적 비율을 결정 하기 위해 가장 일반적으로 사용된 방법입니다. 그 종양을 포함 하 여.
이 보고서는 면역 세포 종양 침투를 프로 파일링 하는 절차를 설명 합니다: 1) SC 주입; 함께 orthotopic PDAC 마우스 종양 homografts의 주입 2) 종양 조직 수확 및 종양 분리; 통해 단일 셀 준비 모든 기준;으로 종양에서 파생 된 셀의 3) 흐름 cytometry 분석 4) 두 이식 방법의 기본 프로 파일의 비교.

<table><tbody><tr><td>마취 기계</td><td>\</td><td>SAS3119</td><td>\</td></tr><tr><td>투관침 20</td><td>\</td><td>\</td><td>2mm</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>\</td><td>\</td><td>20mm</td></tr><tr><td>100x 항생제 및 항진균제</td><td>\</td><td>\</td><td>\요</td></tr><tr><td>오드포 면봉</td><td>\</td><td>\</td><td>매일 약국 구매</td></tr><tr><td>알코올 면봉</td><td>\</td><td>\매일</td> <td>약국 구매</td></tr><tr><td>액체 질소</td><td>공기 화학 \</td><td></td><td>\</td></tr> <tr><td>생물 안전 후드</td><td>AIRTECH</td><td>BSC-1300IIA2</td> <td>\</td></tr> <tr><td>FACS 기계 LSRFortessa X-20</td><td>BD</td><td>LSR Fortessa</td><td>\</td></tr><tr><td>항체</td><td>BD\</td><td></td><td>\</td></tr><tr><td>Trevigen MD 또는 BD Matrigel 기저층 멤브레인 매트릭스 고농도</td><td>BD</td><td>354248</td><td>\</td></tr><tr><td>FACS 버퍼</td><td>BD</td><td>554656</td><td>민싱 버퍼</td></tr><tr><td>브릴리언트 염색 버퍼</td><td>BD</td><td>563794</td><td>\</td></tr><tr><td>마우스 BD Fc 블록</td><td>BD</td><td>553142</td><td>\</td></tr><tr><td>셀 필터</td><td>BD-Falcon</td><td>352350</td><td>70 &micro; m</td></tr><tr><td>routine blood tube</td><td>BD-Vacutainer</td><td>365974</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Kaluza</td><td>Beckman</td><td></td><td>vs 1.5</td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>\</td></tr><tr><td>Foxp3 Fix/Perm kit</td><td>ebioscience</td><td>00-5523-00</td><td>\</td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>ebioscience</td><td>01-2222-42</td><td>\</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5810R,5920R</td><td>\</td></tr><tr><td>FlowJo 소프트웨어</td><td>FlowJo LLC\</td><td></td><td>vs 10.0</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>50</td></tr><tr><td>mL RPMI 1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30809.01</td><td>\</td></tr><tr><td>일회용, 멸균 메스</td><td>Jin zhong</td><td>J12100</td><td>11#</td></tr><tr><td>칼 손잡이</td><td>Jin zhong</td><td>J11010</td><td>\</td></tr><tr><td>눈 가위 및 핀셋</td><td>Jin zhong</td><td>Y00030</td><td>눈 가위 10cm</td></tr><tr><td>눈 가위 및 핀셋</td><td>Jin zhong</td><td>JD1060</td><td>눈 핀셋 10cm 치아</td></tr><tr><td>포함 휴대용 액체 질소 탱크</td><td>Jinfeng</td><td>YDS-175-216</td><td>\</td></tr><tr><td>전자 저울</td><td>Metter Toledo</td><td>AL204</td><td>0-100g</td></tr><tr><td>Miltenyi C-tubes</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-334</td><td>\</td></tr><tr><td>Miltenyi 히터 블록이 있는 Gentle MACS</td><td>Miltenyi</td><td>120-018-306</td><td>\</td></tr><tr><td>종양 해리 키트</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-730</td><td>\</td></tr><tr><td>세포 계수기</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometer</td><td>Cellometer Auto T4</td></tr><tr><td>cryopreservation tube</td><td>Nunc</td><td>375418</td><td>1.8 mL</td></tr><tr><td>Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME</td><td>PathClear</td><td>3442-005-01</td><td>\</td></tr><tr><td>syringes</td><td>Shanghai MIWA 의료 산업</td><td>\</td><td>1-5 mL</td></tr><tr><td>Studylog 소프트웨어</td><td>Studylog</td><td>\</td><td>software</td></tr><tr><td>Studylog-Balance and supporting USB</td><td>OHAUS</td><td>SE601F</td><td>Balance and supporting USB</td></tr><tr><td>Studylog-Data line of vernier calipers</td><td>Sylvac</td><td>926.6721</td><td>Data line of vernier calipers</td></tr><tr><td>Caliper</td><td>Sylvac</td><td>910.1502.10</td><td>Sylvac S-Cal pro</td></tr><tr><td>멸균 원심분리기 튜브</td><td>Thermo</td><td>339653</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>멸균 원심분리기 튜브</td><td>Thermo</td><td>339651</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>얼음 양동이</td><td>Thermo</td><td>KLCS-288</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>얼음 양동이</td><td>써모</td><td>PLF-276-20</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>얼음 양동이</td><td>써모</td><td>DW-862626-80</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>써모</td><td>am7021</td><td>\</td></tr></tbody></table>

