Name: 마우스 조직에서 효소 특이성 결정 TOF MALDI 질량 분석에 의해 추출: PH 특이성 변경를 조작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 배우세요 마우스 조직 추출물에서 MALDI-TOF 질량 분석을 이용한 프로테아제 특이성 결정 방법을. 이 고효율 프로토콜은 다중 샘플 분석을 가능하게 하여 단백질 분해 효소 활성 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 작품은 일본 제약 대학 (2016)과 문 부 과학성 KAKENHI 보조금 번호 JP17854179에서 일본 제약 대학 연구 보조금에 의해 부분에서 지원 되었다.

동물 실험 프로토콜 일본 제약 대학 윤리 위원회에 의해 승인 되었고 관심과 일본 제약 대학의 실험 동물의 사용에 대 한 지침에 따라 수행. 프로토콜 조직 추출 물의 ICR 생쥐에서 파생 된에 대 한 조정 되었습니다. ICR 생쥐 일본 SLC 회사 (일본 시즈오카)에서 구입 했다
1. Iminobiotin 표시 된 기판의 준비
기판 겪 습 9-fluorenylmethyloxycarbonyl 그룹 (Fmoc)를 사용 하 여 고체 상 합성-11아래 설명 된 대로 아미노산을 보호. 표 2 를 사용 하 여 원하는 아미노산 및 합성의 단계에 따라 사용 Fmoc 화합물 결정.
<ol><li>N, N-dimethylformamide (DMF) 합성 열에서의 10 mL와 Fmoc-NH-샐 수 지의 0.2 g 맛있게</li>
	<li>DMF에 30 %piperidine 5 mL를 추가 합니다. Fmoc 그룹을 쪼개 10 분 솔루션 바위.</li>
	<li>
체크 trinitrobenzenesulfonic 산 (TNBS) Fmoc 분열 테스트12: 1%의 추가 10 µ L DMF에 diisopropylethylamine (DIPEA) 10 x 75 m m2 유리 튜브, 다음 전송 작은 양의 수 지는 유리의 10 µ L TNBS 튜브. Fmoc 죽 습 수 지는 오렌지 색상을 개발 해야 합니다.
	<ol>
<li>이 결과 부정적인 경우 1.2-1.3 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>워시 DMF의 5 mL로 3 회 수 지.</li>
	<li>
O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU), 1-0.3 m m o l의 0.3 m m o l (단계 1에서에서 사용 하는 화합물으로 시작), 표 2에 나열 된 Fmoc 화합물의 0.3 m m o l을 포함 하는 DMF의 5 mL을 추가 Hydroxy 1 H benzotriazole, 토스 (HOBt), 그리고 diisopropylethylamine (DIPEA)의 0.6 m m o l. 30 분 수 지와 함께 몇 가지 솔루션을 바위.
	<ol>
<li>TNBS 테스트와 함께이 단계를 확인 합니다. 결과가 긍정적인 경우에, 즉, 반응이 충분히 진행 되지 하 고이 단계를 반복 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>워시 DMF의 5 mL로 3 회 수 지.</li>
	<li>1.2-1.6, 표 2에 따라 1.5 단계에서 사용한 Fmoc 복합 변경 단계를 반복 하 여 신장 반응을 반복 합니다.</li>
	<li>2.5% 물의 1 mL을 추가 1 %triisopropylsilane (TIS), 그리고 2.5 %ethanedithiol (EDT)에 trifluoroacetic 산 수 지와 보호 그룹에서 펩 티 드를 쪼개 다. 60 분에 대 한 솔루션을 바위.</li>
	<li>필터, 및 50 mL 튜브에는 filtrate 수집.</li>
	<li>-20 ° c.에 하룻밤 찬 diethyl 에탄올과 저장소의 40 mL를 추가</li>
	<li>30 분 동안-20 ° C에서 원심 분리기 4000 x g 펠 릿을 수집 합니다.</li>
	<li>3 h desiccator를 사용 하 여 diethyl 에테르를 제거.</li>
	<li>물 50% 이기의 1 mL을 추가 하 고 원유 펩 티 드를 분해. Trifluoroacetic 산을 제거 하는 솔루션 lyophilize 이 단계를 여러 번 반복 합니다.</li>
	<li>
C18 카트리지 열을 사용 하 여 펩 티 드를 정화.
	<ol>
<li>C18 카트리지 열 이기 (ACN)의 3 mL를 사용 하 여에 수 지를 활성화 합니다.</li>
		<li>5 %ACN, H2o. 0.1 %TFA 5 mL와 함께 equilibrate</li>
		<li>C18 카트리지 열에 원유 합성 펩 티 드를 로드 합니다.</li>
		<li>5 %ACN, H2o. 0.1 %TFA 10 mL로 씻어</li>
		<li>60%의 3 mL과 샘플을 elute ACN, 0.1% TFA H2o.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 그들의 분자량을 측정 하는 펩 티 드를 확인 합니다.
