Name: 회고전 예측에 관한 시퀀싱: 보완 DNA 도서관 준비 프로토콜 포 르 말린 고정 파라핀 포함 RNA 견본을 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 학습하세요 포르말린 고정 파라핀 포함 조직에서 microRNA를 분석하는 cDNA 라이브러리 준비 방법을. 이 프로토콜은 최대 35년 보관된 표본에서도 안정적인 RNA 추출 및 시퀀싱을 가능하게 합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 박사 토마스 Tuschl, RNA 분자 생물학 실험실의 머리 뿐만 아니라 그들의 지원에 대 한와 그의 실험실에 RNAworld 파이프라인에 대 한 액세스를 제공 하는 개발 된 기술을 공유 하기 위한 그의 실험실의 구성원 감사. 우리는 또한 그의 프로토콜을 공유 하 고 그의 초기 절차에 사용 된 모든 생화학 및 효소 단계에 자세한 설명을 제공 하 박사 마르쿠스 Hafner 감사 합니다.

<ol><li>Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+stability+of+microRNAs+in+tissue+samples+of+compromised+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows.+Arch%22%5BJournal%5D)">High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality.</a> Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).</li>
<li>Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excavation+of+a+buried+treasure--DNA%2C+mRNA%2C+miRNA+and+protein+analysis+in+formalin+fixed%2C+paraffin+embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues.</a> Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).</li>
<li>Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Stability+in+Postmortem+FFPE+Tissues%3A+Quantitative+Analysis+Using+Autoptic+Samples+from+Acute+Myocardial+Infarction+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients.</a> PLoS One. 10 (6), e0129338(2015).</li>
<li>Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsa-miR-375+is+differentially+expressed+during+breast+lobular+neoplasia+and+promotes+loss+of+mammary+acinar+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity.</a> J. Pathol. 226, 108-119 (2012).</li>
<li>Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+micro-RNA+profiling+with+formalin-fixed+paraffin-embedded+breast+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues.</a> Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).</li>
<li>Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+array-based+analysis+of+microRNA+expression+comparing+matched+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples.</a> J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).</li>
<li>Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-platform+analysis+of+microRNA+expression+measurements+in+RNA+from+fresh+frozen+and+FFPE+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues.</a> PLoS One. 8, e52517(2013).</li>
<li>Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microRNA+deep+sequencing+of+matched+formalin-fixed+paraffin-embedded+and+fresh+frozen+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues.</a> PLoS One. 8 (5), e64393(2013).</li>
<li>Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+outperforms+mRNA+expression+profiling+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Clin.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).</li>
<li>Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+tissue+using+real+time+quantitative+PCR%3A+the+strengths+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls.</a> J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).</li>
<li>Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissues+from+routine+pathology+archives+are+suitable+for+microRNA+analyses+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR.</a> J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).</li>
<li>Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+miRNA+expression+analysis+using+fluidigm+microfluidics+dynamic+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays.</a> BMC Genomics. 12, 144(2011).</li>
<li>Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).</li>
<li>Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+and+microarray-based+interrogation+of+microRNAs+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%3A+preliminary+assessment+of+cross-platform+concordance%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance.</a> Genomics. 102, 8-14 (2013).</li>
<li>Visone, R., Croce, C. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2671346/">MiRNAs and cancer.</a> Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).</li>
<li>Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li>
<li>Cho, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+potential+biomarkers+for+cancer+diagnosis%2C+prognosis+and+targets+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).</li>
<li>Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNAs+as+diagnostic+or+prognostic+markers+in+human+epithelial+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies.</a> BMC Cancer. 11, 500(2011).</li>
<li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).</li>
<li>Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Adaptation+of+a+Laboratory+Based+cDNA+Library+Preparation+Protocol+for+Retrospective+Sequencing+of+Archived+MicroRNAs+from+up+to+35-Year-Old+Clinical+FFPE+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens.</a> Int J Mol Sci. 18, e627(2017).</li>
<li>Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+DNA%2FRNA+co-extraction+for+analysis+of+microRNAs%2C+mRNAs%2C+and+genomic+DNA+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens.</a> PLoS One. 7 (4), e34683(2012).</li>
<li>Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoded+cDNA+library+preparation+for+small+RNA+profiling+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing.</a> Methods. 58 (2), 164-170 (2012).</li>
<li>Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumina+whole-genome+complementary+DNA-mediated+annealing%2C+selection%2C+extension+and+ligation+platform%3A+assessing+its+performance+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+samples+and+identifying+invasion+pattern-related+genes+in+oral+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma.</a> Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).</li>
</ol>

저자는이 원고에 표시 하는 데이터의 일부를 포함 하는 간행물 Loudig 그 외 여러분 에 의해 분자 과학의 국제 저널에 출판 되었음 공개 하고자 21.