immunophenotyping orthotopic homograft (syngeneic) murine 기본 kpc 췌 장 ductal 선 암의 cytometry로의

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Homograft (syngeneic) 종양은 오늘날의 면역-종양학 (I/O) 전 임상 연구의 주력. 종양의 microenvironment (TME), 특히 면역-구성, 예 후 및 치료 결과, immunotherapy의 특히 그의 예측에 필수적입니다. TME 면역-구성 요소 다 색 FACS에 의해 평가할 수 있는 면역 세포를 종양 침투의 다른 하위 집합으로 구성 됩니다. 췌 장 ductal 선 암 (PDAC) 좋은 치료 옵션, 따라서는 긴급 하 고 미 충족 의료 필요를 부족 한 치명적인 malignances 중 하나입니다. 그것의 비-응답 다양 한 요법 (항 암 치료-, 타겟, I/O)에 대 한 중요 한 이유 중 하나는 섬유 아 세포 및 이러한 치료에서 종양 세포를 보호 하는 백혈구의 구성 된 그것의 풍부한 TME 되었습니다. Orthotopically 이식된 PDAC는으로 더 정확 하 게 기존의 피하 (SC) 모델 보다 인간의 췌장암의 TME 탈환.
Homograft 종양 (KPC)는 마우스 자발적인 PDAC 유전자 조작된 KPC-마우스에서 발생의 이식 (KrasG12D / +/P53-/-/Pdx1-다시C) (KPC-GEMM). 기본 종양 조직 (~ 2 m m3) 작은 조각으로 자르고 피하 이식 (SC) syngeneic 받는 사람 (C57BL/6, 7-9 주 이전)에 게. homografts 수술 후 했다 orthotopically에 SC-주입, 17 일에 의해 300-1000 m m3 의 종양 볼륨에 도달 함께 새로운 C57BL/6 마우스의 췌 장 이식. 400-600 m m3 의 종양만 승인된 부검 절차 당 수확 되었고 인접 한 비 종양 조직을 제거 하는 청소. 그들은 다른 면역 세포의 다양 한 표시에 대 한 항 체 붙일 레이블 지정 패널 얼룩 다음 단일 셀 정지로 조직 dissociator를 사용 하 여 프로토콜 당 해리 했다 (림프, 골수성 NK, Dc). 얼룩진된 샘플 종양 내에서 그들의 상대적인 비율 뿐 아니라 다른 계보의 면역 세포의 숫자를 결정 하기 위해 다 색 FACS를 사용 하 여 분석 되었다. Orthotopic 종양의 면역 프로필 다음 SC 종양의 그들에 비교 되었다. 예비 데이터 췌 장, 그리고 사우스 캐롤라이나 종양 보다는 오히려 orthotopic 높은 B-세포 침투 종양에서 상당히 높은 침투 TILs/Tam을 시연 했다.

PDAC Orthotopic 이식 결과 급속 한 종양 성장 SC 주입에 대 한 본 비슷합니다. 기증자 종양 조각을 받는 쥐로 이식 된 후 모두 피하 및 2.1과 2.2 프로토콜에 따라 orthotopically 단계에 설명 된, 그림 1A와 같이 이식된 KPC homograft 종양 유사한 급속 한 성장을 보여주었다 . KPC homograft 종양 다른 시간 지점에서 수확 그림 1B 에서 표시 되 고 대표 H &amp; E 이미지 그림 1C표시 됩니다. 우리의 데이터 시연 SC의 비슷한 성장 및 orthotopic 임 플 란 트.
실행 가능한 종양 세포 및 셀 orthotopic 또는 SC 주입에서 발생...

