Name: Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 학습하세요 형광 현미경과 LDH 방출 분석을 이용하여 쥐 골수 유래 대식세포에서 인플라마좀 활성화 및 파이로프토시스를 검출하는 방법을. 이 기술은 염증 반응 연구에 필수적인 도구입니다.

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모든 현미경 W. M. 켁 현미경 센터 다니엘 피터 스의 지원 및 NIH 포상 S10OD016240의 지원으로 이루어졌다. S.L.F.는 NIH K08AI119142와 R21AI130281에 의해 지원 됩니다. 우리는 박사 리처드 Flavell 및 caspase-1/11 결핍 마우스, 박사 브래드 쿡 박사 브래드 쿡 실험실 시설 및 장비를 공유 하기 위한 감사 합니다.

모든 동물 절차 승인 되었고 워싱턴 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침의 대학에서 실시.
1입니다. 골의 수확
<ol><li>Aseptically는 마우스에서 대 퇴 골과 경골을 제거 하 고 불 임 악기를 사용 하 여 뼈를 청소. Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM) + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-글루타민 + 0.05 m m 2-mercaptoethanol + 50 mg/mL gentamicin 황산 + 10000 U/mL 페니실린/스 + 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS, DMEM-10 완전 한) 청소 뼈를 놓고 알을 품는 15 분 동안 얼음에 튜브.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여 인접 및 원심 볼 관절을 제거 합니다. 중간 뼈의 구 렁에 가득 10 mL 주사기에 부착 된 25g 바늘을 삽입 합니다. DMEM-완전 한 10를 사용 하 여 골 수 밖으로 플러시. 어떤 덩어리를 pipetting 매체를 위아래로 부드럽게 하 여 resuspend.</li>
	<li>셀 300 x g에서 10 분 원심 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산. 이 시점에서, 90 %FBS + 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)를 사용 하 여 셀을 고정 하거나 접시 15cm L929 단련 중간 (단계 2.1)를 사용 하 여 세포 분화를 페 트리 접시에에서 셀.</li>
</ol>2. 골 수 유래 세포의 분화
<ol><li>미리 데워 진된 차별화 매체 (DMEM-10 완전 한의 21 mL 및 L929 세포 조절 매체 스완 손 외 에 설명 된 대로의 9 mL를 사용 하 여 18) 15 cm에서 골 수 세포를 넣어 조직 문화 취급 페 트리 접시 (1.2-1.5 x 107 셀). 7 일 동안 37 ° C, 5% CO2 접시를 품 어. 하루 3 또는 4에 접시를 차별화 매체의 추가적인 30 mL를 추가 합니다. 참고: 그것은 중요 하다를 취급 하는 조직 문화 접시를 사용 하지 대 식 세포를 분리 하 고 수확 하기 어려울 것입니다.</li>
	<li>대 식 세포를 수집 하려면 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 접시를 세척 하 고 차가운 PBS + 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 20 mL를 추가 합니다. 셀 위에 PBS + EDTA를 pipetting으로 셀 10 분 수확에 대 한 4 ° C에서 접시를 품 어 하 고 PBS의 10 mL와 함께 접시를 씻어. 두 개의 15 mL 원뿔 튜브에 두 세척을 결합 한다.</li>
	<li>10 분에 대 한 300 x g에서 세포를 원심 및 페 놀 레드 무료 DMEM + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-글루타민 + 0.05 m m 2-mercaptoethanol, 5%의 10 mL에 셀 resuspend FBS (DMEM-5)는 hemocytometer 또는 Coulter 카운터 중 하나를 사용 하 여 셀을 카운트. 계산 하는 동안 얼음에 셀을 계속.</li>
	<li>2 x 105 셀/mL에 코팅 하는 조직 문화 접시에 있는 대 식 세포 씨앗 현미경 실험, coverslips 24 잘 플레이트에 셀의 1 mL 씨. LDH 방출 분석 실험, 96 잘 접시에 셀의 100 µ L 씨. LDH 분석 결과 대 한 9 웰 스 (3 웰 스 치료, 100% 세포 제어 3 우물과 실험 자극에 대 한 3 웰 스) 씨.</li>
	<li>특정 셀에 게 300 x g에 5 분 동안 원심 분리기는 96 잘 접시는 동등 하 게 잘 분산.</li>
	<li>못쓰게 프로세스를 시작 하기 전에 하룻밤에서 37 ° C + 5% CO2 접시를 품 어.</li>
