회고전 예측에 관한 시퀀싱: 보완 DNA 도서관 준비 프로토콜 포 르 말린 고정 파라핀 포함 RNA 견본을 사용 하 여

이 CDNA 라이브러리 준비의 전반적인 목표는 공식 및 고정 파라핀 포매 조직에 저장된 작은 RNA의 성공적인 염기서열분석을 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 형식 및 고정 파라핀 함유 표본을 분석하는 데 매우 유용합니다. 최대 18개의 검체에서 RNA를 추출하고, 이들 모두의 함량을 분석하고, 모든 검체에 대한 모든 microRNase의 프로파일을 얻습니다.

프로토콜을 시작하려면 이전에 준비된 8.5마이크로리터의 결찰 마스터 믹스를 18개의 개별 분취된 FFPERNA 샘플 각각에 추가합니다. 튜브를 부드럽게 튕기고 2초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.

3마이크로리터 피펫을 사용하여 각 어댑터의 1마이크로리터를 RNA 및 ligation 마스터 믹스를 포함하는 해당 FFPERNA 샘플로 이동합니다. 위아래로 피펫팅하지 말고 FFPERNA 샘플 간에 팁을 교체하십시오. 각 튜브를 닫고 가볍게 두드려 섞은 다음 2초 동안 원심분리합니다.

튜브를 얼음 위에 놓습니다. 섭씨 90도의 열 블록에 튜브를 1분 동안 놓고 즉시 얼음 위에 올려 놓아 반응을 변성시킵니다. 다음으로, 3마이크로리터 피펫을 사용하여 1마이크로리터의 희석된 ligation 효소를 18개의 RNA 샘플 각각에 전달합니다.

얼음 위에 결찰물을 놓고 섭씨 4도의 저온실에 넣어 18시간 동안 하룻밤 동안 배양합니다. 튜브를 섭씨 90도에서 1분 동안 열 블록에 올려 놓아 결찰 반응을 비활성화한 다음 최소 2분 동안 얼음에 다시 넣어 식힙니다. 1.2마이크로리터의 침전 마스터 믹스를 각 튜브에 옮깁니다.

63 마이크로 리터의 100 % 에탄올을 첨가하십시오. 각 튜브를 닫고 튜브를 튕겨 섞은 다음 2초 동안 원심분리합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.

18개 튜브의 내용물을 모두 1.5ml 실리콘 튜브에 결합하고 세 번 뒤집어 섞습니다. 튜브를 2초 동안 원심분리하고 얼음 위에 60분 동안 올려 침전시킵니다. 침전 후 풀링된 결찰물로 1.5ml 튜브를 원심분리합니다.

다음으로, 1ml 피펫 팁으로 상층액을 제거하되 바닥에 약간의 액체를 남겨둡니다. 튜브를 기울이고 20마이크로리터 피펫을 사용하여 남아 있는 상층액을 제거합니다. 10 마이크로 리터 팁이있는 파스퇴르 피펫으로 상층액을 진공 흡입 한 다음 튜브를 튕겨 RNase가없는 물 20 마이크로 리터에 RNA 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

20마이크로리터의 PAA 겔 로딩 용액을 추가하여 RNA를 재현탁합니다. 튜브를 튕기고 실온에서 2초 동안 튜브를 원심분리한 다음 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 이전에 준비된 겔 장치의 0.5 XTBE를 새로운 0.5 XTBE로 교체하고, 후자, 크기 마커 및 ligated RNase를 겔 중앙에 로드하여 양쪽에 두 개의 빈 well을 남겨둡니다.

그런 다음 젤을 실행합니다. 젤을 실행한 후 유리판 중 하나를 제거하여 15%page를 캐스팅 해제합니다. 유리판에 놓인 젤에 10마이크로리터의 형광 염료 용액과 25ml의 0.5XTBE를 가볍게 분사하고 어둠 속에서 5분 동안 평평하게 둡니다.

겔이 든 유리를 청색광 투과광기에 놓고 19개의 뉴클레오타이드와 24개의 뉴클레오티드 크기 마커를 눈금자로 정렬하여 결찰된 작은 RNA의 절제를 지시합니다. 그런 다음 젤을 잘라냅니다. 절제된 겔을 겔 조각을 조각내도록 설계된 0.5ml 튜브에 넣고 1.5ml 실리콘 미세 원심분리기 튜브에 단단히 배치합니다.

실온에서 3분 동안 16,000회 G로 겔을 원심분리하십시오. 300마이크로리터의 400밀리몰 염화나트륨 용액으로 조각난 겔을 재현탁합니다. 튜브를 닫고 파라핀 필름으로 밀봉합니다.

하룻밤 배양을 위해 섭씨 4도의 냉장실에서 1100RPM의 온도 혼합기로 내용물을 교반합니다. 다음 날, 온도 혼합기에서 튜브를 꺼내고 1ml 피펫을 사용하여 용액을 1.5ml 실리콘화된 RNase가 없는 수집 튜브에 삽입된 5마이크로미터 필터 튜브로 옮깁니다. 실온에서 2300회 G로 3분 동안 튜브를 원심분리한다.

필터 튜브를 버리고 여과된 용액이 들어 있는 수집 튜브에 950마이크로리터의 100% 에탄올을 넣고 튜브를 뒤집어 혼합합니다. 튜브를 2초 동안 원심분리한 후 얼음 위에 60분 동안 올려 놓습니다. 그런 다음 RNA 펠릿을 침전시킵니다.

