Name: 드 노 보 그렇 구나/TAZ에 의해 체세포 줄기 세포의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: 배우세요 YAP 전사인자를 이용한 체세포 재프로그래밍 기법으로 분화된 세포를 조직특이성 줄기세포로 전환하는 방법입니다. 이 기술은 재생의학과 세포가소성 연구에 활용됩니다.

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우리는 tetO 얍S127A 마우스;의 선물에 감사 F. 카 마르고 R26-rtTAM2 마우스 (주식 #006965)는 잭슨 실험실에서 구입 했다. 우리는 키 아 라 Frasson와 주세페 바소 FACS 절차에 대 한 감사. 이 작품 AIRC 특별 프로그램 분자 임상 종양학 'mille 당 5 '에 의해 지원 되 고는 AIRC PI-그랜트 머리글, 그리고 Epigenetics 플래그십 프로젝트 CNR Miur S.P.에 부여 이 프로젝트는 유럽 연합의 수평선 2020 연구 및 혁신 프로그램 (부여 계약 DENOVOSTEM No. 670126)에서 유럽 연구 회의 (ERC)에서 자금을 받았다.

<ol><li>Panciera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem%2FProgenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP%2FTAZ%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li>
<li>Bar-Nur, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+conversion+induced+by+pluripotency+factors+involves+transient+passage+through+an+iPSC+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).</li>
<li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+reprogramming%3A+strategies%2C+mechanisms%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+plasticity.+Plasticity+of+epithelial+stem+cells+in+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem cell plasticity. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration.</a> Science. 344 (6189), 1242281(2014).</li>
<li>Bai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yes-associated+protein+regulates+the+hepatic+response+after+bile+duct+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation.</a> Hepatology. 56 (3), 1097-1107 (2012).</li>
<li>Cai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+signaling+pathway+restricts+the+oncogenic+potential+of+an+intestinal+regeneration+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program.</a> Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).</li>
<li>Elbediwy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+signalling+regulates+YAP+and+TAZ+to+control+skin+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis.</a> Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).</li>
<li>Taniguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gp130-Src-YAP+module+links+inflammation+to+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gp130-Src-YAP module links inflammation to epithelial regeneration.</a> Nature. 519 (7541), 57-62 (2015).</li>
<li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+of+mutant+KRAS%2C+the+transcription+regulator+YAP+is+essential+for+neoplastic+progression+to+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Sci Signal. 7 (324), ra42(2014).</li>
<li>Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+at+the+Roots+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ at the Roots of Cancer.</a> Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).</li>
<li>Azzolin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+incorporation+in+the+beta-catenin+destruction+complex+orchestrates+the+Wnt+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response.</a> Cell. 158 (1), 157-170 (2014).</li>
<li>Stingl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li>
<li>Means, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+epithelial+plasticity+mediated+by+acinar+cell+transdifferentiation+and+generation+of+nestin-positive+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates.</a> Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).</li>
<li>Shi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+acinar+cell+organization+is+critical+to+preventing+Kras-induced+acinar-ductal+metaplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia.</a> Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).</li>
<li>Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).</li>
<li>Fernandez Vallone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trop2+marks+transient+gastric+fetal+epithelium+and+adult+regenerating+cells+after+epithelial+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage.</a> Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).</li>
<li>Yanger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cellular+reprogramming+occurs+spontaneously+during+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration.</a> Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).</li>
<li>Yui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ-Dependent+Reprogramming+of+Colonic+Epithelium+Links+ECM+Remodeling+to+Tissue+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li>
<li>Pan, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+patterns+of+multipotentiality+in+Ptf1a-expressing+cells+during+pancreas+organogenesis+and+injury-induced+facultative+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration.</a> Development. 140 (4), 751-764 (2013).</li>
<li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).</li>
<li>Lentiviral production and infection. , 
 <a target="_blank" href="http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf">http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf</a> (2016).</li>
</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