	<ol>
<li>Eluent 대상 접시에의 1 µ L 플라스틱 0.1 %trifluoroacetic 산에서 50% 이기에 포화 α-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (CHCA) 솔루션을 즉시 추가</li>
		<li>공기에서 혼합물을 구체화.</li>
		<li>악기 제조 업체의 프로토콜에 따라 시료의 질량 스펙트럼을 취득 합니다.<ol>
<li>수동으로 설정 긍정적인에 MALDI TOF 질량 분석기 모드를 반영 합니다.</li>
			<li>CHCA를 사용 하 여 질량 분석기 보정, bradykinin 조각 1-7 (monoisotopic 분자량 = 756.3997 Da), 그리고 angiotensin II (monoisotopic 분자 무게 1,045.5423 다 =).</li>
			<li>합성 펩 티 드의 질량 스펙트럼을 취득 하 고 이론적인 분자 무게와 비교 하 여 평가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 조직 추출의 준비
<ol><li>Anesthetize 남성 ICR 마우스 isoflurane 흡입 챔버에 고 발가락 핀치를 통해 마 취 깊이 확인 합니다. 자 궁 경부 전위에 의해 쥐를 안락사.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여, 칼 과정까지 확장 하는 피부를 통해 복 부 절 개를 중간 확인 합니다.</li>
	<li>횡 경 막 통해 잘라내어 수집 모든 폐 조직. 조직의 작은 조각으로 잘라.</li>
	<li>씻어 얼음 50 mM Tris 버퍼 식 염 수 (pH 7.4)와 세 번 조직.</li>
	<li>조직 및 12 x 75 m m2 유리 튜브에 전송 조직의 약 100 밀리 그램 무게.</li>
	<li>추출 버퍼 (50 mM Tris 버퍼, pH 7.4, 0.1% 폴 리 (oxyethylene) octylphenyl 에테르를 포함)의 0.3 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>
폐 조직 샘플 혼합 균질 화기를 사용 하 여 균질
	<ol>
<li>차가운 얼음에 샘플.</li>
		<li>30에 대 한 20000 rpm에서 샘플을 균질 믹서 기에 s. 샘플은 완전히 동 질 때까지이 단계를 반복 합니다. 참고: 온도 증가 피하기 위해 1 분 이상 계속 하지 균질 할.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.5 mL 튜브 4 ° c.에 10000 x g에 5 분 동안 원심 분리기에는 homogenate의 1000 µ L를 전송</li>
	<li>새로운 1.5 mL 플라스틱 튜브에는 상쾌한의 500 µ L를 전송.</li>
	<li>단백질 농도, bicinchoninic 산 (BCA) 같은 메서드 또는 Coomassie 화려한 블루 (CBB) 메서드를 사용 하 여 결정 하는 샘플의 10 µ L을 사용 합니다.</li>
	<li>동결을 방지 하기 위해 50% 글리세롤의 최종 농도 대 한 샘플을 80% 글리세롤을 추가 합니다.</li>
	<li>추가 사용까지-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.</li>
</ol>3. 기판 모델 효소와 조직 추출에서의 소화
<ol><li>
N-토실기-L-페닐알라닌 chloromethyl 케 톤 (TPCK)의 0.1 µ g / µ L의 10 µ L 추가-트립 신, 황색 포도 상 구 균 V8 protease의 µ 0.1 µ g/L 또는 소화 버퍼의 890 µ L에 조직 추출의 µ 10 µ g/L.
	<ol>
<li>PH에 따라 효소 특이성에 차이 명확 하 게, 3, 5, 7, 및 9의 pH를 조정 하는 버퍼를 사용 합니다. 소화 버퍼의 구성 표 3에 표시 됩니다.</li>
		<li>조직 추출 물, 10 분 동안 끓는 물 (또는 100 ° C에서 난방) 외피에 의해 준비에 비활성 효소를 사용 하 여 부정적인 제어를 실시 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iminobiotin 표시 된 기판의 10 µ L 추가 (디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 최종 농도에 녹아 = 100 pmol/10 µ L).</li>
	<li>Iminobiotin 표시 된 기판 소화 37 ° C에서 3 시간 동안 품 어.</li>
	<li>부 화, 후 10 분 동안 끓는 물 (또는 100 ° C에서 난방) 기판의 소화를 중지 합니다.</li>
	<li>10000 x g 4 ° c.에 5 분에 대 한 소화 기판 원심</li>
	<li>새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 합니다.</li>
</ol>4. Iminobiotin 표시 된 기판의 정화