</ol>3입니다. 애 벌 칠
<ol><li>100 ng/mL LPS 잘 접시 24에 대 한 500 μ (잘 접시는 96에 대 한 50 μ) 포함 된 신선한 매체 (DMEM-5)와 매체를 교체 합니다. 참고: 다양 한 LPS TLR4 중재 못쓰게19를 자극 하는 능력에 영향을 미치는 구조 변화 있다. 살 모 넬 라 미네소타 R595에서 LPS (Re) 여러 공급 업체에서 제공 하 고 것이 좋습니다.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO23 h에 대 한 접시를 품 어.</li>
</ol>4. Nigericin와 NLRP3 Inflammasome 및 팸-YVAD-FMK로의 활성화
<ol><li>매체를 제거 하 고 290 μ DMEM-5 5 μ M nigericin 및 5mm 글리신의 바꿉니다. 글리신은 caspase-1 활성화5하는 동안 발생 하는 세포 세포의 양을 줄이기 위해 추가 됩니다. 37 ° C, 5% CO260 분 동안 품 어. 야생 유형 및 caspase-1 부족 한 대 식 세포를 사용 하 여 관찰된 변하면 caspase-1에 대 한 특정 되도록.</li>
	<li>마지막 45 분 동안 추가 30 10 μ x 팸-YVAD-FMK, 제조업체의 지침에 따라 준비.</li>
	<li>60 분 후에 매체를 제거 하 고 씻어 3 시간 5 분 동안 각 1 mL와 함께 차가운 PBS의 셀.</li>
	<li>각 음을 2 %paraformaldehyde 250 μ를 추가 하 고 30 분 동안 알루미늄 호 일로 덮여 얼음에 품 어.</li>
	<li>마지막 5 분 동안 4 μ의 핵을 0.2 m m 빨강 형광 핵 산 얼룩을 추가 합니다. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 또는 다른 염료 상표 DNA 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>세 번 차가운 PBS의 1 mL로 세포 세척 하 고 7 μ 방지 페이드 설치 매체를 사용 하 여 현미경 슬라이드에 coverslips를 탑재. 장착 매체 매니큐어를 사용 하 여 현미경 슬라이드에 coverslip 밀봉 하기 전에 밤에 강화 하자.</li>
	<li>Confocal 현미경 검사 법에 의해 대 식 세포를 이미지. 예 스 / 팸-YVAD-FMK에 대 한 Em 492/520nm 642/661 빨강 형광 핵 산 얼룩에 대 한. 현미경 치료 셀 488 채널에 얼룩 어떤 배경 표시 안 되도록 설정 되었는지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 배경 식구 들-YVAD-FMK 얼룩 감지 하 고 실제 활성 caspase-1 될 것입니다. 참고: 현미경 설정 섹션 6에서에서 설명 되어 있습니다.</li>
</ol>5. 항 체 얼룩이 지기
참고: ASC를 검출 하기 위하여 항 체와 함께 셀 라벨, 씨앗, 프라임 고 노출 셀 nigericin 이전 섹션에 동일 하. 처리 후는 다음과 같습니다:
<ol><li>3 시간 5 분 동안 각 1 mL와 함께 차가운 PBS의 세포를 씻어. 고정 및 permeabilization 솔루션의 250 μ를 추가 합니다. 얼음에 셀을 품 어 그리고 30 분 동안.</li>
	<li>3 시간 5 분 동안 각 1 mL와 워시 버퍼의 대 식 세포를 씻어.</li>
	<li>ASC에 대 한 1 차적인 항 체의 250 μ 희석 1: 500 워시 버퍼에 추가 하 고 얼음에 1 시간에 품 어. 포함 한 coverslip 어떤 1 차 항 체에 영향을 받지 않는 하지만 보조를 받을 것 이다. 이 coverslip 올바른 오프셋을 설정 하는 현미경 설치 하는 동안 사용 됩니다.</li>
	<li>셀 5 분 각 1 mL 워시 버퍼에 대 한 세 번 씻는 다.</li>
	<li>이차 항 체 (형광 색소 활용 된 염소-안티-마우스)의 250 μ 워시 버퍼에서 1: 500을 희석 하 고 얼음에 1 시간에 대 한 품 어를 추가 합니다. 레이블 핵에 0.2 m m 빨강 형광 핵 산 얼룩이이 외피의 마지막 5 분의 4 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>3 세포를 씻어 감기 워시 버퍼 및 현미경에 coverslips 7 μ 방지 페이드 설치 매체를 사용 하 여 슬라이드 마운트의 1 mL x. 장착 매체 투명 매니큐어를 사용 하 여 현미경 슬라이드에 coverslip 밀봉 하기 전에 밤에 강화 하자.</li>
	<li>Confocal 현미경 검사 법에 의해 이미지 세포입니다. 전 이차 항 체에 대 한 Em은 555/580 / nm와 642/661 빨강 형광 핵 산에 대 한 얼룩 (아래와 같이). 참고: FAM-YVAD-FMK와 항 체 라벨로 표시 활성 caspase-1 및 ASC 공동 현지화를 결합 수 있습니다. 이 위해 식구 들-YVAD-FMK 라벨에 대 한 조건에 따라 하 고 추가 처리를 위해 프로토콜 라벨 항 체로 전환.</li>