여기 선물이 그들의 해당 조직의 특정 조상 세포 (또는 ySCs)로 다른 조직의 비보 전 말기 분화 상피 세포를 프로그램을 프로토콜 얍의 과도 식으로 보고 이전1. 우리 두 절차 세부: lentiviral 벡터와 두 번째 하나는 바이러스 감염을 방지 하 고 유전자 변형 얍 식의 활용을 통해 셀 FACS 정화의 프로그래밍 허용 하나. 각 프로토콜 효율적인 전략을 제시 하 고 문화 기본 차별화 된 세포와 세 하 전략 짖 차별화 된 세포에 유전자 발현에 드 노 보 체세포 조직-특정 확장 줄기 세포 (참조 생성 그림 1A 와 2A음모).
우리는 우리가 결코 부정적인 컨트롤 샘플 (그림 1C 와 2c)에서 어떤 결과 감지 하는 사실에 의해 증명 여기 제시 효과적으로 격리 전략의 차별화 된 셀의 순수한 인구 격리 시연 했다.
기본 유 방 LD 셀의 프로그래밍에 대 한이 연구에 사용 된 lentiviral 벡터 doxycycline 유도할 수 있는 transgene 식;의 꽉 컨트롤의 가능성을 제공 하는 이 설정에 있으며 exogenous 얍 오프에 식을 것 이다. 특히 주의 프로그래밍 효율성 측면에서 해로운 수 과도 한 바이러스 titer의 사용을 피하에 두어야 한다. 주요 포상 세포의 경우 우리는 최소한의 조작으로 얍 따라 프로그래밍를 완전히 유전자 변형 방법 전환. 이 후자의 전략도 고립 된 포상 클러스터는 거의 순종 lentiviral 감염 하 고 매우 깨지기 쉬운 기본 췌 acini 특히 적합 이다. 유전자 변형 전략 고용 유전자 발현의 꽉 컨트롤 doxycycline 종속 lentiviral 벡터의 동일한 이점을 제공 합니다. 또한, 유전자 변형 전략 기본 췌 acini와 착취는 훨씬 높은 재활 효율 유 LD 세포의 바이러스 성 유도 프로그래밍에 비해의 추가적인 장점을 맺는 다. 다른 조직에서 파생 된 셀에 연결 된 다른 본질적인 소성 넘어 췌 장 프로그래밍의 더 높은 속도 모두 균일 하 고 자치 얍 식에 연관 된 식의 높은 효율에서 파생 될 수 있습니다. explanted 셀입니다. 특히, 우리는 외 인 야프는 더 이상 필요 (yMaSC 식민지 그리고 yDucts), ySCs의 생성 후 자신의 자기 재생 능력을 영향을 주지 않고 증명 하고있다. YSCs 생 얍/TAZ를 다시 활성화 하 고 꺼지면 exogenous 얍1자기 갱신에 대 한 그들을 사용 하는 때문입니다.
우리는 ySCs 유전자 계보 추적 유효성 검사1통해 우리의 재활 실험의 원래 셀을 제어 하 여 차별화 된 세포에서 실제로 등장 하는 개념 검증.
광범위 한 특성ySCs의 표시는 일반 체세포 SCs1 로 생성 프로그래밍 유도 하는 YAP) transcriptomic 수준에서 ySCs 네이티브 SCs;와 대규모 중복 표시 ii) ySCs 감 별 법 잠재력을 표시 하 고의 그들의 조직의 정체성을 항상 제한 multilineage 자손을 생성할 수 있습니다. ySCs iii) 변형 비 고 비 tumorigenic 때 생체 내에이식.
여기 우리 또한 유지 하 고 문화에 확장 하는 절차를 설명 100% 지하실 멤브레인 매트릭스 hydrogels에 포함 된 yMaSCs와 organoids로 yDucts. 자기 조직에 대 한 이러한 조건이 허용 stemness 속성 장기 문화에의 유지 보수를 보장 하는 3 차원 organoids에 ySCs의 다운스트림 분석 및 응용 프로그램에 대 한 것입니다 인구 줄기 이러한 확장을 사용. 알 수 없는 이유로, 우리는 yMaSC를 실패 했습니다 배치 하 여 organoids 감염 organoid 문화 조건에 직접 LD 셀 플라스틱 조직 문화 접시; doxycycline 치료 후 7 일 즉, 유 방 식민지 상태에서 중간 성장 단계는 필수적입니다. 우리의 손에 네이티브 MaSCs organoid 문화에 뿌리고 전에 유 방 식민지 상태를 요구 한다. 또한, 가장 효율적인 organoid 파생물은 우리가 단일 세포로 기본 식민지를 해리를 방지 하지만 오히려 organoid 문화 조건에 그대로 식민지를 전송 때 얻어진 다.
Organoid 문화 조건 또한 ySCs, cryopreserve에 organoids cryopreservation 질소 목욕에 있는 이전 셀 분리를 피하고 그들의 행렬에서 복구 되는 주는 장점은 곰.
제시 하는 절차를 프로그래밍 하는 얍 (우리는 테스트 유 방, 췌 장 및 신경 세포를 사용 하 여) 그들의 해당 조직 관련 줄기 세포로 다른 성인 조직에서 파생 하는 뚜렷한 차별화 된 셀 형식을 변환할 수 있습니다1. Ipsc 또는 기타 재활 노력에서 차이에서 얍/유도 SCs 근원의 그들의 직물의 기억을 유지할 수 있다. 메모의 세포 줄기 같은 속성 부여로 체세포의 탈 분화 세포 운명 소성의 유일한 형태 이다 하 고 상처 치유5,17 을 지원 하 고 조직 손상 후 예 vivo에서 관찰 프로그래밍 , 18 , 19 , 20. 그것은 주목할 만한 야프와 TAZ는 크게 일반 항상성 위해 불가결 하지만 여러 조직11,21조직 수리를 위해 중요 한. 일관 되 게 여기 설명 된 재활 단계의 생리 적 기능, 얍/TAZ 최근 표시 되었습니다 발생으로 성인 장 셀의 변환 하 여 궤 양성 대 장 염 환자의 마우스 모델에서 장 재생에 필요한 것으로 태아 창 자19의 기능을 표시 하는 수리 상피 지금까지 시험관을 잡으려고 도전 상태 체세포 줄기 세포를 생성 하는 수단을 제공 하 여 현재 유도 셀 소성 전략 확장 따라서 얍 프로그래밍 합니다. 이 방법은 또한 인간 파생 셀에 확장 하는 경우 체세포 stemness 상태의 연구 재생 의학 응용 프로그램에서 광범위 한 관련 되 고 체세포의 확장을 위한 줄기 세포에 생체 외에서.

