Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

이 프로토콜의 전반적인 목표는 형광 현미경을 통해 단일 세포 수준에서 인플라마솜 활성화를 검사하고 젖산 탈수소효소 또는 LDH 방출 분석법에 의한 파이롭토시스 중 용해를 측정하는 것입니다. 이 방법은 Caspase-1 활성화가 어떻게 조절되는지와 같은 인플라마솜 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 사용자가 인플라마솜 활성화 및 파이롭토시스 경로의 여러 단계를 검사할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 연구 과학자인 안드레아스 덴 하티(Andreas den Hartigh)입니다. 먼저 유리 커버슬립에 파종된 LPS 프라이밍 골수 유래 대식세포의 배지를 웰당 5마이크로몰 니제리신과 5밀리몰 글리신이 보충된 290마이크로리터의 DMEM 5 배지로 교체합니다. 24웰 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 60분 동안 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣고 처음 15분 후에 30X FAM-YVAD-FMK 10마이크로리터를 추가합니다.

배양이 끝나면 웰 당 1 밀리리터의 차가운 PBS로 세포를 세척하고 세척 당 5 분 동안 3 회 세척하고 빛으로부터 보호 된 얼음에서 30 분 동안 웰 당 2 % 파라 포름 알데히드 250 마이크로 리터로 세포를 고정하고 마지막 5 분 동안 적절한 형광 핵 염료로 세포를 라벨링합니다. 배양이 끝나면 방금 시연한 것처럼 차가운 PBS로 세포를 세 번 세척하고 각 슬라이드에 7마이크로리터의 페이드 방지 장착 매체를 로드합니다. 각 슬라이드에 커버슬립을 놓고 매니큐어로 커버슬립을 밀봉하기 전에 장착 매체가 밤새 굳어지도록 합니다.

형광 컨포칼 현미경으로 세포를 이미지화하려면 처리되지 않은 대조군 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 세포에 수동으로 초점을 맞춥니다. 현미경 룩업 테이블 설정을 사용하여 처리되지 않은 세포에서 양성 프로브 염색이 관찰되지 않을 때까지 오프셋을 조정합니다. 다음으로, 니게리신(nigericin) 처리된 샘플을 사용하여 프로브 염색에 대해 양성 및 음성 세포가 모두 포함된 필드를 찾고 프로브 채널의 이미징 평면을 양성 염색 강도가 가장 높은 평면으로 조정합니다.

그런 다음 집결된 핵이 있는 세포에서 초점이 보일 때까지 게인을 조정하고 100X 총 배율에서 슬라이드당 무작위로 선택된 5개의 필드의 이미지를 얻습니다. 니제리신(nigericin)으로 처리된 세포의 면역불화화학 분석을 위해 방금 시연된 대로 소품 표지된 세포를 세척하고 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 30분 동안 웰당 250마이크로리터의 고정 및 투과화 용액에서 세포를 배양합니다. 새 세척 버퍼로 대식세포를 세 번 더 세척하고 얼음 위에서 1시간 동안 웰당 C-말단 카스파제 모집 도메인(ASC)을 포함하는 안검하수 관련 반점 같은 단백질에 대한 250마이크로리터의 1차 항체로 세포에 라벨을 붙입니다.

배양이 끝나면 세포를 세척하고 얼음에서 1시간 동안 적절한 형광 염료 접합 2차 항체 250마이크로리터로 샘플에 라벨을 붙이고, 마지막 5분 동안 적절한 형광 핵 염색 염료 4마이크로리터를 추가합니다. 차가운 세척 버퍼에서 세포를 세 번 세척한 후, 시연된 바와 같이 7마이크로리터의 페이드 방지 장착 매체로 슬라이드에 커버슬립을 장착하고 형광 컨포칼 현미경으로 대식세포를 이미지화합니다. LDH 방출 분석을 수행하려면 각 실험 웰에 10마이크로몰 니제리신이 보충된 DMEM 5 배지 50마이크로리터를 추가하고, 자연 및 100% 용해 제어 웰에 DMEM 5 50마이크로리터를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에서 60분 동안 추가합니다.

30분 후, 100% 용해 제어 웰에 10마이크로리터의 10X 용해 완충액을 추가하고 다른 웰에 10마이크로리터의 배지를 추가합니다. 배양이 끝나면 플레이트를 원심 분리하고 각 웰에서 바닥이 평평한 투명한 플레이트로 50마이크로리터의 상등액을 이송합니다. 다음으로, 갓 해동하고 준비된 기판 50마이크로리터를 각 웰에 추가하여 어둠 속에서 30분 동안 배양하고 15분 후에 플레이트를 확인하여 신호가 플레이트 리더의 감지 한계를 초과하지 않는지 확인합니다.

배양이 끝나면 각 웰에 50마이크로리터의 정지 용액을 추가하고 적절한 플레이트 리더에서 OD490을 측정하여 웰당 세포 용해 비율을 계산할 수 있습니다. 니게리신에 노출된 유형 대식세포는 활성 카스파제-1을 포함하는 핵주위 영역에서 ASC 초점이 형성됨을 보여주며, 이는 이러한 세포가 파이롭토시스를 겪고 있음을 나타냅니다. Caspase-111이 결핍된 마우스의 대식세포도 ASC 초점을 생성하지만, 이러한 세포에는 FAM-YVAD-FMK 염색이 없는 것으로 알 수 있듯이 이 초점과 관련된 활성 Caspase-1이 없습니다.

또한 이러한 세포의 핵이 응축되어 있지 않은데, 이는 발열성 세포 사멸이 없음을 나타냅니다. 또한, 야생형 대식세포의 상당수는 배양 상등액의 LDH 방출 분석에 의해 측정된 바와 같이 니제리신에 노출된 후 세포 사멸을 겪는 반면, 카스파제-1이 결핍된 대식세포는 LDH를 상등액으로 방출하지 않아 세포가 여전히 손상되지 않았음을 나타냅니다. 이 동영상을 시청한 후에는 형광 현미경 검사로 인플라마솜 형성을 시각화하는 방법과 LDH 방출을 측정하여 세포 용해 수준을 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차는 다른 인플라마솜 자극 또는 인플라마솜 활성화 또는 파이롭토시스를 변경하는 중재의 사용을 위해 수정될 수 있습니다.