<ol><li>
1 M Tris 버퍼 (pH 9) 포함 0.1% poly(oxyethylene) octylphenyl 에테르에 50% streptavidin sepharose 구슬의 50 µ L를 추가 합니다.
	<ol>
<li>PH 테스트 종이 사용 하 여 pH 9 주위에 솔루션을. 솔루션의 산도 낮은 경우에, 1 M Tris 버퍼 (pH 9) 포함 0.1% poly(oxyethylene) octylphenyl 에테르를 추가 하 여 약 pH 9 조정 합니다. 이 단계는 streptavidin는 iminobiotin 표시 된 기판의 바인딩을 포함 하기 때문에 중요 한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>streptavidin iminobiotin 표시 된 기판 바인딩할 회전 바퀴에 지속적인 부드러운 혼합으로 4 ° C에서 밤새 품 어. 비즈는 부 화에 걸쳐 일시 중단 된 유지 됩니다.</li>
	<li>4 ° c.에 10000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기 제거는 상쾌한.</li>
	<li>
다음과 같이 구슬 5 번 세척.
	<ol>
<li>구슬에 워시 버퍼 (50 mM Tris 버퍼, pH 9)의 1000 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>회전 바퀴에 지속적인 부드러운 혼합으로 4 ° C에서 10 분 동안 세척. 비즈는 부 화에 걸쳐 일시 중단 된 유지 됩니다.</li>
		<li>4 ° C에서 10000 x g에서 1 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
구슬에 0.2 %trifluoroacetic 산의 100 µ L를 추가 합니다.
	<ol>
<li>PH 테스트 종이 사용 하 여 pH 2 아래 솔루션을. 솔루션의 산도 높은 경우에, 1 %trifluoroacetic 산을 추가 하 여 2 아래에 pH를 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>회전 바퀴에 지속적인 부드러운 혼합으로 실 온에서 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>4 ° C에서 10000 x g에서 1 분 동안 centrifuge 다음 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 합니다.</li>
</ol>5. 샘플 준비와 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 질량 분석 (TOF MALDI 질량 분석)
참고: 다음 단계에서 모든 솔루션은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)으로 준비 되어야 한다-학년 또는 아미노산 시퀀싱 급 물.
<ol><li>그것을 활성화 C18 수 지에 이기의 500 µ L 플라스틱 사용된 이기를 제거 합니다. 이 단계를 세 번 반복 합니다.</li>
	<li>0.1 %trifluoroacetic 산의 100 µ L와 C18 수 지 equilibrate Eluent는 제거 합니다. 이 단계를 세 번 반복 합니다.</li>
	<li>샘플을 로드 하는 피 펫을 사용 하 여 수 지에 샘플을 바인딩하십시오.</li>
	<li>0.1 %trifluoroacetic 산의 20 µ L로 수 지를 세척. 5 번이이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>샘플의 0.1 %trifluoroacetic 산에서 60% 이기 3 µ L elute TOF MALDI 질량 분석에 대 한 대상 접시에 eluent 플라스틱 즉시 0.1 %trifluoroacetic 산에서 50% 이기에 포화 α-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (CHCA) 솔루션을 추가 합니다.</li>
	<li>공기에서 혼합물을 구체화.</li>
	<li>
악기 제조 업체의 프로토콜에 따라 시료의 질량 스펙트럼을 취득 합니다.
	<ol>
<li>수동으로 설정 긍정적인에 MALDI TOF 질량 분석기 모드를 반영 합니다.</li>
		<li>CHCA를 사용 하 여 질량 분석기 보정, bradykinin 조각 1-7 (monoisotopic 분자량 = 756.3997 Da), 그리고 angiotensin II (monoisotopic 분자 무게 1,045.5423 다 =).</li>
		<li>샘플, biotin 표시 된 기판의 쪼개진된 형태에 대 한 900 다 700에서 질량 스펙트럼에 세심 한 관심 지불의 질량 스펙트럼을 취득 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>표 1을 사용 하 여 검색 된 봉우리를 식별 합니다. 적절 한 분자량의 검출 관련 아미노산의 C-말단에 분열을 나타냅니다.</li>
</ol>