NGS FFPE RNA 표본에서 보관 하는 작은 RNAs의에 대 한 높은 재현성 및 강력한 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜 Hafner 외. 에 의해 설명 하는 절차의 수정 하 고 최적화 된 버전은이 프로토콜에서 제공 됩니다. 22
이 프로토콜의 모든 단계는 FFPE 표본에서 발견 이전 보관 및 손상 된 총 RNA와 함께 사용 하기 위해 최적화 되었습니다. 이 프로토콜 FFPE RNA의 적은 양을 처리의 핵심 단계 18 독특한 3' 바코드 어댑터와 개별 ligations 후 (즉, 18 개별 100 ng FFPE RNA 샘플) 모든 RNA 샘플의 풀링에서 거주 한다. 이 중요 한 단계 18 FFPE RNA 샘플을 균일 하 게 모든 후속 생화학 및 효소 단계 작은 RNA cDNA 라이브러리의 준비를 위해 필요한 수 있습니다. 또한,이 단계 precipitations 겪고 RNA의 양을 극대화 및 젤 담긴 ...

miRNAs는 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 표본1,2,3에 너무나 잘 보존 된다. 이러한 짧은 규제 비 코딩 단일 좌초 RNA 분자의 표현을 FFPE 샘플에서 총 RNA를 사용 하 여 성공적으로 평가할 수 있다 고 관련 유전자 표현 데이터 원본 신선한에 비해 제공 이전 작품 시연 하고있다 조직4,,56,7,8. 비판적으로 FFPE 조직 처리 (포름알데히드, 열, 건조, 등), 내 생 RNases miRNAs (~ 18-24의 작은 크기는 견본의 나이 의해 영향을 받을 수 표시 된 큰 크기 메신저 RNAs에 비교 될 때 뉴클레오티드) 저하 방지 및 장기 저장, 보관 된 표본9의 높은 처리량 mRNA 연구를 능가할 미르 식 연구를 통해 증명 또한 탄력 있도록 나타납니다. miRNA 식 연구 주로 소규모 분석에서 수행 되었습니다, 보관 된 임상 견본을 사용 하 여 해당 단일 증명 또는 다중화 정량 PCR 분석 실험, microarray 기술, 그리고 가장 최근 NGS의 종류 수 있습니다. 이 분석 실험10,,1112,,1314의 최적화 후 보존 된 miRNAs의 식을 평가 하기 위해 사용.
그것은 명백한 되고있다 dysregulation 미르 식의 다양 한 인간 악성의 개발과 관련 된 되었습니다 하 고 보관 된 표본 주석는 잠재적으로 거 대 한 공급의 임상,을이 작은 RNA 분자는 잠재적인 암 바이오 마커의15,16,,1718의 유망한 소스를 나타냅니다. NGS 같은 높은 처리량 유전자 표현 기술의 사용 PCR 그리고/또한 microarrays19등 대상된 기술에 비교 될 때 모든 miRNA 성적표의 글로벌 평가 제공의 이점이 있다. 이러한 이유로, NGS 위한 이전 보관 된 표본에서 작은 RNAs의 cDNA 라이브러리 준비를 위한 최적화 된, 저렴 한 가격, 그리고 쉽게 적용 가능한 프로토콜 대규모 회고전 연구20수 있도록 최적화 되었다.
우리는 이전 우리 현대 상업 키트21을 능가할 수 있는 오래 된 보관 된 표본에서 RNA와 DNA의 별도 복구에 대 한 동시 RNA/DNA 추출 프로토콜을 설립. 시간의 연장된 기간 동안 보관 하는 FFPE 직물에서 총 RNA를이 추출 프로토콜을 사용 하 여, 우리 최대 35 년 동안 임상 표본에서 보존 하는 miRNAs의 NGS 위한 cDNA 라이브러리의 준비를 최적화. 또한, 최근에 출판 된 연구에서 우리가 어디에서 임상 분류 ductal 암에 제자리에 cDNA 라이브러리 (DCIS) 표본 준비, 우리는 표시 된 정량 PCR에 의해 검증 된 차동 표현 된 miRNAs 확인 그 특정 miRNA 표정 변화 DCIS 유방암을 개발 하지 않는 환자에서 DCIS 장애에 비해 유방암에 걸린 환자에서 병 변에서 감지 될 수 있습니다.
고려 상업 키트 작은 RNA cDNA 라이브러리의 준비를 위해, 그들의 중지에 대 한 잠재력의 비용으로 최적화할 수 없습니다 저작권/특허 보호 시 약의 사용, 우리는 이전 게시 된 적응 하기로 실험실 및 키트 무료 3' 바코드 cDNA 라이브러리 준비 위한 프로토콜 FFPE 표본에서 보관 하는 작은 RNAs의 NGS,22를샘플링 18의 동시 분석을 허용 합니다. 이 프로토콜 FFPE RNA 견본에 적응에 대 한 중요 했다, 시각 및 기술 평가 검문소와 이상적이 고 강력한 단계별 절차를 제공 하 고 손상 된 또는 어려운 다른 소스를 응용 프로그램에 대 한 강한 잠재력을가지고 이용 하 여 RNA 소재. 원래 프로토콜의 적용 형광 (예를 들어, SYBR 골드)와 방사성 레이블된 크기 마커를 대체 하 여 향상 되었습니다 감지 RNA 크기 마커 큰 polyacrylamide 젤에 합자 라이브러리의 선택 사용. 3' 18 개별 FFPE RNA 견본을에 바코드 어댑터의 결 찰 의존이 최적화 된 프로토콜 다음 5' 어댑터 결 찰을 함께 풀링된 리버스-전사, 그리고 파일럿 PCR 분석에 대 한 맞춤형 최종 cDNA의 증폭 높은 처리량 시퀀서에 대규모 PCR 증폭, 정화, 그리고 NGS 이전 도서관.