</ol>6. Confocal 현미경 검사 법에 의해 레이블이 세포 이미징
참고: 후에 coverslips 하룻밤 치료와 매니큐어와 현미경 슬라이드에 밀폐 되어 허용 된 스테인드 세포를 볼 수 있습니다. 여기, 이미징 confocal 현미경을 사용 하 여 설명 합니다. 세포는 또한 표준 형광 현미경으로 볼 수 있습니다.
<ol><li>현미경 단계에 치료 제어 셀과 슬라이드를 놓고 셀에 현미경을 집중 합니다.</li>
	<li>치료 되지 않는 셀에 긍정적인 팸-YVAD-FMK 얼룩이 지는 그런 현미경 볼을 테이블 (LUT) 설정을 사용 하 여, 오프셋을 조정 합니다. 이 과정 또한 caspase-1 부족 한 세포를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 참고: 오프셋, 실험에 사용 되는 각 채널에 대 한 조정 해야 하지만 올바른 오프셋을 설정 하는 것이 식구 들-YVAD-FMK 채널 및 형광 항 체 채널에 대 한 가장 중요 한. DNA 채널에 대 한 오프셋은 덜 중요 합니다. 오프셋을 설정 실험의 나머지 부분에 대 한이 설정을 조정 하지 않습니다.</li>
	<li>취급 하는 nigericin 샘플 슬라이드를 전환 합니다. 긍정적이 고 식구 들-YVAD-FMK 얼룩에 대 한 부정적인 두 셀을 포함 하는 필드를 찾아. 긍정적인 얼룩이 지기의 가장 높은 강도 가진 비행기로 팸-YVAD-FMK 채널의 영상 평면을 조정 합니다. 이것은 일반적으로 비행기 inflammasome 초점의 센터 몇 군데 됩니다.</li>
	<li>그런 foci 응축된 핵이 있는 셀에 표시 되는 이득을 조정 합니다. 이득 및 오프셋을 설정한 후 이미징 세션의 나머지 부분에 대 한 이러한 설정을 둡니다. 참고: 셀 pyroptotic 인지 확인 하는 쉬운 편도 핵 형태를 보고는. 활성 caspase-1 셀 둥근 이며 응축된 핵, nucleoli caspase-1 활성화 및 핵 형태학 없이 세포에서 볼 수 있습니다 하는 동안 치료 세포의 것과 유사 합니다.</li>
	<li>총 배율 X 100에 5 무작위로 선택 된 필드의 이미지를 수집 합니다. 이 이미지 당 약 40 셀 일반적으로 발생 합니다. 각 샘플에 대 한이 프로세스를 반복 합니다.</li>
	<li>이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 각 이미지에는 셀의 수를 계산 합니다. 다음 긍정적인 팸-YVAD-FMK 얼룩이 있는 셀의 개수를 계산 합니다. 팸-YVAD-FMK 긍정적인 세포의 백분율로 caspase-1 활성화의 수준을 나타냅니다.</li>
</ol>7. LDH 자료 분석 결과
참고: LDH 자료 분석 결과 대 한 씨앗과 프라임 셀 이전 섹션에 설명 된 대로 제외 하 고 사용 하 여 96 잘 접시. 못쓰게 후 매체를 제거 하지 마십시오.
<ol><li>DMEM-5 실험 웰 스에 10 μ M nigericin 및 50 μ의 50 μ 추가 자연과 100% 세포 제어 웰 스 DMEM-5. 때문에 목표 셀 세포를 측정 하는이 실험에서 글리신을 추가 하지 마십시오. 37 ° C, 5% CO260 분 동안 품 어.</li>
	<li>30 분 후 100% 세포 제어 웰 스에 10 x 세포의 용 해 버퍼의 10 μ를 추가 하 고 다른 우물에 DMEM 5 10 μ를 추가 합니다. 이 부 화 하는 동안 냉장고에서 기판 믹스 (동결된 기판의 1.5 mL)의 1 유리병과 분석 결과 버퍼 (~ 12 mL) 1 약 수를 제거 하 고 실내 온도에 빛에서 보호 해 동 그들. 참고: 기판 믹스 빨간색 formazan 제품으로 변환 되는 tetrazolium 소금 (iodonitro tetrazolium 바이올렛), 포함 합니다.</li>
	<li>60 분 총 부 화 후 10 ° c.에 x 500g에 5 분 동안 접시를 원심 분명 평면 하단 플레이트에는 상쾌한의 50 μ를 전송 합니다. 이 시간 동안 기판 믹스의 유리병에 분석 결과 버퍼의 12 mL을 추가 하 고 사용 하기 전에 5 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>50 μ 기판의 각 음을 추가 하 고 어둠 속에서 30 분 동안 품 어. 중간만 웰 스 빈 값을 포함 합니다. 신호 플레이트 리더의 검출 한계를 초과 하지 것입니다 되도록 15 분 후 접시를 확인 합니다.</li>
	<li>30 분 후 정지 솔루션 (1 M 초 산)의 50 μ를 추가 하 고 OD490 플레이트 리더를 사용 하 여 측정 합니다.</li>
	<li>다음 수식을 사용 하 여 세포 세포의 용 해의 비율을 계산: %Cytoxicity = ((Experimental-Spontaneous) / (최대-자발적인)) × 100 실험: 취급 하는 nigericin 세포; 자연: 치료 세포; 최대: 세포 세포의 용 해 버퍼에 노출</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 충돌의 관심을가지고