조직의 특정 체세포 줄기 세포 (SCs) 부상 후 조직 재생 및 복구에 대 한 중요 하다. 쉽게 분리 하 고 unlimitedly 확장 한다 확장 ex vivo 체세포 SCs 나타냅니다 중요 한 문제가 잠재적인 재생 치료, 뿐만 아니라 기본 연구 및 질병 모델링에 SC 응용 프로그램에 대 한 가능성. 하지만이 방향으로 진행, 다양 한 상피 장기 체 외의 SC 상태 캡처의 어려움에 의해 제한 되었습니다. 실제로, 여러 성인 조직에서 거주 SCs 수 있습니다 존재 하지 쉽게 사용할 수 없습니다 또는 그들의 번호와 재생 잠재력 노화 또는 질병 조건에 의해 침식 수 있습니다. 2016 년, 우리는 그 표현의 단일 transcriptional coactivator 보고 하 여이 간격을 채우기 위해 시작 얍 (예-관련 된 단백질) 또는 말기 차별화 된 세포로 그것의 밀접 하 게 관련된 단백질 TAZ (PDZ 모티브로 transcriptional 활성 제), 효율적으로 운영 및 분자로 그들의 해당 조직의 특정 SCs1분간 되지 않은 기능, 확장, 비 tumorigenic, 자가 세포 인구를 만듭니다. 펄스 지속 얍 또는 몇 일 동안 TAZ 활동 자체 갱신 체세포 SCs의 외관을 유도 하기에 충분. 이것은 소성 얍/TAZ1식 추가 없이 셀 세대를 통해 전달 될 수 있다로 연속 transgene 식에 의존은 더 이상 안정 된 상태 이다. 프로토콜 제시 여기 내용은 유선 및 췌 장,이 조직의 차별화 된 세포에서 시작의 드 노 보 상피 줄기/뿌리 세포를 생성 하는 데 사용 되는 절차. 이 절차는 현재 프로그래밍/transdifferentiation 경기장에서 블랙 박스를 채웁니다. 주요 활동 방향으로 지금까지 실제로 셀 전환 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 상태로, 이러한 배아의 변환 다음에 중심으로 고로 만능 SCs는 더 세포 분화. 그러나, Ipsc tumorigenic는 한 번 그들의 완전 하 고 효율적인 차별화2에 대 한 프로토콜 개발의 필요성을 제기 하는 성인 조직에 도입. 그러나,이 감 별 법 단계 가능한 경우에 온다 장기 확장성, 자기 조직 및 기관 repopulation 잠재력의 가격. 이들은 일반 생 조직 관련 SCs의만 및 현재 설명된 유도 하는 YAP SCs (ySCs)의 실제로 장기 재생을 위한 필수 특성입니다. 마찬가지로, 다양 한 녹음 방송 요인 또한 생성의 칵테일을 사용 하 여 다른 한 셀 형식의 직접 transdifferentiation 필수 증식 stemness 잠재적인3부족 세포 분화.
여기 설명 하는 절차 또한 활용 최근에 소개 된 organoid 기술, 여 생 SCs 확장 될 수 있다 및 비보 전4분화. 유도 하는 YAP SCs는 생 SCs 존재 하지 않는 실험, 생물 학적 또는 질병 조건 에서도 organoid 형성 SCs를 생성할 수 있습니다. 우리는, 다른 재활 절차와 차이에 셀 소성 얍에 의해이 수의 유형 생활 조직에서 발생 하는 사우스 캐롤라이나와 같은 상태에 복귀의 유일한 형태에 해당 수 있습니다 싶습니다. 사우스 캐롤라이나-같은 특성의 획득 조직 복구 또는 종양 활성화5와 연결 되었습니다. 비록 여러 성인 조직의 항상성 위해 불가결, 야프 TAZ는 재생, 종양 성장 및 체 외1,6,,78 체세포 SCs의 확장에 대 한 절대적으로 필수 9,10,,1112

<table><tbody><tr><td>10 mL 멸균 주사기</td><td>광선</td><td>10LC</td><td></td></tr><tr><td>100 mm&nbsp; 셀 여과기</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 멸균 원뿔형 튜브</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>24-well 초저 부착 플레이트</td><td>Costar</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>40 mm 셀 여과기</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>48-well 멀티웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 멸균 코니컬 튜브</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>6웰 멀티웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco 12634028</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소, 유형 I</td><td>시그마</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>시그마</td><td>D4902&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>1705-041</td><td></td></tr><tr><td>일회용 메스</td><td>Swann-Morton</td><td>0503</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DnaseI</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>doxycycline hyclate</td><td>Sigma</td><td>D9891&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 100%</td><td>Sigma</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>FACS 튜브 (스트레이너 캡 포함)</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FBS Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC 안티-마우스 CD326 (Ep-CAM)</td><td>BioLegend</td><td>118208</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&nbsp;</td><td>애드진</td><td>&nbsp;#19780&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FUW-tetO-EGFP</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84041</td><td>음성 대조군으로 사용</td></tr><tr><td>FUW-tetO-MCS</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84008</td><td>음성 대조군으로 사용</td></tr><tr><td>FUW-tetO-wtYAP</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84009</td><td></td></tr><tr><td>FUW-tetO-YAPS94A</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84010</td><td>음성 대조군으로 사용(전사적으로 죽은 YAP 돌연변이)</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>30721</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 나트륨 소금</td><td>Sigma</td><td>H3149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 완충 용액 (1M)</td> <td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>인간 R-Spondin1 (His Tag)</td> 소 고환의 <td>Sino Biological</td><td>11083-H08H-5</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H3506&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>K-14 항체</td><td>Life Technologies</td><td>Ab7800&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>K-8 항체</td><td>Life Technologies</td><td>Ab14053&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; </td><td></td>25030081</tr><tr><td>Lin (allophycocyanin [APC] 마우스 계통 항체 칵테일)</td><td>BD Biosciences</td><td>51-9003632</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&reg; 성장 인자 감소 기저막 매트릭스, 페놀 레드-프리</td><td>코닝</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸시스테인</td><td>시그마</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T.Baker</td><td>0402</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>시그마</td><td>A9434&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>시그마</td><td>72340</td><td></td></tr><tr><td>비셀 접착제 10cm 접시(멸균 폴리스티롤 페트리 접시 &oslash; 94)</td><td>ROLL</td><td>18248</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Euroclone</td><td>ECM4004XL</td><td></td></tr><tr><td>PE 햄스터 안티 마우스 CD61</td><td>BD Biosciences</td><td>553347</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f</td><td>BD Biosciences</td><td>551129</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 안티-마우스/랫트 CD29 항체</td><td>BioLegend</td><td>102222</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Rat Tail Collagen I (코팅)</td><td>Sigma</td><td>122-20</td><td></td></tr><tr><td>Rat Tail Collagen I for 3D culture</td><td>Cultrex</td><td>3447-020-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>재조합 쥐 EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>재조합 쥐 FGF 염기성 (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 배지</td><td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>SBTI (트립신 억제제 글리신 최대)</td><td>시그마</td><td>T6522&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,05%</td> <td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Waymouth 매체</td><td>Gibco</td><td>31220023</td><td></td></tr></tbody></table>

드 노 보 그렇 구나/taz에 의해 체세포 줄기 세포의 생성

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

여기 기본 분화 세포 및 녹음 방송 요인의 과도 식으로 같은 혈통의 줄기/시 조 세포 (SCs)로 그들 짖 차례 분리 프로토콜 선물이. 이 방법으로 마우스 유선의 luminal 차별화 (LD) 세포는 유 방 SCs. 얍 분자 속성과 기능 또한 회전 완전히 분화 췌 장 외 분 비 세포 췌 장로 덕트 같은 셀으로 변환 됩니다. 창시자입니다. 마찬가지로, 내 생, 자연 SCs를 유도 하는 YAP 줄기 모양의 셀 ("ySCs") 확장할 수 있습니다 결국 organoid 문화 장기 생체 외에서, 소성 얍/TAZ의 추가 필요 없이 상속 자체 갱신 SC 같은 상태와 부여 하는 ySCs로.
여기에 제시 된 재활 절차를 생성 하 고 차별화 된 셀에서 시작 하는 다양 한 조직 소스의 조상 세포 생체 외에서 확장 가능성을 제공 합니다. Ex vivo 체세포의 간단한 확장 세포 및 개발 생물학 연구를 위한 일반적으로 종양 개시의 메커니즘을 이해 하 고, 더 많은 대 한 재생 의학에 대 한 의미를 갖는다.