<ol><li>Neurath, H., Walsh, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+proteolytic+enzymes+in+biological+regulation+%28a+review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).</li>
<li>Surinov, B. P., Manoilov, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+activity+of+proteolytic+enzymes+by+means+of+azocasein%5BTitle%5D)+AND+%22Vopr+Med+Khim%22%5BJournal%5D)">Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein.</a> Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).</li>
<li>Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+casein+zymography+of+matrix+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases.</a> Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).</li>
<li>Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preparation+and+properties+of+two+new+chromogenic+substrates+of+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin.</a> Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).</li>
<li>Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+photometric+or+fluorometric+assay+of+proteinases+using+substrates+containing+7-amino-4-trifluoromethylcoumarin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.</a> Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).</li>
<li>Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescende+determination+of+carboxypeptidase+A+activity+based+on+electronic+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer.</a> Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).</li>
<li>Timmer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+constitutive+proteolytic+events+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Profiling constitutive proteolytic events in vivo.</a> Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).</li>
<li>Biniossek, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protease+specificity+by+combining+proteome-derived+peptide+libraries+and+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).</li>
<li>Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protease+specificity+using+biotin-labeled+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates.</a> Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).</li>
<li>Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iminobiotin+affinity+columns+and+their+application+to+retrieval+of+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).</li>
<li>Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00897a025">Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).</li>
<li>Hancock, W. S., Battersby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+micro-test+for+the+detection+of+incomplete+coupling+reactions+in+solid-phase+peptide+synthesis+using+2%2C4%2C6-trinitrobenzenesulphonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid.</a> Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).</li>
<li>Marttila, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+NeutraLite+avidin%3A+A+non-glycosylated%2C+acidic+mutant+of+chicken+avidin+that+exhibits+high+affinity+for+biotin+and+low+non-specific+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties.</a> FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).</li>
<li>Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+liver+propionyl-CoA+carboxylase+by+carbon+tetrachloride+extraction+and+monomeric+avidin+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography.</a> Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).</li>
</ol>