이 원고에서 우리 inflammasome 활성화 및 caspase-1 활성화 murine 골 수 유래 세포에서 NLRP3 자극을 다음의 결과 검사 하는 두 가지 방법을 제시 했습니다. 첫 번째 기술은 형광 기자 팸-YVAD-FMK를 사용 하 여 셀룰러 기준 caspase-1 활성화의 수준을 결정 하는 연구원을 수 있습니다. 이 기자는 caspase-1/11 결핍 세포에 얼룩의 부재에 의해 본 바인딩 효소, caspase-1 가족에 대 한 매우 구체적인. 특이성은 또한 LaRock 외에의해 표시 됩니다. 그들의 원고에서 caspase-1 활성화에 페스트 단백질 YopM의 역할을 설명 하. 그들의 원고에서 그들은 FAM-YVAD-FMK foci caspase-117에 대하여 지시 하는 항 체와 함께 표시 했다 foci와 겹치는 보여줍니다.
어떤 실험으로 거짓 긍정적인 결과 제거 하기 위해 따라야 하는 몇 가지...

Inflammasome 중재 염증 병원 성 유기 체1에 대 한 방어의 중요 한 구성 요소 이지만, 또한 많은 질병2의 병 인 기초. 다양 한 감염에 염증 반응을 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs)의 cytosolic 탐지에 의해 트리거되는 또는 손상 관련 된 분자 패턴 (DAMPs). 패턴 인식 수용 체 (PRR), 끄 덕 임 같이 수용 체 (NLR) 가족의 일원을 포함 하 여 이러한 감지 시 oligomerize PAMPs 및 DAMPs. 이 다중 단백질 복잡 한 inflammasome, PRR, Apoptosis 관련 스펙 같은 단백질 C 터미널 caspase 신규 모집 도메인 (카드) (ASC), 그리고 프로 형태의 포함 된 어댑터 단백질을 포함 하 되 나의 형성을 유발 caspase-13,4. 이 복잡 한 근접 유도 caspase-1의 자동 활성화 수 있습니다. 활성 caspase-1 다음 이벤트 염증 성 세포 죽음 통로 pyroptosis의 특성 집합을 리드. 이 이벤트에 포함 됩니다: 분열 그리고 염증 성 cytokines 일리노이-1β 및 세포 외 공간, 핵 응축 및 gasdermin D 분열에 lysosomal 내용의 출시와 함께 리소좀 exocytosis IL 18의 릴리스. Gasdermin D의 출시 된 N 맨끝 도메인 원형질 막 파열 및 병원 체 복제5, 에 대 한 보호 틈새를 데 려 하는 것 외에도 염증 성 내용의 자료를 일으키는 원인이 되는 숨 구멍을 형성 하는 원형질 막에 삽입 6 , 7.
여기, 우리는 잘 공부 NLRP3 inflammasome에 집중 한다. NLRP3 inflammasome의 활성화 2 단계 과정8통해 발생합니다. "프라이 밍"의 첫 번째 단계는 미생물 제품의 통행세 같이 수용 체 (TLR)에 의해 인식 통해 발생합니다. 이 LPS TLR4 자극을 사용 하 여 실험실에서 복제 됩니다. 이 자극 upregulates NLRP3 및 프로-일리노이-1β NF kB 신호를 통해 합니다. 또한 못쓰게 비 transcriptional 메커니즘을 통해 유도 deubiquitination9,10 및 인 산화 또는 특정 잔류물11,12dephosphorylation NLRP3 라이센스.
NLRP3 정품 인증에 대 한 두 번째 신호는 미토 콘 드 리아 요인, 반응성 산소 종, 칼륨 경과 및 신호, 칼슘을 포함 하는 NLRP3 활성화를 위한 통합 메커니즘 애매8남아 있지만 생각 된다. 활성화 된 NLRP3의 시 1 도메인 간의 상호 작용을 통해 oligomerizes 그리고 pyrin (PYD) 도메인13의 바인딩을 통해 ASC 신병. 각 셀에 이러한 고분자 단지 단일 현미경으로 보이는 초점을 형성 한다. ASC 22 KDa 단백질 인간의 백혈병 세포의 apoptosis 동안 "반점"를 형성 하 고 명명 된 apoptosis 관련 스펙 같은 단백질 포함 된 카드14원래 확인 되었다. 그것은 나중에 ASC 프로-caspase-1 inflammasome15형성 프로-caspase-1의 카드와 함께 ASC의 카드의 상호 작용을 통해 신병 결정 되었다.
모든 NLRs는 caspase-1 활성화를 유도 하는 ASC의 존재를 필요로. 달리 NLRP3, NLRC4 및 NLRP1b 카드 도메인 있고 프로-caspase-1 카드-카드 상호 작용 caspase-1 활성화 유도를 통해 모집 직접 수 있습니다. ASC의 부재, 활성 caspase-1는 cytosol에 걸쳐 확산 유적과 단일 초점을 형성 하지 않습니다. 확산이 활성 caspase-1 pyroptotic 세포 죽음을 유도 하기에 충분 하지만 프로 일 1β13,16처리할 수 있습니다.
이 원고에서 우리 inflammasome 활성화를 평가 하기 위해 두 가지 방법을 설명 합니다. 첫 번째 사용 하 여 형광 활동 프로브, FAM-YVAD-FMK, 프로 테아 제 caspase-1 제품군을 바인딩합니다. 이 가족 caspase-1, 또한 마우스 caspase-11와 인간의 caspase-4 caspase-5 포함 되어 있습니다. 모든 실험에 caspase-1/11 결핍 쥐에서 세포를 사용 하 여이 프로브의 특이성을 해결 것입니다. 이 방법은 항 체 또한 설명 합니다 inflammasome 부품의 라벨 결합 될 수 있다. 현미경 시각화는 개별 셀을 포함 하는 활성 caspase-1와 oligomerized ASC의 식별에 대 한 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여, 연구원은 어디 inflammasome 형성 캐스케이드 호스트 셀 또는 연구에서 병원 성 유기 체 그들의 조작 효과가지고 결정할 수 됩니다. 예를 들어 하나의 주어진된 개입 복잡 한 NLRP3를 ASC의 채용을 방지 또는 후속 모집과 caspase-117의 활성화 여부를 구분할 수 있습니다. Caspase-1 활성화 IL 1β 분 비 등의 결과 검토 것 수 없습니다 이러한 두 가능성 사이 구별 하. 또한, IL 1β의 분 비는 caspase-1을 활성화 하 고 pyroptotic 세포 죽음16받을 수 셀을 변경 하지 않고 변경 될 수 있습니다.