YMaSCs의 생성 얍의 과도 식으로 기본 유 방 LD 셀 프로그램을 실험 전략의 개요 그림 1A에 제공 됩니다. 기본 유 방 LD 상피 세포13정렬 형광 활성화 된 세포에 의해 정화 된다. 그림 1B 세 가지 가지 부분 모집단을 얻기 위해 일반적인 정렬 프로시저를 나타냅니다: 기저 세포 (EpCAM낮은CD49f높은CD61-), Luminal 조상 (LP) 세포 (EpCAM높은CD49f낮은CD61+ )와 LD 셀 (EpCAM높은CD49f낮은CD61-). 주의 3 부분 모집단의 게이팅 격리 LD 셀의 순수한 준비 필수, 그는 완전히 분화 하 고 성장 때 유선 식민지 형성 ( 그림 1C, 왼쪽 패널 참조)에서 시드를 체포 하는 완전히. 반대로, exogenous 얍을 표현 하도록 유도, LD 셀 시작 5% 지하실 멤브레인 매트릭스 현 탁 액 문화 (그림 1C)에 쉽게 인식할 수 있는 조밀한 상피 식민지를 확산. 프로그래밍, 효율 인증 약 3%는 전형적인 실험, 원래 지하실 멤브레인 매트릭스 현 탁 액 문화 (그림 1D)에 시드 단일 셀의 수에 식민지의 수를 계산 하 여 득점 될 수 있다. 재설정된 luminal 셀 (yMaSCs) 다음 상태로 100% 지하실 멤브레인 매트릭스 organoid 문화 ( 그림 1A에서 구성표 참조), 스스로 여러 루멘 주위를 개발 하는 복잡 한 organoid 같은 구조로 조직 통과 수 고 doxycycline (즉 유전자 변형 얍 식의 부재에서)의 부재에도 놀라운 자기 재생 능력을 표시 (그림 1E). 조직학, yMaSC에서 파생 된 organoids 표시 기저 레이어 (긍정적인 K14), ECM 및 luminal 레이어 (K8 긍정적인), organoid (그림 1 층) 내에서 루멘 모양의 구멍을 직면 하 고 재구성 지하실 멤브레인 매트릭스를 직면 하 고. 이 아키텍처는 네이티브 MaSCs (그림 1 층)에 의해 형성 하는 organoids의 저것에서 구별할 수 없습니다.
YDucts의 생성 주 췌 acini 야프의 과도 식으로 프로그램을 실험 전략에 대 한 개요는 그림 2A에 표시 됩니다. 전체 포상 클러스터 온화한 분리 및 여과 통해 크기 배제의 조합에 의해 췌 장 조직의 대부분에서 격리 됩니다. 일반적인 준비는 그림 2B에서 제공 됩니다. 절연, 포상 세포 클러스터 exocrine 포상 단위의 균질 크기, 내 분 비 Langerhans islets 또는 췌 장 ductal 트리와 단일 셀에 최소한의 분리의 조각에 의해 오염 없이의 정지로 표시 됩니다. 내 분 비 작은 섬 또는 ductal 파편 오염은 가혹한 처리;으로 인해 부족 한 선택적 여과 (2.1.10 단계)의 표시 단일 셀에 포상 클러스터의 원치 않는 분리 추가 SBTI 치료 curbed 수 조직에 의해 발표 하는 분해 효소의 과도 한 콜라 치료 또는 버퍼링으로 인해 수 있습니다.
전형적인 포상 재활 실험은 그림 2C; 제시 3D 콜라겐에서 문화의 5-7 일 이내-히드로 doxycycline 존재를 기반으로, 췌 장의 acini R26-rtTAM2/tetO-얍S127A 마우스에서 쉽게 파생 덕트 같은 클러스터로 얇은 작곡 (그 우리 라는 yDucts), 확장 중앙 구멍 주위 확산 상피 세포의 단층. 약 70% 인 전형적인 실험에 대 한, 재활 효율성 시드 acini (그림 2D)의 총 수에 덕트 같은 클러스터 수를 득점으로 쉽게 측정할 수 있습니다. 부정적인 통제 세포, 즉 R26-rtTAM2 / + 셀 또는 R26-rtTAM2/tetO-얍S127A 셀 왼쪽 doxycycline, 하지 않고 변함없이 유지 하지 이러한 문화 조건에, 이전 보고1 포스트 mitotic 포상 클러스터로 ,,1415. 있으 나 재설정된 yDucts Matrigel 기반 organoid 문화 조건16 으로 단일 세포 수준에서 다음 passaged 될 수 있다 ( 그림 2A에서 구성표 참조), doxycycline (즉 의 부재에도 놀라운 자기 재생 능력을 표시 유전자 변형 얍 식의 부재)에서 (그림 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig1.jpg"> 그림 1: 기본 유 방 LD의 고립 세포와 유도의 유 방 줄기 세포. (A) 실험 절차의 도식 표현 기본 유 방 LD 셀 프로그램을 채택 했다. (B) 대표 FACS-구획 전형적인 정렬 절차를 보여주는 LD 세포를 정화. i) 천연된 셀 고 측면 분산형 라이브 셀 (P1; 블루);에 따라 문이 ii) 인구 P1의 린 프로 파일에 따라 추가 문이 다음: 혈통 부정적인 세포 (P2; 그레이)의 부분 모집단 선택 제외 혈통 긍정적인 조 혈 모 세포; 3) 인구 P2 다음는 EpCAM높은 (P3, 옐로우 + 그린)와 EpCAM낮은 (P6, 레드) 모집단;으로 구분 4) P3, P6는 다음 추가 문이 그들의 CD61/CD49f 프로 파일에 따라 3 개의 모집단으로: EpCAM낮은CD49f높은CD61- 기저 세포 (P7, 레드), EpCAM높은CD49f낮은CD61+ LP 셀 (P8, 노랑) 그리고 EpCAM높은CD49f낮은CD61- LD 셀 (P9; 녹색). (C) 이미지는 유 방 식민지 매체에 뿌리기 후 15 일 유 방 식민지를 형성 하는 LD 셀, 지정 된 구조와 감염의 기능 설명입니다. 식민지 형성으로 셀 턴 얍 표현 셀, 반면 부정적인 제어 (EGFP 감염) 세포 유지 성장 체포 단일 셀으로. 눈금 막대 = 50 μ m. (D) (C)에서 표시 된 셀의 능력을 형성 하는 식민지의 정량화. 데이터 의미 + 사 우 스 다코타 제시 되며 각각 6 기술 복제 5 개의 독립적인 실험의 대표. (E) 얍 재설정 유 방 줄기 세포와 같은 세포 (yMaSCs) 상태로 organoid 문화에 신선한 3 차원 100% 지하실 멤브레인 매트릭스 히드로 부재에 Doxycycline의 12 일 후의 대표 이미지. 눈금 막대 100 μ m =. (F) organoids의 (레드) luminal 마커 K8 기저 마커 K14 (녹색)에 대 한 대표적인 면역 형광 이미지 organoid 문화 조건에 12 일 후에 하는 지정 된 셀에서 파생 된. 눈금 막대 = 10 μ m. 이 그림은 Panciera 그 외 여러분, 20161에서 재생 된다. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig2.jpg"> 그림 2 : 기본 췌 장 acinar 세포 및 췌 장 창시자의 유도의 격리. (A) 실험 절차의 도식 대표 주 췌 exocrine 포상 세포를 프로그램을 채택. (B) 기본 췌 acini 격리 절차 (단계 2.1.14) 직후의 대표 이미지. 포상 준비 포상 클러스터의 균질 정지로 단일 셀의 최소한의 존재와 함께 나타납니다. 눈금 막대 = 400 μ m. (C) 기본 췌 acini의 대표 이미지 R26-rtTAM2 (위 패널)에서 파생 된또는 R26-rtTAM2; tetO 얍S127A (낮은 패널) 쥐 나 3 차원 콜라겐에 경작 하 고-함께 또는 없이 5 일 동안 하이드로 겔을 기반으로 Doxycycline (doxy), 표시 된 대로입니다. 만 주 acini 얍 표현 Doxycycline 추가 후 낭종 같은 organoid로 성장 하는 셀을 변환 합니다. 스케일 바 = 70 μ m. (D) (C)와 같이 유전자 변형 얍 overexpression에 ductal organoids를 형성 하는 췌 장 acini의 기능의 정량화. 데이터 의미 + 사 우 스 다코타 제시 되며 4 개의 기술 복제 수행 5 개의 독립적인 실험의 대표. (E) 얍 reprogramed ductal 같은 셀 (yDucts) 후 신선한 3 차원 100% 지하실 멤브레인 매트릭스 히드로 Doxycycline의 부재에 3 구절의 대표 이미지. 눈금 막대 = 130 μ m. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">기본 유 방 세포의 고립</td>
		</tr>
<tr>
<td>캘리포니아2 + 해결책 킬레이트 화</td>
			<td>4 ° C에서 저장소</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>0.02 %w / V</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">콜라겐 코팅 솔루션 나</td>
		</tr>
<tr>
<td>초 산 0.02N, pH 3,23</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>쥐 꼬리 콜라겐 (코팅)</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase 솔루션</td>
			<td>4 ° C에서 저장소</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>분리 매체</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase 재고 솔루션</td>
			<td>400 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>펜/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>재고 솔루션 콜라 나</td>
			<td>600 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Haemolytic 솔루션</td>
			<td>4 ° C에서 저장소</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl 솔루션</td>
			<td>1 부품</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisBase 20.6 g/L</td>