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

이 프로토콜 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 조직 추출에서 파생 하는 원유 샘플에서 효소 특이성을 식별 하 고 쉽게 여러 샘플 처리에 대 한 조정 될 수 있습니다. 특히, 우리는 기질 특이성에 변화를 일으킬 pH를 조작.
avidin 비타민 b 복합체 복잡 한 (ABC) 메서드, 생화학의 바인딩 특이성 때문에 널리 이용 되는, 우리의 프로토콜에 이용 되었다. ABC의 강한 선호도, 인해 avidin 비타민 b 복합체에의 바인딩 거의 되돌릴 수 하지 않습니다. ABCs에 대 한 친 화력 정화 따라서 매우 효율적입니다. 이러한 이유로, 우리 보고 biotin 표시 된 기판에 대 한 회복 율 낮을 것으로 예상 된다. 이 연구에서 우리만 사용 낮은 pH 수준 차입; 그러나, deglycosylated avidin-수 지13 또는 단위체 avidin-수 지14 도 사용할 수 있습니다 bioti...

프로 테아 제, 단백질 절단형에 의해 생리 적 프로세스 조절 그리고 특정 시간과 장소에서 효소 활동의 개시는 규제1. 그러므로 식 및 로컬 규제, 조직의 활동을 식별 하 고 프로 테아 제를 감지 하는 새로운 방법을 개발 하는 것이 중요 하다. 에 제안 된 방법은이 연구 프로 테아 제를 감지 하는 동시에 효소 특이성을 식별 하는 것을 목표로.
효소 특이성을 탐지 하기 위한 몇 가지 방법이 있습니다. Azocasein 메서드는 프로 테아 제2 의 검출에 사용을 위해 유명 하다 그러나 추가 정보를 얻을 하는 능력에 제한 된다. Zymography 프로 테아 제3의 분자량을 결정 하는 데 사용할 수 있는 또 다른 종합 효소 검출 방식 이지만 기질 특이성을 검사 하는 데 사용할 수 없습니다. 효소 특이성 spectrometric 분석, 기판 p-nitroanilide4, 등을 사용 하 여 및 fluorometric 분석 실험, coumarin 기판5 또는 형광 공명 에너지 전송 (무서 워) 분석 실험6을 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 이 메서드는 단일 잘에서 포함 하는 기판의 단일 특이성 탐지를 사용. 현재 연구에서 이러한 추출 물 포함 여러 프로 테아 제 효소 특이성 조직 추출의 다양 한 조건에서 검사 합니다. 효소 활동은 pH, 코엔자임, prosthetic 그룹, 이온 강도 등 여러 가지 요인에 의해 통제 된다. 최근, proteomics 기반 방법 효소 특이성;을 식별 하기 위해 사용 되었습니다. 예를 들어, Biniossek 외에서 보고 하는 방법. 7 조 추출 물에도 기질 특이성을 결정 하는 프로테옴을 사용 하 고 여러 아미노산 시퀀스8을 인식 하는 프로 테아의 분열 활동의 정확한 결심을 허용 한다. 그러나,이 메서드는 수많은 샘플의 분석에 적합 하지. 우리의 메서드 여러 샘플의 동시 처리 및 Matrix-Assisted 레이저 탈 착/이온화의 사용을 사용 하는 반면, 시간의 비행 (TOF MALDI)는 쪼개진의 신속 하 고 쉽게 감지 샘플 분석을 위한 질량 분석에 용이 하 게 기판입니다.
이 종이 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 독특한 기판의 분자량을 측정 하 여 효소 특이성을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 그들의 이론적 분자 무게, 함께 쪼개진된 기판의 분자 형태는 그림 1 과 표 1에 표시 됩니다. 이전 연구 polyglycine 스페이서 및 biotin9;를 포함 하는 기판 사용 그러나, 이러한 기판 polyglycine 시퀀스 글리신 시퀀스를 인식 하는 효소에 의해 죽 습 있을 수 있습니다 때문에 결함이 있습니다. 또한, avidin 비타민 b 복합체 사이 높은 선호도 낮은 회복 율을 이어질 수 있습니다. 하 우리는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG), iminobiotin, 및 분열 사이트 (그림 1)을 식별할 수 있는 아미노산의 구성 되었다 독특한 기질 합성이 연구에서는 이러한 단점에 향상. 유사한 분자 무게의 아미노산 사이 차별, D-떠들고 못 스페이서 사이 쪼개진된 사이트에서 아미노산 추가 되었습니다.
기판의 N 맨끝 원유 샘플에서 친 화력 정화를 가능 하 게 iminobiotin로 분류 됐다. Biotin 대신 iminobiotin의 사용은 매우 중요; biotin은 avidin, avidin에 대 한 iminobiotin의 선호도 pH에 의해 변경 될 수 있습니다 동안 avidin 수 지에서 biotin 표시 된 기판의 낮은 회수율 결과와 강한 선호도 하고있다. Iminobiotin 표시 된 기판 avidin pH 4 아래 조건에서 기판 iminobiotin 표시를 해제 하는 동안 pH 9, 위의 조건에서 avidin에 바인딩합니다. 따라서, iminobiotin는 친 화력 정화10사용 되었다. 요약, 우리는 독특한 기질을 사용 하 여 효소 특이성을 탐지 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Fmoc-NH-SAL 수지(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]phenoxy resin)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00102</td><td></td></tr><tr><td>N,N-디메틸포름아미드(DMF)</td><td>와타나베 화학(주)</td><td>A00185</td><td></td></tr><tr><td>피페리딘</td><td>와타나베 화학 주식회사</td><td>A00176</td><td></td></tr><tr><td>트리니트로벤젠술폰산(TNBS)</td><td>WAKO Chemical</td><td>209-1483</td><td></td></tr><tr><td>O-(6-클로로-1H-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HCTU)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00067</td><td></td></tr><tr><td>1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt)Watanabe Chemical Co., Ltd. (1-하이드록시-1H-벤조트리아졸,일수화물)</td><td>와타나베 케미컬</td><td>A00014</td><td></td></tr><tr><td>디이소프로필에틸아민(DIPEA)</td><td>와타나베 화학(주)</td><td>A00030</td><td></td></tr><tr><td>트리이소프로필실란(TIS)</td><td>와타나베 화학(주)</td><td>A00170</td><td></td></tr><tr><td>에탄디티올(EDT)</td><td>와타나베 화학(주)</td><td>A00057</td><td></td></tr><tr><td>트리 플루오로 아세트산 (TFA)</td> <td>밀리 포어</td><td>S6612278 403</td><td></td></tr><tr><td>아세토 니트릴</td><td>Kokusan 화학</td><td>2153025</td><td></td></tr><tr><td>C18 카트리지 칼럼</td><td>Waters</td><td>WAT051910</td><td></td></tr><tr><td>폴리 (옥시 에틸렌) 옥틸 페닐 에테르</td><td>WAKO 화학</td><td>168-11805</td><td>트리톤 X-100</td></tr><tr><td>혼합 균질화 기</td><td>Kinematica</td><td>PT3100</td><td>Polytron 균질화기</td></tr><tr><td>Coomassie 브릴리언트 블루(CBB)-G250</td><td>나카라이 케미컬</td><td>094-09</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>나카라이 케미컬</td><td>170-18</td><td></td></tr><tr><td>N-토실-L-페닐알라닌 클로로메틸케톤(TPCK)-트립신</td><td>시그마-알드리치</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>와코케미컬</td><td>043-07216</td><td></td></tr><tr><td>스트렙타비딘 세파로스</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-511-01</td><td></td></tr><tr><td>ZipTipC18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2020</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF 질량 분석기</td><td>Bruker Daltonics, 독일</td><td>autoflex</td><td></td></tr><tr><td>2-iminobiotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4632</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-아미노산</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 조직에서 효소 특이성 결정 tof maldi 질량 분석에 의해 추출: ph 특이성 변경를 조작

