Immunophenotyping Orthotopic Homograft (Syngeneic) Murine 기본 KPC 췌 장 Ductal 선 암의 Cytometry로의

이 메시지는 다른 면역 계보 및 노화 전략을 식별하는 데 사용되는 마커와 같은 Murine 모델의 면역 페노티핑의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 면역페노티핑시 마커 및 노화 상태기가 다양한 뮤린 모델에 적용될 수 있다는 것입니다. 균형을 이용하여 C57 블랙 6 마우스의 체중을 모니터링합니다.

또한, 구경 측정에 의해 기증자 마우스를 변화종양의 종양 부피를 모니터링한다. 프로토콜에 따라 생물학적 위험에 지은 동물의 안락사를 따라, 이오도프르 면봉을 사용하여 종양 주위의 피부를 살균. 수술 후 종양을 텍스트 프로토콜에 자세히 설명한 대로, 종양을 PBS의 20 밀리리터를 함유한 페트리 접시에 놓는 것은 섭씨 4도까지 미리 냉각되었다.

혈액을 오염시키는 경우에, 다른 Petri 접시로 종양을 전송하고 PBS로 종양을 세척합니다. 종양을 반으로 자른다. 여분의 피부, 혈관, 석회화 및 괴사를 제거하십시오.

그대로 남아 있는 종양 조각만 선택하고 멸균 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 넣습니다. 약리학 연구를 위한 별도의 동물 방에 튜브를 수송하기 전에 PBS의 20 밀리리터를 추가합니다. 직교 이식을 준비하려면 오른쪽 측면 위치에있는 실험 보드에 완전히 마취 마우스를 수정하십시오.

이도딘으로 비장 주위의 피부를 소독한 다음 75 %의 에틸 알코올로 디이디네이트를 제거하십시오. 비장의 중앙값을 찾아 복부에 1센티미터 수직 절개를 하여 비장을 노출시합니다. 부드럽게, 평평한 팁 핀셋을 사용하여 비장 아래에 췌장 조직의 일부를 그립니다.

및 9-O bsorbable 수술 봉합사에 의해 받는 마우스의 췌장에 C 마우스에서 마우스 균질 이식 종양 조각을 sutro. 복부락을 6-O 실크 봉합사로 이중 솔기로 닫습니다. 압축으로 항상성을 달성합니다.

종양 이식을 마친 후 출혈이나 종양 조직 누출이 발생하지 않는 한 동물을 따뜻한 케이지에 보관하십시오. 동물을 감시하여 흉골 의식으로 충분한 의식을 회복할 때까지 모니터링합니다. 마취에서 완전히 회복 한 후 동물 방으로 동물을 반환합니다.

비장 근처의 복부를 만지켜서 종양이 변화하는 마우스를 모니터링하고 직교 종양을 베어링 하는 마우스를 선택합니다. 각 종양에 대해 종양 소화 완충제로 C 튜브 1개를 준비합니다. 종양이 완전히 소화되도록 종양 단편0.8 그램 미만의 소화 완충제 3 밀리리터를 사용하십시오.

연구 코드, 종양, 마우스 ID, 치료 그룹 및 종양 중량으로 종양에 라벨을 부착합니다. 마우스에서 종양을 수집합니다. 감기 PBS에서 종양을 씻고 종양에 부착 된 조직을 청소하십시오.

멸균 6웰 플레이트의 한 웰에 종양을 소화 매체에 놓습니다. 멸균 핀셋이나 집게로 종양을 제자리에 고정하고 메스로 슬라이스하십시오. 종양을 잘 슬라이스하여 작은 조각으로 부서질 수 있습니다.

이제 종양 조각을 C-튜브에 다시 넣고 나머지 소화 버퍼를 사용하여 접시를 씻습니다. 액체를 C-튜브로 옮기고 소화될 때까지 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 히터로 해리를 켭니다.

종양 해리 C-튜브를 빈 위치의 소매에 거꾸로 놓습니다. 무료에서 선택됨으로 튜브 위치 상태를 조정합니다. 프로그램 목록이 표시되는 필수 폴더를 선택하여 해리 프로그램을 선택합니다.