Murine orthotopic PDAC homografts immunophenotyping에 실험 절차는 종양 면역 microenvironment 프로 파일링 목표로 합니다. 종양은 수술을 통해 이식 하는 orthotopically. 종양 크기에 200-600 m m3 의 수확 되었고 단일 셀 정지, 여러 면역 표식 FACS 분석 다른 붙일 표시 된 항 체를 사용 하 여 다음을 준비 하는 해리.

Immunophenotyping Orthotopic Homograft (Syngeneic) Murine 기본 KPC 췌 장 Ductal 선 암의 Cytometry로의

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

이 메시지는 다른 면역 계보 및 노화 전략을 식별하는 데 사용되는 마커와 같은 Murine 모델의 면역 페노티핑의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 면역페노티핑시 마커 및 노화 상태기가 다양한 뮤린 모델에 적용될 수 있다는 것입니다. 균형을 이용하여 C57 블랙 6 마우스의 체중을 모니터링합니다.또한, 구경 측정에 의해 기증자 마우스를 변화종양의 종양 부피를 모니터링한다. 프로토콜에 따라 생물학적 위험에 지은 동물의 안락사를 따라, 이오도프르 면봉을 사용하여 종양 주위의 피부를 살균. 수술 후 종양을 텍스트 프로토콜에 자세히 설명한 대로, 종양을 PBS의 20 밀리리터를 함유한 페트리 접시에 놓는 것은 섭씨 4도까지 미리 냉각되었다.혈액을 오염시키는 경우에, 다른 Petri 접시로 종양을 전송하고 PBS로 종양을 세척합니다. 종양을 반으로 자른다. 여분의 피부, 혈관, 석회화 및 괴사를 제거하십시오.그대로 남아 있는 종양 조각만 선택하고 멸균 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 넣습니다. 약리학 연구를 위한 별도의 동물 방에 튜브를 수송하기 전에 PBS의 20 밀리리터를 추가합니다. 직교 이식을 준비하려면 오른쪽 측면 위치에있는 실험 보드에 완전히 마취 마우스를 수정하십시오.이도딘으로 비장 주위의 피부를 소독한 다음 75 %의 에틸 알코올로 디이디네이트를 제거하십시오. 비장의 중앙값을 찾아 복부에 1센티미터 수직 절개를 하여 비장을 노출시합니다. 부드럽게, 평평한 팁 핀셋을 사용하여 비장 아래에 췌장 조직의 일부를 그립니다.및 9-O bsorbable 수술 봉합사에 의해 받는 마우스의 췌장에 C 마우스에서 마우스 균질 이식 종양 조각을 sutro. 복부락을 6-O 실크 봉합사로 이중 솔기로 닫습니다. 압축으로 항상성을 달성합니다.종양 이식을 마친 후 출혈이나 종양 조직 누출이 발생하지 않는 한 동물을 따뜻한 케이지에 보관하십시오. 동물을 감시하여 흉골 의식으로 충분한 의식을 회복할 때까지 모니터링합니다. 마취에서 완전히 회복 한 후 동물 방으로 동물을 반환합니다.비장 근처의 복부를 만지켜서 종양이 변화하는 마우스를 모니터링하고 직교 종양을 베어링 하는 마우스를 선택합니다. 각 종양에 대해 종양 소화 완충제로 C 튜브 1개를 준비합니다. 종양이 완전히 소화되도록 종양 단편0.8 그램 미만의 소화 완충제 3 밀리리터를 사용하십시오.연구 코드, 종양, 마우스 ID, 치료 그룹 및 종

immunophenotyping-orthotopic-homograft-syngeneic-murine-primary-kpc

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

암 줄기 세포 (CSCs)이 malignancies의 숫자에서 확인되었습니다. 이 프로토콜에서 우리는 인간의 췌장 선암의 xenografts에서 CSCs을 분리하는 알데히드 탈수소 효소의 활동과 CD44과 CD24 표현을 활용 흐름 cytometric 방법을 설명합니다. 이 가능한 전지는 다음 기능 분석 연구에 사용할 수 있습니다.

인간 췌장암의 Xenografts에서 줄기 세포의 분리

이 비디오는 췌장암 발병을 위해 암성 기증자의 종양 조각을 비암성 수용자 마우스의 췌장으로 이식하는 단계적 수술 방법을 설명합니다. 정소적으로 이식된 PDAC는 기존의 피하(SC) 모델보다 인간 췌장암의 조직 미세환경을 더 정확하게 재현할 수 있습니다.