			<td>9 부품</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.2 조정</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS/PS</td>
			<td>4 ° C에서 저장소</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>펜/Strep</td>
			<td>2 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase 재고 솔루션</td>
			<td>0.2 µ m 필터, 4 ° C에서 저장</td>
		</tr>
<tr>
<td>소 고환 (분말)에서 hyaluronidase</td>
			<td>2000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>나트륨 인산 염 버퍼 1 M pH7.3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl 솔루션</td>
			<td>T. amb에 저장 합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl</td>
			<td>7.1 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>7.65에 pH를 조정</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>솔루션을 정렬</td>
			<td>0.2 µ m 필터, 4 ° C에서 저장</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>1mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES pH 7</td>
			<td>25 m m</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>세척 매체 #1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>펜/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>세척 매체 #2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>펜/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>유 방 2D 문화 매체</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
<tr>
<td>헤 파 린</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-글루타민</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>murine bFGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murine EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>펜/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">유도 및 yMaSCs의 Passaging</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">유 방 식민지 매체</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>헤 파 린</td>
			<td>4 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-글루타민</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Matrigel (뿌리기 직전 추가)</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>murine bFGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murine EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>펜/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">유 방 Organoid 매체</td>
		</tr>
<tr>
<td>고급 DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>GlutaMax</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>헤 파 린</td>
			<td>4 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>인간의 머리</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murine bEGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murine EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 µ g/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: yMaSCs의 생성. 모든 다른 문화 미디어와 기본 유 방 LD 세포의 분리 및 yMaSCs (제 1)의 유도에 필요한 솔루션의 구성
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">주 췌 acini의 절연</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">문화 매체 포상</td>
		</tr>
<tr>
<td>BPE</td>
			<td>50 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dexamethasone</td>
			<td>1 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>그것의 X</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>펜/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Waymouth의 매체</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">포상 세척 매체</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>펜/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>RPMI 매체</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">포상 복구 매체</td>
		</tr>
<tr>
<td>문화 매체 포상</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">콜라 나 솔루션 A</td>
		</tr>
<tr>
<td>포상 세척 매체</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>재고 솔루션 콜라 나</td>
			<td>360 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS/PS</td>
			<td>4 ° C에서 저장소</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS (인산 염 버퍼 염 분)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>펜/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>재고 솔루션 콜라 나</td>
			<td>-20 ° C에서 저장소</td>
		</tr>
<tr>
<td>콜라, 유형 I (분말)</td>
			<td>6000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">췌 장 organoids의 뿌리고</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">콜라 나 솔루션 B</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS 1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>재고 솔루션 콜라 나</td>
			<td>240 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">췌 장 Organoid 매체</td>
		</tr>
<tr>
<td>고급 DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>gastrin</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>인간 FGF10</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>인간의 머리</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murine EGF</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-진</td>
			<td>1.25 m m</td>
		</tr>
<tr>
<td>니코틴</td>
			<td>10 m m</td>
		</tr>
<tr>
<td>펜/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: yDucts의 생성. 모든 다른 문화 미디어와 yDucts (제 2)의 뿌리고 주 포상 세포와 유도의 격리에 필요한 솔루션의 구성