두 번째 방법은 위에서 설명한 caspase-1 활성화 다음 pyroptotic 대 식 세포 세포의 용 해 도중 발생 하는 표면에 뜨는, 셀으로 젖 산 효소 (LDH)의 출시를 측정 합니다. 이 두 번째 방법은 전체에서 LDH의 릴리스 잘 측정은 인구에 기초를 둔 접근 이다.입니다. 이 간단한 접근 caspase 1 중재 하는 세포 죽음 인지 확인 하려면 샘플의 빠른 분석 (보육 시간 30 분)에 대 한 허용 하 고 96 잘 접시 형태로 수행할 수 있습니다.
이러한 메서드는 상호 보완적인, 각각 다른 장점, 그리고 둘 다 쉽게 수정 의무가 있습니다. 예를 들어 inflammasome 자극 이전 대상된 작은 분자량 화합물과 대 식 세포 치료 단백질에 선 동적인 응답을 제어 할 수 있습니다 특정 역할을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>E-MEM</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>L929 세포 성장용</td></tr><tr><td>NCRC 클론 929 (L929)</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>고정/투과화 키트</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>고정 및 투과화 용액 및 세척 완충액을 포함합니다. 독점 제형. 4.2% 포름알데히드</td></tr><tr><td>글리신</td><td>Biorad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>Cytotox96 비방사성 세포 독성 분석</td><td>포함 Fisher Scientific</td><td>PR-G1780</td><td>기질 혼합 및 분석 완충액 포함; 독점 제형. 정지 용액은 1M 아세트산</td></tr><tr><td>FAM-YVAD-FMK</td><td>Immunocytochemistry Technologies</td><td>98</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, 글루타민 없음</td><td>인비트로겐</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고당당, 글루타민 없음, 페놀 레드</td><td>없음 인비트로겐</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 PBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>인비트로겐</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 자격을 갖춘 미국 원산지</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>Heat는 55°C에서 비활성화되었습니다. C 50분</td></tr><tr><td>동안 Gentamicin</td><td>Invitrogen</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Mounting Medium</td><td>Invitrogen</td><td>p36934</td><td>독점 제형. 경화 장착 매체. 1.46</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 ALEXA555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21422</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Ultra Pure)</td><td>Invitrogen</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>21051024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Invitrogen Invitrogen</td><td>T3605</td><td>far-red fluorescent의 내화율로 경화 핵산 염색</td></tr><tr><td>C57BL/6J 마우스</td><td>Jackson Laboratoy</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>caspase-1/11-/- 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>016621</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8X 컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re)</td><td>List Biologicals</td><td>434</td><td></td></tr><tr><td>anti-ASC clone 2EI-7</td><td>Millipore-Sigma</td><td>04-417</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercapto-ethanol</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D2650-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E5391</td><td></td></tr><tr><td>Spectramax M3 플레이트 리더</td><td>분자 장치</td><td>5000414</td><td></td></tr></tbody></table>