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

프로 테아 제 단백질 활성화/비활성화 및 음식 소화를 포함 하 여 여러 생물 학적 기능을가지고. 효소 특이성을 식별 하는 것이 효소 기능을 공개에 대 한 중요 합니다. 이 연구에서 제안 된 메서드는 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화를 사용 하 여 독특한 기판의 분자량을 측정 하 여 효소 특이성을 결정 합니다 시간의 비행 (TOF MALDI) 질량 분석. 기판 포함 iminobiotin, 쪼개진된 사이트 구성 아미노산, 그리고는 스페이서 이루어져 있다 폴 리 에틸렌 글리콜. 쪼개진된 기판 독특한 분자량 쪼개진된 아미노산을 사용 하 여 생성 됩니다. 이 방법의 장점 중 하나입니다 그것은 원유 샘플을 사용 하 여 한 냄비에 실행 될 수 있습니다 그리고 그것은 또한 여러 샘플을 평가 적합. 이 문서에서는, 우리는 마우스 폐 조직, 조직 추출, 소화 기판의에 배치 샘플, 다른 pH 조건 하에서 소화 기판의 정화 등에서 추출 하는 샘플으로 최적화 하는 간단한 실험 방법 설명 및 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 기판의 분자량의 측정. 요약 하자면,이 기술은 여러 샘플 처리에 대 한 쉽게 확장 될 수 있습니다 하는 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 조직 추출에서 파생 하는 원유 샘플에서 효소 특이성의 식별에 대 한 수 있습니다.

모델 프로 테아 제에 의해 효소 특이성의 식별에 대 한 방법의 평가
이 시스템의 효율성은 TPCK-트립 신 및 V8 효소의 기질 특이성 가져온 사용 하 여 평가 되었습니다. TPCK-트립 신 및 V8 효소 아미노산 시퀀스 리 신과 아르기닌 잔류물의 C-터미널 및 aspartic 산 및 글루탐산 잔류물의 카 쪽에서 각각 쪼개 위하여 견적 되었다. 표 1 및 특정 프로 테아 제에 의해 죽 습 조각 소화 기판의 이론적 분자 무게를 보여 줍니다. TPCK-트립 신을 사용 하 여 기판 소화 쪼개진된 조각, 두 번째는 839.81 다 796.76 다 (그림 2A)에서 검출 될 수 생산. 이 파편의 분자 무게는 리 신과 아르기닌의 C-터미널에서 각각 죽 습 파편의 이론적 분자 무게에 맞춰 밀접 하 ...

여기, 선물이 원유 마우스 조직에서 효소 특이성을 결정 하는 프로토콜 MALDI TOF 분석을 사용 하 여 추출.