체세포 SCs의 가용성은 재생 의학에 대 한 중요 한 질병 모델링 및 사우스 캐롤라이나 속성에 대 한 통찰력을 얻을. 여기에 우리가 프로그램을 실험 전략 제시 에 체 외, 단일 transcriptional 공동 활성 야프의 과도 식으로 그들의 해당 확장 조직 관련 줄기/시 조 세포로 성인 세포 분화.

드 노 보 그렇 구나/TAZ에 의해 체세포 줄기 세포의 생성

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

이 절차의 전반적인 목표는 전사 인자 YAP의 일시적 발현에 의해 1차 분화된 세포를 동일한 계통의 전구 세포로 전환하는 것입니다. 이 재프로그래밍 절차는 내인성 줄기세포가 드물거나 식별하기 어려운 경우에도 분화된 조직으로부터 시작하여 다양한 조직의 체외 전구 세포와 유사하거나 줄기와 같은 세포를 생성할 수 있는 가능성을 제공합니다. 체세포를 체외로 확장할 수 있는 가능성은 재생의학, 암과 관련된 세포 가소성의 메커니즘을 이해하고, 세포 조직 및 생물학 연구의 발전에 영향을 미칩니다.이 절차는 배아 줄기세포 분화를 통해 특수 세포를 만드는 것이 아니라 분화된 세포에서 조직 특이적 줄기세포를 만드는 것을 목표로 하기 때문에 현재 재프로그래밍 분야의 블랙박스를 채웁니다. 텍스트 프로토콜에 따라 10마리의 암컷 마우스를 희생한 후 복부 피부를 따라 Y자형으로 절개하여 유선을 절개합니다. 그런 다음 듀몽 집게를 사용하여 부드럽게 당겨 땀샘과 복막을 조심스럽게 분리합니다.절개된 땀샘을 10ml의 얼음처럼 차가운 HBSS+PS와 함께 비세포 접착 접시에 넣습니다. 조직 배양 후드 아래에서 10ml의 신선한 HBSS+PS를 사용하여 각 글랜드를 한 번 세척한 다음 빈 비세포 접착 접시에 넣습니다. 그런 다음 두 개의 멸균 메스를 사용하여 분비샘을 1입방 밀리미터 조각으로 잘게 다집니다.땀샘의 적절한 다지기는 효율적인 세포 분리를 위해 필수적입니다. 20개의 땀샘을 함께 당겨 최적의 세포 생존력을 위해 3-5분 이내에 이 단계를 수행하십시오. 25 ml의 혈청학적 피펫과 10 ml의 해리 배지를 사용하여 각 접시에서 다진 조직을 회수하고 50 ml 원뿔형 튜브에 현탁액을 5회 이상 피펫팅하여 조직 덩어리를 분해합니다.섭씨 37도에서 1시간 동안 조직을 지속적으로 격렬하게 흔들어 배양합니다. 그런 다음 소화된 조직을 실온에서 400배의 g으로 5분 동안 회전시킵니다. 상층액을 버린 후 3ml의 용혈액을 사용하여 조직을 재현탁시키고 얼음 위에서 3분 동안 배양합니다.다음으로, 10 밀리리터의 세척 매체 1 번으로 세포를 씻습니다. 소화된 조직을 회전시키고 상층액을 버린 후, 조직 펠릿을 10ml의 세척 매체 2번에 재현탁시키고 10cm 조직 배양 접시에 세포를 플레이트화합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 1시간 동안 접시를 배양합니다.세포 현탁액을 50ml 원뿔형 튜브로 회수하고 튜브를 400회 g으로 5분 동안 회전시킵니다. 그런 다음 10ml의 칼슘 킬레이트 용액을 사용하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 원심분리 후 세척을 반복한 후 펠릿을 5ml의 0.25% 트립신-EDTA에 재현탁합니다.샘플을 배양한 후, 트립신 용액 위에 DNase 1 밀리리터당 1마이크로그램이 보충된 디스페이아제 용액 5ml를 추가합니다. 덩어리를 분해하려면 1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 최소 5회 위아래로 피펫팅하고 3분마다 흔들면서 10분 동안 섭씨 37도에서 샘플을 배양합니다. 10ml의 세척 매체 2번을 넣고 40마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 용액을 새로운 50ml 원뿔형 튜브로 여과합니다.그런 다음 세포 현탁액을 스핀다운합니다. FACS에 의한 세포 정제를 수행하려면 200마이크로리터의 세척 매체 1번을 사용하여 각 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 44.5마이크로리터의 항체 혼합물을 추가하고 철저히 피펫팅한 다음 얼음 위의 어두운 곳에서 30분 동안 샘플을 배양합니다.세포 현탁액을 10ml의 세척 매체 1번으로 희석하고 샘플을 스핀다운합니다. 세포 펠릿을 2ml의 분류 용액에 재현탁하고 세포 집단의 FACS 분리를 진행하기 전에 캡 스트레이너 FACS 튜브를 통해 여과합니다. 1번 세척 용액을 사용하여 FACS에서 회수된 세포를 세척합니다.상층액을 제거한 후 유방 2D 배양 배지를 사용하여 세포 펠렛을 재현탁하고 콜라겐 처리된 플레이트에 웰당 500마이크로리터를 플레이트합니다. 렌티바이러스에 감염된 원발성 LD 세포의 독시사이클린 유도 7일 후, 05% 트립신-EDTA를 웰당 150마이크로리터씩 세포에 첨가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 세포를 세척하고 계수한 후에는 독시사이클린 밀리리터당 2마이크로그램을 보충한 메모리 콜로니 배지를 사용하여 세포를 재현탁시킵니다.그런 다음 콜로니와 같은 마스크를 발현하는 YAP 배양을 위해 24 웰 초저 부착 플레이트에 웰당 1, 000 세포를 파종합니다. y 마스크를 과대배양하려면 각 샘플을 수집하고 10:1 부피의 얼음처럼 차가운 HBSS를 첨가한 다음 기저막 매트릭스를 용해시키기 위해 샘플을 얼음에서 1시간 동안 배양합니다. 군체를 회전시킨 후 얼음처럼 차가운 HBSS를 사용하여 세포를 세 번 씻습니다.그런 다음 05%트립신-EDTA를 콜로니에 추가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 콜로니를 P1000 피펫 팁에 10회 통과시켜 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 그런 다음 24 웰 초저 부착 플레이트에서 독시사이클린이 없는 유방 콜로니 배지에서 세포를 계수하고 웰 당 000개의 세포의 콜로몬 밀도로 다시 파종합니다.