inflammasome 활성화 및 pyroptotic 세포 죽음 murine 골 수 유래 세포에서의 검출

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes는 많은 병원 성 생물의 성공적인 제어에 필요한 하지만 또한 염증 촉진 하는 타고 난 면역 신호 플랫폼 autoinflammatory 질병. Inflammasomes 끄 덕 같은 수용 체 (NLR) 가족의 일원을 포함 하 여 cytosolic 패턴 인식 수용 체에 의해 활성화 됩니다. 이 수용 체는 미생물 또는 손상 관련 된 자극의 감지 시 oligomerize. 접합 기 단백질 ASC의 후속 모집 caspase-1 근접 유도 자동 활성화를 통해 활성화 현미경으로 보이는 inflammasome 복잡 한, 형성 한다. 활성화, 따라 caspase-1 프로-일리노이-1β 및 프로-일-18, 활성화 및 이러한 프로 염증 성 cytokines의 분 비를 앞. Caspase-1는 또한 염증 성 형태의 세포 죽음 pyroptosis, 기능 막 무결성 및 셀 세포의 손실이 되 나 중재. Caspase-1 gasdermin D, 원형질 막 숨 구멍을 형성 하는 N 맨끝 파편 공개 삼투성 세포로 이어지는 앞.
골 수 유래 세포 caspase-1 활동 프로브 팸-YVAD-FMK의 라벨 및 어댑터 단백질 ASC에 대 한 항 체와 함께 셀 라벨 시험관, caspase-1의 활성화를 확인할 수 있습니다. 이 기술은 inflammasome 형성 및 caspase-1 활성화 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 개별 셀에 식별 수 있습니다. Pyroptotic 세포 죽음은 매체에 cytosolic 젖 산 효소의 릴리스를 측정 하 여 검색할 수 있습니다. 이 절차는 간단 하 고 비용 효과적인 심사에 대 한 적응을 허용 96 잘 접시 형태로 수행 합니다. 이 원고에서 우리 표시 nigericin, NLRP3 inflammasome의 활성화 어댑터 단백질 ASC 및 활성 caspase-1, 공동 현지화를 리드 pyroptosis로 이어지는.

검출 하기 caspase-1 활성화 nigericin에 노출 다음, 세포 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 처리 했다. 우리 식구 들-YVAD-FMK와 ASC 항 체는 ASC 및 활성 caspase-1 공동 지역화 NLRP3이 중재 inflammasome 활성화 다음 보여 라벨 결합. 그림 1A 5 μ M nigericin에 노출 하는 야생 타입 세포 perinuclear 지역에서 ASC 초점의 형성을가지고 있음을 보여준다. 이 포커스 식구 들-YVAD-FMK와 ASC의 공동 지역화 보는 활성 caspase-1 포함. 활성 caspase-1 긍정적인 세포 핵 응축 보여주는 이러한 셀 pyroptosis 겪고 있다. 그림 1B 는 caspase-1/11 결핍 쥐의 세포는 ASC 초점의 형성을가, 그들은 필요가 없습니다 어떤 활성 caspase-연결 된 1이이 포커스 식구...

형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 및 활성 caspase-1와 어댑터, ASC에 대 한 얼룩 세포질 기준 NLRP3 inflammasome 활성화의 탐지를 설명 합니다. 젖 산 효소 자료 분석 결과 인구 기준 pyroptotic 세포를 감지 하 여. 이 기술은 inflammasome 생물학의 여러 측면을 연구 적응 될 수 있다.

Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 형광 현미경을 통해 단일 세포 수준에서 인플라마솜 활성화를 검사하고 젖산 탈수소효소 또는 LDH 방출 분석법에 의한 파이롭토시스 중 용해를 측정하는 것입니다. 이 방법은 Caspase-1 활성화가 어떻게 조절되는지와 같은 인플라마솜 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 사용자가 인플라마솜 활성화 및 파이롭토시스 경로의 여러 단계를 검사할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 연구 과학자인 안드레아스 덴 하티(Andreas den Hartigh)입니다. 먼저 유리 커버슬립에 파종된 LPS 프라이밍 골수 유래 대식세포의 배지를 웰당 5마이크로몰 니제리신과 5밀리몰 글리신이 보충된 290마이크로리터의 DMEM 5 배지로 교체합니다. 24웰 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 60분 동안 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣고 처음 15분 후에 30X FAM-YVAD-FMK 10마이크로리터를 추가합니다.배양이 끝나면 웰 당 1 밀리리터의 차가운 PBS로 세포를 세척하고 세척 당 5 분 동안 3 회 세척하고 빛으로부터 보호 된 얼음에서 30 분 동안 웰 당 2 % 파라 포름 알데히드 250 마이크로 리터로 세포를 고정하고 마지막 5 분 동안 적절한 형광 핵 염료로 세포를 라벨링합니다. 배양이 끝나면 방금 시연한 것처럼 차가운 PBS로 세포를 세 번 세척하고 각 슬라이드에 7마이크로리터의 페이드 방지 장착 매체를 로드합니다. 각 슬라이드에 커버슬립을 놓고 매니큐어로 커버슬립을 밀봉하기 전에 장착 매체가 밤새 굳어지도록 합니다.형광 컨포칼 현미경으로 세포를 이미지화하려면 처리되지 않은 대조군 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 세포에 수동으로 초점을 맞춥니다. 현미경 룩업 테이블 설정을 사용하여 처리되지 않은 세포에서 양성 프로브 염색이 관찰되지 않을 때까지 오프셋을 조정합니다. 다음으로, 니게리신(nigericin) 처리된 샘플을 사용하여 프로브 염색에 대해 양성 및 음성 세포가 모두 포함된 필드를 찾고 프로브 채널의 이미징 평면을 양성 염색 강도가 가장 높은 평면으로 조정합니다.그런 다음 집결된 핵이 있는 세포에서 초점이 보일 때까지 게인을 조정하고 100X 총 배율에서 슬라이드당 무작위로 선택된 5개의 필드의 이미지를 얻습니다. 니제리신(nigericin)으로 처리된 세포의 면역불화화학 분석을 위해 방금 시연된 대로 소품 표지된 세포를 세척하고 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 30분 동안 웰당 250마이크로리터의 고정 및 투과화 용액에서 세포를 배양합니다. 새 세척 버퍼로 대식세포를 세 번 더 세척하고 얼음 위에서 1시간 동안 웰당 C-말단 카스파제 모집 도메인(ASC)을 포함하는 안검하수 관련 반점 같은 단백질에 대한 250마이크로리터의 1차 항체로 세포에 라벨을 붙입니다.배양이 끝나면 세포를 세척하고 얼음에서 1시간 동안 적절한 형광 염료 접합 2차 항체 250마이크로리터로 샘플에 라벨을 붙이고, 마지막 5분 동안 적절한 형광 핵 염색 염료 4마이크로리터를 추가합니다. 차가운 세척 버퍼에서 세포를 세 번 세척한 후, 시연된 바와 같이 7마이크로리터의 페이드 방지 장착 매체로 슬라이드에 커버슬립을 장착하고 형광 컨포칼 현미경으로 대식세포를 이미지화합니다. LDH 방출 분석을 수행하려면 각 실험 웰에 10마이크로몰 니제리신이 보충된 DMEM 5 배지 50마이크로리터를 추가하고, 자연 및 100% 용해 제어 웰에 DMEM 5 50마이크로리터를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에서 60분 동안 추가합니다.30분 후, 100% 용해 제어 웰에 10마이크로리터의 10X 용해 완충액을 추가하고 다른 웰에 10마이크로리터의 배지를 추가합니다. 배양이 끝나면 플레이트를 원심 분리하고 각 웰에서 바닥이 평평한 투명한 플레이트로 50마이크로리터의 상등액을 이송합니다. 다음으로, 갓 해동하고 준비된 기판 50마이크로리터를 각 웰에 추가하여 어둠 속에서 30분 동안 배양하고 15분 후에 플레이트를 확인하여 신호가 플레이트 리더의 감지 한계를 초과하지 않는지 확인합니다.배양이 끝나면 각 웰에 50마이크로리터의 정지 용액을 추가하고 적절한 플레이트 리더에서 OD490을 측정하여 웰당 세포 용해 비율을 계산할 수 있습니다. 니게리신에 노출된 유형 대식세포는 활성 카스파제-1을 포함하는 핵주위 영역에서 ASC 초점이 형성됨을 보여주며, 이는 이러한 세포가 파이롭토시스를 겪고 있음을 나타냅니다. Caspase-111이 결핍된 마우스의 대식세포도 ASC 초점을 생성하지만, 이러한 세포에는 FAM-YVAD-FMK 염색이 없는 것으로 알 수 있듯이 이 초점과 관련된 활성 Caspase-1이 없습니다.또한 이러한 세포의 핵이 응축되어 있지 않은데, 이는 발열성 세포 사멸이 없음을 나타냅니다. 또한, 야생형 대식세포의 상당수는 배양 상등액의 LDH 방출 분석에 의해 측정된 바와 같이 니제리신에 노출된 후 세포 사멸을 겪는 반면, 카스파제-1이 결핍된 대식세포는 LDH를 상등액으로 방출하지 않아 세포가 여전히 손상되지 않았음을 나타냅니다. 이 동영상을 시청한 후에는 형광 현미경 검사로 인플라마솜 형성을 시각화하는 방법과 LDH 방출을 측정하여 세포 용해 수준을 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 절차는 다른 인플라마솜 자극 또는 인플라마솜 활성화 또는 파이롭토시스를 변경하는 중재의 사용을 위해 수정될 수 있습니다.

detection-inflammasome-activation-pyroptotic-cell-death-murine-bone

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 형광 리포터 프로브를 사용하여 대식세포에서 NLRP3 인플라마솜 활성화를 감지하는 방법을 보여줍니다. 세포는 인플라마솜 조립 및 카스파제-1 활성화를 유도하기 위해 칼륨 이오노포어와 글리신으로 처리됩니다. 형광 리포터 프로브는 활성화된 카스파제-1을 시각화하고 세포는 핵 시각화를 위해 형광 염료로 염색됩니다.