마우스 조직에서 효소 특이성 결정 TOF MALDI 질량 분석에 의해 추출: PH 특이성 변경를 조작

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

이 실험의 전반적인 목표는 여러 미처리 추출물에서 단백질 분해 효소 특이성을 측정하는 것입니다. 이 방법은 단백질 분해 효소 특이성을 결정하기 위한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 팔레이에서 여러 샘플의 프로테아제 특이성을 식별할 수 있다는 것입니다.수컷 ICR 마우스에서 얻은 폐 조직 샘플을 얼음에서 냉각시킵니다. 믹서에서 30초 동안 20, 000 RMP로 샘플을 균질화합니다. 샘플이 완전히 균질해질 때까지 이 단계를 반복합니다.온도 상승을 방지하기 위해 지속적으로 1분 이상 균질화하지 마십시오. 1.5 밀리리터 관에 균질산염의 1, 000 마이크로리터를 옮기고 10, 4 섭씨 온도에 000 시간 G에 5 분 동안 분리기를 이용하십시오. 500마이크로리터의 상등액을 새로운 1.5ml 플라스틱 튜브로 옮깁니다.10마이크로리터의 샘플을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. bicinchoninic acid assay 또는 Bradford assay와 같은 방법을 사용합니다. 동결을 방지하기 위해 샘플에 80%글리세롤을 첨가하여 최종 농도 50%글리세롤을 만듭니다.pH에 따른 프로테아제 특이성의 차이를 명확히 하려면 pH 3, 5, 7 및 9로 조정된 분해 완충액을 사용합니다. 890 마이크로리터의 소화 완충액에 10 마이크로리터 또는 TPCK 트립신 10 마이크로리터, 마이크로리터 당 0.1 마이크로그램의 황색포도상구균 V8 프로테아제 또는 10 마이크로그램 당 조직 추출물을 첨가합니다. 10분 동안 배양하고 끓는 물에 의해 조직 추출물의 프로테아제를 비활성화하여 negative control을 준비합니다.다음으로, 10마이크로리터의 MNO 비오틴 라벨 기질을 샘플에 추가하고 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양하여 분해합니다. 배양 후 끓는 물로 기질의 소화를 10 분 동안 중단하십시오. 소화된 기질을 10, 4 섭씨 온도에 G 000 시간에 5 분 동안 원심 분리하십시오.상등액을 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 0.1% 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르를 함유한 50%의 스트렙타비딘 세파로스 비드를 하나의 몰 트리스 완충액에 50ml를 추가합니다. pH 테스트 용지를 사용하여 용액이 약 pH 9인지 확인하십시오.적절한 pH를 9 이상으로 조정하는 것이 중요합니다. 아미노 비오틴은 pH 9 이상이 아니면 구슬을 물릴 수 없습니다. 용액의 pH가 낮으면 완충액을 더 추가하여 약 pH 9로 조정하십시오.또한 필요한 경우 pH를 높이기 위해 하나의 몰 트리스 버퍼를 추가할 수 있습니다. 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 로테이터 휠에서 연속적으로 부드럽게 혼합하여 MNO 비오틴 표지 기질을 스트렙타비딘에 결합합니다. 구슬은 배양 내내 매달려 있어야 합니다.다음날, 10, 4 섭씨 온도에 000 시간 G에 1 분 동안 표본을 분리기. 상등액을 제거한 후에, 세척 완충액의 1, 000 마이크로리터를 추가해서 구슬을 세척하십시오. 그런 다음 섭씨 4도에서 10분 동안 로테이터에서 연속적으로 부드럽게 혼합하여 배양합니다.10, 4 섭씨 온도에 G 1 분 동안 구슬을 원심분리기하십시오. 상층액을 제거하고 이 세척을 4회 반복합니다. 다음으로, 비드에 100마이크로리터의 0.2%트리플루오로아세트산을 추가합니다.pH 테스트 용지를 사용하여 용액이 pH 2 미만인지 확인하십시오. 용액의 pH가 높으면 1% 트리플루오로아세트산을 첨가하여 pH를 2 이하로 조정합니다. 실온에서 30분 동안 서스펜션을 배양하고 회전 휠에서 지속적으로 부드럽게 혼합합니다.