세 번째 통과에 앞서, 유방 집락 배지에서 집락을 회수하여 오가노이드 배양 조건에서 y 마스크 집락을 옮기고 100% 성장 인자 감소 기저막 매트릭스를 사용하여 다시 현탁시킵니다. 배양 후 기저막 매트릭스가 응고되면 겔을 500마이크로리터의 유방 오가노이드 배지로 오버레이합니다. 각 오가노이드 샘플을 채취하여 얼음 위에서 1시간 동안 과도한 양의 HBSS를 배양하여 배양합니다.그런 다음 얼음처럼 차가운 HBSS를 사용하여 오가노이드를 세 번 세척합니다. 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 오가노이드를 트립신화하고 100% 성장 인자 감소 기저막 매트릭스를 떨어뜨려 단일 세포 현탁액을 다시 시딩한 다음 500마이크로리터의 유방 오가노이드 배지를 사용하여 겔을 오버레이합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 소화된 마우스 췌장 조직을 세척한 후, 6ml의 아시나르 회수 배지를 사용하여 분해된 조직을 조심스럽게 재현탁시키고 6웰 조직 배양 플레이트의 2웰로 분할합니다.실체 현미경으로 acinar isolation의 품질을 주의 깊게 평가하고 최종적으로 존재하는 큰 조직 덩어리를 제거합니다. 일차 췌장 아시니를 파종하려면 세포 회수를 위해 클러스터를 2시간 동안 배양한 후 원뿔형 튜브에 아시나르 세포 현탁액을 수집하고 샘플을 100배 g 및 섭씨 18도에서 5분 동안 원심분리합니다. acinar 배양 매체에 acini를 재현 탁 한 후, 동일한 부피의 중화 된 쥐 꼬리 콜라겐 하나의 용액으로 현탁액을 희석하여 튜브를 얼음 위에 유지합니다.신중하고 빠르게 혼합하고 콜라겐 쿠션 위에 있는 16웰에 세포 현탁액을 뿌립니다. 췌장 아시니의 최적 파종을 위해서는 도금하기 전에 모든 튜브를 얼음 속에 보관하고 빠르게 진행하는 것이 중요하지만, 동시에 균일한 콜라겐 매트릭스를 만들기 위해서는 기포 형성을 피하기 위해 조심스럽게 피펫팅하는 것이 필수적입니다. 세포를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하여 하이드로겔이 형성되도록 합니다.그런 다음 췌장 오가노이드를 유도하기 위해 콜라겐 하이드로겔에 독시사이클린이 보충된 500마이크로리터의 아시나르 배양 배지를 오버레이합니다. 오가노이드를 계대배양하려면 배양 배지를 버리고 하이드로겔을 조심스럽게 추출한 다음 4밀리리터의 콜라겐분해효소 I 용액 B가 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮긴 다음 세포를 회전시키고 상층액을 제거하기 전에 섭씨 37도에서 튜브를 30분 동안 격렬하게 흔들어 배양합니다. 세포를 트립신화하고 PBS 상등액을 제거한 후 얼음처럼 차가운 기저막 매트릭스를 사용하여 세포 펠렛을 재현탁하고 초저 부착 플레이트에 현탁액을 시딩합니다.기저막 매트릭스 하이드로겔이 섭씨 37도에서 플레이트를 40분 동안 배양하여 응고되도록 한 다음 췌장 오가노이드 배지로 오버레이합니다.yDucts는 7-10일 안에 오가노이드와 같은 낭종으로 자랄 것입니다. 원발성 유방 LD 상피 세포를 여기에 표시된 세 가지 하위 집단으로 신중하게 게이팅하는 것은 유선 집락 형성 조건에서 파종될 때 완전히 분화되고 성장이 완전히 정지된 LD 세포의 순수한 준비를 분리하는 데 필수적입니다.반대로, 외인성 YAP를 발현하도록 유도되면 LD 세포가 증식하기 시작하여 5% 기저 막 매트릭스 현탁액 배양에서 쉽게 인식할 수 있는 조밀한 상피 콜로니를 형성합니다. 기저막 매트릭스 오가노이드 배양 조건에서 재프로그래밍된 내강 세포는 여러 루멘 주변에서 발달하고 독시사이클린이 없는 경우에도 자체 재생되는 복잡한 오가노이드와 같은 구조로 자체 조직화됩니다. 독시사이클린(doxycycline)이 존재하는 상태에서 3D 콜라겐 I 기반 하이드로겔을 배양한 5-7일 이내에 분화된 췌장 아시니(panrcreatic acini)는 팽창하는 중앙 구멍 주위에서 증식하는 상피 세포의 얇은 단층으로 구성된 덕트 또는 y덕트와 같은 클러스터로 쉽게 변합니다.재프로그래밍 효율은 파종된 아시니의 총 수에 대해 클러스터와 같은 덕트의 수를 점수화하여 쉽게 측정할 수 있습니다. 그런 다음 재프로그래밍된 yDucts는 단일 세포 수준에서 matrigel 기반 오가노이드 배양 조건으로 배양될 수 있으며, 이는 내인성 YAP 발현이 없는 경우에도 놀라운 자가 재생 능력을 보여줍니다. 두 가지 절차를 자세히 설명했습니다.하나는 렌티바이러스 벡터를 통해 FACS 정제된 세포를 재프로그래밍하는 것이고, 다른 하나는 바이러스 감염을 피하고 형질전환 YAP 발현을 활용하는 것입니다. 유방 세포의 재프로그래밍을 시도하는 동안, 재프로그래밍 효율성에 해로울 수 있으므로 과도한 바이러스 역가의 사용을 피하는 것이 중요합니다. 완전 형질전환 전략은 원발성 췌장 아시니(primary pancreatic acini)에 적합한데, 이는 렌티바이러스 감염에 거의 순응하지 않기 때문이다.또한 유전자 발현의 유형 조절을 위해 doxycycline dependent lentiviral 벡터와 동일한 이점을 제공합니다. 여기에서 입증된 exampes 외에도 이 YAP 재프로그래밍 프로토콜은 분화된 뉴런을 증식하는 뉴런 자체로 변환하는 데 성공적인 것으로 입증되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 다른 성체 조직의 분화된 세포 유형을 해당 조직 특이적 줄기 세포로 변환하기 위해 YAP 의존적 재프로그래밍을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 절차는 재생 의학, 체세포 줄기세포 연구 및 체외 체외 줄기세포 증식과 관련이 있을 수 있는 체세포 줄기세포를 생성하는 수단을 제공함으로써 현재의 재프로그래밍 전략을 확장합니다. 렌티바이러스 제제의 취급은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 안전 수준에 따라 두 가지 조치를 취해야 합니다.