다음으로, 캡을 열고 1ml 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하고 바닥에 약간의 액체를 남겨 두어 RNA 펠릿을 건조시킵니다. 20마이크로리터 피펫을 사용하여 펠릿을 건드리지 않고 남아 있는 상층액을 모두 제거합니다. 튜브를 기울여 남은 용액이 펠릿의 반대쪽으로 이동하도록 합니다.

파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 흡인하고 진공 청소기를 사용하여 펠릿을 건조시킵니다. RNA 펠릿을 5.6마이크로리터의 RNase-free 물에 재현탁합니다. 역전사 시약을 얼음에서 15분 동안 해동합니다.

3마이크로리터의 5X 완충액, 4.2마이크로리터의 10X 디옥시뉴클레오티드 삼인산(DNTP) 및 1.5마이크로리터의 디티오트레이톨(DTT)을 추가하여 역전사 반응을 설정합니다. 튜브를 부드럽게 튕겨 반응을 혼합하고 2초 동안 원심분리하여 용액을 수집합니다. 반응이 정확히 30초 동안 섭씨 90도의 열 블록에 있는 후 온도를 균등화하기 위해 섭씨 50도의 온도 혼합기로 2분 동안 직접 옮깁니다.

0.75마이크로리터의 역전사 효소를 용액에 직접 첨가합니다. 부드럽게 두드려 섞고 즉시 섭씨 50도의 온도 믹서에 튜브를 다시 30분 동안 놓습니다. 30분 후 튜브를 섭씨 95도의 열 블록에 1분 동안 옮겨 역전사를 중지합니다.

95마이크로리터의 RNase-free 물을 역전사에 직접 첨가합니다. 튜브를 튕겨 섞고 얼음 위에 직접 2분 동안 놓습니다. 파일럿 PCR 반응을 조립하고 열 순환기에서 두 개의 PCR 사이클을 설정합니다.

thermo cycler에서 pilot PCR 반응을 설정하고 file one을 시작합니다. 파일 1의 끝에서 20마이크로리터 피펫을 사용하여 파일럿 PCR 반응에서 12마이크로리터를 3마이크로리터의 5X 겔 로딩 염료가 들어 있는 1.5밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 이동합니다. 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.

그리고 10 사이클로 레이블을 지정합니다. 파일럿 PCR 튜브를 닫고 열 순환기에서 파일 2를 시작합니다. 파일 2의 끝에서 20마이크로리터 피펫을 사용하여 12마이크로리터의 용액을 3마이크로리터의 5X 겔 로딩 염료가 있는 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 12사이클에 라벨을 붙입니다.

PCR 주기 14, 16, 18 및 20에서 파일럿 PCR 반응에서 12마이크로리터의 PCR 산물을 수집하려면 위의 단계를 반복합니다. 그런 다음 12 microliter PCR 분취액 각각에 3 μl의 5X gel loading dye를 추가하고, 3 μl의 ladder와 9 μl의 RNase-free water를 포함하는 20 nucleotide ladder에 추가합니다. 0.5 XTBE의 아가로스 겔에서 샘플을 실행한 후 UV 상자에서 겔을 평가하여 최적의 PCR 주기를 식별합니다.

그런 다음 아가로스 겔 라이브러리 정제를 위한 대규모 PCR 반응을 설정합니다. PCR 증폭 후 각 PCR 튜브에서 9마이크로리터를 3마이크로리터의 5X 겔 로딩 염료가 들어 있는 6개의 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 20개의 뉴클레오티드 ladder를 준비합니다.

사다리, PCR 음성 대조군 및 6개의 PCR 산물을 아가로스 겔에 로드하고 120볼트에서 30분 동안 겔을 실행합니다. UV 박스의 레인 간 PCR 단순화의 균일성을 확인하고 이미지를 촬영합니다. 3개의 PCR 반응을 2개의 1.5ml 실리콘화 마이크로 원심분리 튜브에 결합하고, 27마이크로리터의 5몰 염화나트륨과 950마이크로리터의 100% 에탄올을 추가합니다.

튜브를 뒤집어 혼합하고 밤새 섭씨 20도로 설정하여 PCR 산물을 침전시킵니다. 이 프로토콜을 사용하여 두 개의 신선 동결 종양 RNA와 특정 FFPERNA 검체 상대 사이의 마이크로 RNA 발현 상관관계를 확인했습니다. 일치하는 신선 냉동 RNA와 FFPE micro RNA 사이의 플롯은 다르게 처리된 검체에서 검출된 microRNA 사이에 높은 상관관계가 있기 때문에 CDNA Library 준비물이 우수한 재현성을 제공한다는 것을 나타냅니다.

최적화된 CNDA 라이브러리 준비 프로토콜이 점점 더 오래되는 FFPE 검체에 적용 가능하고 재현 가능한지 확인하기 위해 18년, 20년, 22년, 27년, 30년 및 35년 동안 보관된 FFPE 조직의 마이크로 RNA 발현 프로파일을 얻었습니다. 상관 계수는 표본의 연령이나 도서관 준비 주간에 관계없이 0.96 이상으로 유지되었습니다. 따라서 최적화된 CDNA 라이브러리 준비 프로토콜은 보관 시간에 관계없이 FFPE 시료의 재현성 있는 분석을 위한 강력한 도구를 제공합니다.

따라서 이 비디오를 시청한 후에는 작은 RNA 라이브러리를 준비하고 모든 귀중한 공식 및 고정 파라핀 함유 샘플의 전체 미세발현 프로파일을 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.