프로그램이 종료된 후, C-튜브를 소각기에서 꺼내 서 샘플을 팔레트로 간단히 돌보세요. 이제 샘플을 다시 중단하고 50 밀리리터 튜브 위의 세포 여과기에 넣습니다. 셀 스트레이너를 통해 셀을 세척하여 10 밀리리터의 세척 버퍼를 사용하여 단일 셀 서스펜션을 제공합니다.

300 G에서 5분 동안 원심분리한 후, 수퍼네티드를 버리고 5밀리리터의 세척 버퍼로 세포를 다시 중단합니다. 실행 가능한 세포를 계산하고 튜브 당 또는 샘플 당 1백만 세포로 세포 농도를 조정합니다. 면역 패널 설계, 면역 염색 및 형광을 텍스트 프로토콜의 세부 사항으로 하나의 컨트롤을 뺀 수행합니다.

유동 악기가 사용하기 전에 철저히 소용돌이로 워밍업하는 동안 UltraComp 구슬을 준비하십시오. 각 플루오로크롬스 공액 항체에 대해 별도의 12 x 75 밀리미터 샘플 튜브에 라벨을 부착합니다. 각 튜브에 100 마이크로리터의 염색 버퍼를 추가하여 구슬한 방울을 한 방울만 떨어뜨립니다.

항체를 추가하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 염색 절차를 수행합니다. 그런 다음 각 비드 펠릿에 0.5 밀리리터의 염색 버퍼를 추가하고 소용돌이를 통해 완전히 다시 중단하십시오. 이제 주어진 실험을 위해 대상 조직당 유동 세포측정 PMT 전압을 설정합니다.

전방 분산 및 측면 분산 판독값당 단일 비드 집단을 확보하여 데이터 수집을 위한 흐름 세포측정을 통해 샘플을 실행합니다. 초당 약 200~300개의 이벤트의 유량을 설정합니다. FL1 대 FL1 도트 플롯을 사용하여 주어진 형광FITC 컨쥬게이션 항체에 대한 적절한 보상을 설정합니다.

네거티브 구슬이 왼쪽 아래 사분면 내에 있고 양수 구슬이 오른쪽 위 또는 아래 쪽 사분면 내에 있도록 사분면 게이트를 배치합니다. 각 집단의 중간 형광강도가 약 같을 때까지 보상 값을 조정합니다. 모든 튜브에 대해 이 단계를 반복합니다.

지금, 실제 얼룩 견본을 취득하기 위하여 진행하십시오. 보상 마법사를 실행하고 날짜, 실험 및 이시사항의 형식으로 설정을 저장합니다. 췌장 덕트 선암의 정형소 이식은 피하 이식에서 본 것과 유사한 급속한 종양 성장을 초래했습니다.

대표적인 헤마톡시린과 에오신 염색 이미지가 표시되고 피하 및 정형소 임플란트의 유사한 성장을 보여줍니다. 합리적으로 높은 실행 가능한 세포 수율은 두 유형의 이식의 종양 샘플로부터 수득하였다. 대표적인 FACS 스플랫은 죽은 세포 및 세포 파편에서 분리된 종양으로부터 실행 가능한 세포를 보여줍니다.

여기에 도시된 종양은 종양 면역 세포의 여러 주요 하위 집합의 주요 및 분자 세포 집단의 면역 프로파일 비교에 침투하는 종양이다. 췌장암의 피하 대 정형소 동종 이식이 나타난다. 데이터는 명확하게 종양이 건강한 마우스의 췌장과 비교되는 때 면역 세포 침투를 현저하게 증가한다는 것을 보여줍니다.

또한, 면역 세포 하위 집합에 침투하는 종양의 다른 백분율은 피하 균형 이식대 직교에서 발견되었다. 예를 들어, 피하보다 정형소에 있는 훨씬 더 많은 B 세포가 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 사전에 모든 관련 재료와 시약을 준비하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 뮤린 모델에 대한 FACS 분석을 수행하는 방법에 대해 잘 이해해야 합니다.