Fluorescence Microscopy를 통한 Inflammasome 활성화 검출

이 동영상은 면역형광을 통해 일차 대식세포에서 NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) 인플라마솜 형성을 연구하는 기술을 보여줍니다. 대식세포는 먼저 NLRP3 단백질 발현을 상향 조절하기 위해 박테리아 지질다당류(LPS)로 프라이밍됩니다. 대식세포를 칼륨 이오노포단인 니게리신(nigericin)에 노출시키면 NLRP3가 활성화되고 인플라마좀(inflammasome)이 형성되며, 이는 면역형광을 통해 시각화됩니다.

대식세포에서 인플라마솜 복합체 형성을 연구하기 위한 시험관 내 기술

이 동영상은 인플라마좀에 의한 대식세포 사멸을 검출하기 위한 젖산 탈수소효소 분석을 보여줍니다. 대식세포는 프라이밍을 위해 지질다당류에 노출된 후 니제리신에 노출되어 인플라마좀에 의한 세포 사멸을 유발하며, 이는 젖산 탈수소효소 분석에 의해 결정됩니다.

Nigericin 노출 후 대식 세포 사멸을 감지하기 위한 Lactate Dehydrogenase 방출 분석

이 비디오는 인플루엔자 바이러스를 자극하여 골수 유래 대식세포에서 여러 카스파아제 활성화를 평가하는 방법을 보여줍니다. 대식세포 용해, 용해물의 열 불활성화 및 원심분리 후 후속 면역학적 분석을 위해 세포 내 카스파제를 수집합니다.

대식세포에서 다중 카스파제의 활성화에 대한 평가

골수 유래 대 식세포를 사용하여 대식 세포 분극 조사

수지상 세포 (DC가) nigericin와 NLRP3의 inflammasome을 활성화 한 다음 합성 퓨린, R848의 TLR8 인식에 응답하여 IL-1β 분비, 따라서 IL-1β는 NLRP3의 inflammasome을 활동을 측정하는데 사용될 수있다. 세포 내 사이토 카인 염색법, 면역 블롯 및 ELISA 정확하게 IL-1β의 발현을 통해 NLRP3의 프라이밍 inflammasome을 및 활성화를 측정하는 데 사용됩니다.

활성화 및 인간 단핵구 유래 수지상 세포에서 IL-1β를 사용하여 NLRP3 inflammasome을 활동의 측정

이 프로토콜은 높은 세포 활력과 분화 및 편광에 대한 완전한 식세포 용량을 유지하면서 높은 형질 전환 효율로 전기 천공에 의해 또는 siRNA의 플라스미드 DNA와 함께 인간 대 식세포 THP-1을 형질 효율적이고 신뢰할 수있는 방법을 제시한다.

Nucleofection에 의해 인간의 THP-1 대 식세포의 고효율 형질

이 프로토콜은 연구원에게 생체 재료 임플란트 미세 환경을 모델링하는 다양한 중합체 표면 및 흡착 단백질 층에 대응하여 뮤린 대식세포 세포주에서 TLR 의존적 NF-θB/AP-1 전사 인자 활성을 측정하는 신속하고 간접적인 방법을 제공합니다.

고분자 표면에 흡착 된 단백질 층에 유료 수용체 매개 NF-kB / AP-1 신호를 검사하는 대식 세포 분석

이 프로토콜은 인간 혈액 샘플로부터 단핵구 유래 대식세포 (MDM)를 얻는 워크 플로우, 세포 생존력과 행동을 손상시키지 않고 염증성 카스파제 BiFC (BiFC) 리포터를 인간 MDM에 효율적으로 도입하는 간단한 방법, 살아있는 세포에서 염증성 카스파제 활성화를 측정하기위한 이미징 기반 접근법을 설명합니다.

인간 단핵구 유래 대식세포에서 근접성을 유도한 염증성 카스파제의 시각화

이 프로토콜은 시험관 내 및 생체 내 (마우스내) 감염, 무균 손상 및 암 모델 모두에 대한 반응으로 카스파제 활성화(카스파제-1, 카스파제-3, 카스파제-7, 카스파제-8, 카스파제-9 및 카스파제-11)를 평가하여 파이롭토시스, 세포자멸사, 괴사 및 PANoptosis와 같은 세포 사멸 경로의 개시를 결정합니다.

선천면역세포사멸을 평가하기 위한 카스파아제 활성화 평가

이 프로토콜은 PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS 및 ATP 유도 사멸을 기반으로 합니다. 당사는 유세포 분석을 사용하여 Annexin V 및 7-AAD 이중 염색을 분석하여 세포 사멸을 검출하며, 전체 세포를 사용하고 주사 전자 현미경을 사용하여 세포막 형태를 관찰합니다.

PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS 및 ATP 유도 사멸 및 그 검증

학습하세요 형광 현미경과 LDH 방출 분석을 이용하여 쥐 골수 유래 대식세포에서 인플라마좀 활성화 및 파이로프토시스를 검출하는 방법을. 이 기술은 염증 반응 연구에 필수적인 도구입니다.

Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

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