Preparazioni e protocolli per l'intera cella Patch Clamp registrazione dei neuroni Tectal Xenopus laevis

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere registrazioni elettrofisiologiche di intere cellule dai neuroni del tettario ottico del girino al fine di conoscere il loro modello di connettività durante lo sviluppo e, in ultima analisi, di capire come si formano e funzionano i circuiti neurali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo neurale, come ad esempio come cambiano i neuroni nel corso dello sviluppo e come funzionano i circuiti per dare origine al comportamento. Il vantaggio principale di questi preparati è che consentono la registrazione elettrofisiologica dei neuroni del tectum ottico per fornire informazioni sulla funzione dei circuiti neurali in via di sviluppo.

A dimostrare la procedura sarà Zhenyu Lui, uno studente laureato nel mio laboratorio. Utilizzando una pipetta di trasferimento per lo smaltimento, spostare il girino anestetizzato in una capsula di registrazione della dissezione contenente una soluzione di registrazione esterna. Fissare il girino anestetizzato a un blocco di silicone sommerso sul pavimento del piatto di registrazione da dissezione.

Per una visione chiara del cervello, rimuovere la pelle sovrastante il cervello praticando un'incisione superficiale lungo la linea mediana utilizzando un ago sterile calibro 25. Filettare il cervello lungo lo stesso asse della linea mediana inserendo l'ago nel tubo neurale e tirando delicatamente verso l'alto in modo tale che la parte dorsale del tubo venga tagliata in modo netto lasciando intatta la placca del pavimento. Per isolare il cervello, utilizzare prima un ago calibro 25 per recidere il rombencefalo.

Quindi far scorrere delicatamente l'ago sotto il cervello in direzione da caudale a rostrale per recidere tutto il tessuto connettivo laterale e ventrale e le fibre nervose. Successivamente, fissare il cervello a un blocco di elastomero siliconico posizionando uno spillo attraverso uno dei bulbi olfattivi e un altro perno attraverso il rombencefalo. Questa è la configurazione ottimale per la registrazione dai neuroni tectali.

Quindi spostare la capsula contenente la preparazione dell'intero cervello appuntata dal cannocchiale di dissezione al rig di elettrofisiologia. Rimuovere la membrana ventricolare utilizzando una pipetta di vetro rotta. Per attivare direttamente gli assoni RGC, abbassare delicatamente un elettrodo stimolante bipolare sul chiasma ottico in modo tale che si formi una piccola ammaccatura nel tessuto.

L'elettrodo stimolante bipolare deve essere rostrale e quasi adiacente al grande ventricolo medio dove si trova il chiasma ottico. L'elettrodo bipolare è azionato da uno stimolatore a impulsi che consente di controllare con precisione la forza della stimolazione. Per preparare la fetta orizzontale del cervello, inizia con la preparazione dell'intero cervello.

Quindi utilizzare una lama di rasoio per asportare il quarto più laterale di un lato di un tectum ottico. Questo taglio viene eseguito parallelamente al piano caudale rostrale. Successivamente, fissare nuovamente il cervello al lato dell'elastomero siliconico con il lato tagliato rivolto verso l'alto in modo che il somata e il neuropilo possano essere accessibili direttamente per la registrazione e la superficie ventricolare del cervello rivolta lontano dal blocco dell'elastomero siliconico in modo che un elettrodo bipolare possa essere posizionato sul chiasma ottico.

Quindi eseguire il patch clamp dell'intera cella o la registrazione del potenziale di campo locale. Ecco lo schema che mostra la configurazione di una preparazione orizzontale della fetta di cervello. Si noti che, sebbene l'elettrodo stimolante rimanga sul chiasma ottico, la pipetta di registrazione è ora posizionata per accedere alle cellule in tutti gli strati tectali esposti dalla preparazione della fetta cerebrale orizzontale.

Questa è una risposta evocata da RGC da un neurone che risiede nello strato superficiale del tectum. In questa figura, i potenziali di campo registrati attraverso il neuropilo e le densità di sorgente di corrente convertite sono mostrati da un grafico a immagini. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro 10 minuti e in genere dura fino a tre o quattro ore.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la preparazione dell'intero cervello e della fetta orizzontale del cervello per le registrazioni di intere cellule al fine di quantificare le proprietà elettriche dei neuroni tectali e la loro connettività.