이전과 같이 비드를 원심분리한 후 상등액을 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 20마이크로리터의 아세토니트릴을 C18 수지에 피펫하여 활성화합니다. 사용한 아세토니트릴을 제거하고 이 활성화 단계를 세 번 반복합니다.그런 다음 C18 수지를 20 마이크로 리터의 0.1 % 트리 플루오로 아세트산으로 평형을 이형시킵니다. 용리액을 제거하고 이 평형 단계를 세 번 반복합니다. 샘플을 로드하려면 피펫을 사용하여 레진에 바인딩합니다.20 마이크로 리터의 0.1 % 트리 플루오로 아세트산으로 수지를 세척하십시오. 이 단계를 5회 반복합니다. 0.1% 트리플루오로아세트산에 60%아세토니트릴을 함유한 3마이크로리터로 샘플을 용리합니다.MALDI-TOF 질량 분광을 위한 타겟 플레이트의 용리액을 피펫으로 만듭니다. 즉시 0.1 % 트리 플루오로 아세트산에 50 % 아세토 니트릴에 포화 된 CHCA 용액을 첨가하십시오. 공기 건조로 혼합물을 결정화하십시오.기기 제조업체의 프로토콜에 따라 샘플의 질량 스펙트럼을 획득하고, 비오틴 라벨 기질의 절단된 형태에 대한 700 - 900 달톤의 질량 스펙트럼에 세심한 주의를 기울입니다. 합성 기질의 질량 스펙트럼이 여기에 나와 있습니다. 전구체 분자량에 해당하는 피크는 850과 1, 050 사이에서 검출되었습니다.절단된 단편은 700 내지 850 범위에서 검출된다. 다음은 TPCK 트립신으로 처리된 MNO 비오틴 표지 기질에 대한 스펙트럼입니다. 839.81 달튼 봉우리와 796.76 달튼 봉우리는 각각 라이신과 아르기닌의 C 말단에서 절단된 단편에 해당합니다.여기에 표시된 것은 V8 프로테아제로 분해된 합성 기질의 질량 스펙트럼입니다. 769.78 달튼 봉우리와 755.62 달튼 봉우리는 각각 글루탐산과 아스파르트산의 C 말단에서 절단된 단편에 해당합니다. 다양한 pH 조건에서 폐 조직 추출물로 처리된 MNO 비오틴 라벨 기질의 스펙트럼이 여기에 나와 있습니다.산성 상태에서, pH 5에서, 절단된 단편의 분자량은 770.13 달톤과 826.66 달톤이었으며, 이는 글루탐산과 트립토판의 C 말단에서 절단을 나타냅니다. pH 7 및 9의 중성 및 염기성 조건에서, 절단된 단편의 분자량은 767 달톤과 840 달톤의 피크에서 증가했으며, 이는 아르기닌과 라이신의 C 말단에서 절단되었음을 나타냅니다. 반대로, 글루탐산과 트립토판의 피크는 감소했습니다.또한 이 방법은 비활성화된 추출물이 있는 절단된 단편을 검출할 수 없습니다. 일단 마스터하면이 기술은 기질 합성을 제외하고 적절하게 수행되면 2 일 안에 완료 할 수 있습니다. 또한 기판이 합성되면 여러 샘플에서 측정할 수 있습니다. 왜?이 절차를 시도할 때 버퍼 pH(약 9)에서 작동해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 일반적으로 아비딘 아미노 비오틴 복합체의 반응. 이 절차에 따라 CMS를 수행하여 효소 활성을 정량화할 수 있습니다.이 방법을 통해 프로테온 분야의 연구자들은 여러 조건에서 프로테아제 발현을 탐구할 수 있는 길을 열 수 있습니다.

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포스포단백질 포스파타제와 그 상호작용자를 확인하기 위한 질량분석법 기반 접근법

우리는 유사한 단백질을 가진 종의 혼합물에서 성분을 식별하고 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 질량분석법은 식별을 위해 펩타이드를 검출하고 피크 면적의 비율에 따라 상대적인 정량화를 제공합니다. 사기 탐지를 위한 도구 식품으로서 이 방법은 쇠고기에서 1% 말을 감지할 수 있습니다.

고기 인증에 펩티드 응용의 MRM 질량 분석을 사용하여 혼합물에서 종 결정 및 정량

배우세요 마우스 조직 추출물에서 MALDI-TOF 질량 분석을 이용한 프로테아제 특이성 결정 방법을. 이 고효율 프로토콜은 다중 샘플 분석을 가능하게 하여 단백질 분해 효소 활성 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

마우스 조직에서 효소 특이성 결정 TOF MALDI 질량 분석에 의해 추출: PH 특이성 변경를 조작

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