de-novo-generation-of-somatic-stem-cells-by-yaptaz

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 inducible의 lentivirus를 사용하여 유도된 pluripotent 줄기 세포를 생성하는 절차를 보여줍니다 표현 Oct4, Sox2, C - Myc와 Klf4.

삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4

OCT4의 레트로 바이러스 - 매개 자궁외 표현을 통해 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (iPSCs) 생성하는 방법은, SOX2, KLF4 및 MYC가 설명되어 있습니다. GFP 발현을 바탕으로 인간 iPSC 식민지를 식별하기위한 실용적인 방법도 설명되어 있습니다.

GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍

여기 하나의 lentiviral 재활 벡터를 사용하여 말초 혈 3-4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 즉시 사용할 수 혈액 세포의 재 프로그래밍하면 폭 넓은 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 활용을 촉진 것을 약속드립니다.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 연구는 기형종의 생성 없이 생체 내에서 다능성을 향한 체세포의 재프로그래밍을 보여줍니다. 우리는 Yamanka 인자를 인코딩하는 플라스미드 DNA의 유체역학적 꼬리 정맥 주입을 사용하여 성체 간세포의 생체 내 재프로그래밍을 강화된 다능성의 세포로 유도했습니다.

야마나카 인자의 과발현에 의해 능성에 성인 체세포 세포의 생체 내 재 프로그램

유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 - 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 인간 성인 말초 혈액 세포에서 통합이 없는 iPSC를 효율적으로 생성하기 위한 자세한 방법을 설명합니다. 재프로그래밍 인자를 발현하기 위해 KLF4, MYC, BCL-XL 또는 OCT4 및 SOX2와 같은 4개의 oriP/EBNA 기반 에피솜 벡터를 사용하여 1mL의 말초 혈액에서 수천 개의 iPSC 콜로니를 얻을 수 있습니다.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

원시 생식 세포 (PGCs)는 정자와 모두의 일반적인 선구자. 인간의 배아 PGCs cytokines의 상호 작용을 통해 만능 epiblast 셀에서 지정 됩니다. 여기, 우리가 유도 액 pluripotency 유도 만능 줄기 세포에서 embryoid 몸 표면에 PGCs을 닮은 인간의 세포 transcriptomally의 13 일 프로토콜을 설명 합니다.

액 pluripotency에서 Embryoid 몸의 표면에 인간의 원시 생식 세포와 같은 세포의 생성 유도 만능 줄기 세포

이 프로토콜은 여전히 뇌 세포 유형과 세포 조직의 많은 기능의 다양성을 유지하면서 외인성 성장 인자 또는 지하 막 매트릭스없이 단순화, 저렴한 비용으로 뇌 오르가노이드를 생산하는 수단으로 생성되었다.

인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오르가노이드를 생성하기위한 정적 자기 지향 방법

여기서는 화학적 후성유전학적 소거와 메카노센싱 관련 단서를 결합하여 유전자 형질감염이나 레트로바이러스 벡터가 필요 없이 포유동물 다능성 세포를 효율적으로 생성하는 방법을 제시한다. 따라서이 전략은 번역 의학에 유망하며 줄기 세포 오가노이드 기술의 주목할만한 발전을 나타냅니다.

후성유전학적 변형과 생체역학적 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 전략

이 논문에서는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 공막의 과발현과 2D 바이오리액터를 통한 단축 스트레칭이 결합된 iPSC 유래 중간엽 기질 세포를 생성하여 iTenocyte를 생성하는 절차에 대해 설명합니다.

Generation of induced pluripotent stem cell-derived iTenocytes via combined scleraxis overexpression and 2D Uniaxial tension(공막 과발현 및 2D 단축 장력 결합을 통한 유도만능줄기세포 유래 iTenocytes 생성)

배우세요 YAP 전사인자를 이용한 체세포 재프로그래밍 기법으로 분화된 세포를 조직특이성 줄기세포로 전환하는 방법입니다. 이 기술은 재생의학과 세포가소성 연구에 활용됩니다.

드 노 보 그렇 구나/TAZ에 의해 체세포 줄기 세포의 생성

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