정소성 동종이식 종양 이식: 췌장 종양 마우스 모델을 생성하는 기술

면역 능력이 쥐의 흉강에 II-45 악성 세포의 이식에 의한 흉막 악성 중피종의 소성을 쥐 모델의 생성이 제공됩니다. 유세포 방법도 기재되어 25 ㎕의 혈액 샘플로부터이 동물 일곱 면역 세포 서브 세트를 분석한다.

II-45 동계 쥐의 Mesothelioma 모델에서 소성을 주입 및 주변 면역 세포 모니터링

우리는 cytometry에 의해 동시 표현의 기본 급성 골수성 백혈병 세포에 백혈병 줄기 세포 마커를 감지 하는 프로토콜 개요. 우리 3 조상 인구와 성숙의 정도 증가 함께 상 상속 LSC 인구를 측정 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 이러한 인구에 해당 환자-파생-xenografts의 존재를 확인 했다.

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

여기 우리는 비 작은 세포 폐 암 공부 시간 및 비용 절감 모델 마우스 폐 선 암 세포의 침 습 syngeneic orthotopic 이식 모델을 설명 합니다.

Orthotopic PD L1 식 공부 Syngeneic 폐 선 암 세포의 이식

우리는 모린 유래 췌장 선암 세포주를 직접 네이티브 종양 부위로 유도하는 초음파 유도 이식프로토콜을 설명합니다. 이 접근법은 주사 후 2-4주 이내에 초음파 스캐닝에 의해 검출가능한 췌장 종양을 초래하고, 외과 정형외과 이식에 비해 각막벽에 종양 세포 파종을 현저히 감소시켰다.

뮤린 췌장 연성 선암의 초음파 유도 정형 외 이식

이 프로토콜은 정형 외과 췌장 종양의 외과 생성 및 갓 단송된 뮤린 췌장 종양의 급속한 소화를 기술합니다. 소화 후, 실행 가능한 면역 세포 집단은 유세포 세포 분석에 의한 세포내 사이토카인 검출을 위한 T 세포의 생체내 자극을 포함하는 추가하류 분석을 위해 사용될 수 있다.

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

여기에서, 마우스 종양 모델에서 종양 내재 및 주변부 유래 종양 침윤된 림프구의 특성화를 위한 종양 이식 프로토콜을 제시한다. 유세포 분석기를 사용한 수용자 유래 면역 세포의 유입에 대한 특이적 추적은 항종양 면역 반응 동안 이들 세포의 표현형 및 기능적 변화의 역학을 드러낸다.

마우스에서 종양 침윤성 CD8+ T 세포의 역학을 평가하기 위한 종양 이식

췌관 선암종(PDAC)의 Syngeneic mouse orthotopic 동종이식편은 질병 아형의 생물학, 표현형 및 치료 반응을 요약합니다. 빠르고 재현 가능한 종양 진행으로 인해 전임상 연구에 널리 사용됩니다. 여기에서는 syngeneic murine PDAC 배양을 췌장에 주입하여 이러한 모델을 생성하는 일반적인 방법을 보여줍니다.

췌장암을 모델링하기 위한 Syngeneic Mouse Orthotopic Allografts

우리는 양자 세포 전달을 위해 유세포 분석을 통해 마우스의 종양 침윤 림프구(TIL)를 활용하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 syngeneic pancreatic cancer 마우스 모델에서 종양에 대한 TIL의 특정 세포 독성을 검증하여 췌장암에 대한 입양 세포 요법 개발에 대한 통찰력을 제공하는 것을 목표로 합니다.

췌장암의 마우스 모델에서 종양 침윤 림프구의 유세포 분석 기반 분리 및 치료 평가

여기에서는 인류 세포 분석 기반 방법을 사용하여 마우스에 이종 이식하고 골수 흡인에서 얻은 급성 인간 골수성 백혈병 세포에서 mTORC1, JAK/STAT5 및 MAPK 경로의 다운스트림 신호를 분석합니다. p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 및 p-ERK1/2 수준은 고감도의 차세대 스펙트럼 유세포 분석기를 사용하여 동시에 측정됩니다.

급성 골수성 백혈병 환자 유래 이종이이식의 세포내 인류 세포분석

배우세요 췌장관상선암(PDAC) 마우스 동종이식 모델의 면역표현형 분석 방법을. FACS를 활용하여 종양 면역미세환경을 프로파일링하고 면역세포 표지자를 식별하는 기술을 익혀 종양 면역 연구에 활용하세요.

Immunophenotyping Orthotopic Homograft (Syngeneic) Murine 기본 KPC 췌 장 Ductal 선 암의 Cytometry로의

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