<table><tbody><tr><td>1% Triton x-100</td><td>Invitrogen</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>10mM ATP</td><td>Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10X dNTP</td><td>Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>14M Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>O3445I-100</td><td></td></tr><tr><td>20 nt ladder</td><td>Jena Bioscience</td><td>M-232S</td><td></td></tr><tr><td>20mg/ml 소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>B8894-5ML</td><td></td></tr><tr><td>50X 티타늄 타크</td><td>클론텍 연구소</td><td>639208</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>BRL 수직 젤 전기영동 시스템(유리판 및 빗 포함)</td><td>GIBCO</td><td>V16</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>시그마</td><td>D9170-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuge 5424R</td><td>USA scientific</td><td>4054-4537Q</td><td></td></tr><tr><td>Eppndorf Thermomixer</td><td>USA scientific</td><td>4053-8223Q</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; 실리콘 처리된 저잔류 미세 원심분리기 튜브 1.5ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>겔 브레이커 튜브 0.5ml</td><td>IST Engineering Inc,3388-100</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>젤 전기영동 장치 7cm x10cm- 미니 서브 셀 GT(젤 트레이 및 빗 포함)</td><td>Biorad</td><td>1704446</td><td></td></tr><tr><td>Glycoblue</td><td>Ambion</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Jersey-Cote</td><td>LabScientific, Inc</td><td>1188</td><td></td></tr><tr><td>KcL 2M</td><td>Ambion</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 1M</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge 이중 로터 개인 원심 분리기</td><td>USA Scientific</td><td>2641-0016</td><td></td></tr><tr><td>모델 V16 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동 장치, 안경, 빗 및 스페이서</td><td>Ciore Life Science</td><td>21070010</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td>IDT</td><td>정의 주문</td><td></td>중</tr><tr><td>Owl EasyCast B2 미니 전기영동 시스템- 젤 트레이 및 빗 포함</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick 겔 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>제한 효소 PmeI</td><td>NEB</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 블루라이트 투과광 Thermofisher</td><td></td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE agarose</td><td>Lonza</td><td>50002</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III 역전사 키트</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>SybrGold</td><td>Life Technologies</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA 리가제 1</td><td>NEB</td><td>M0204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA 리가제 2 절단 K227Q</td><td>NEB</td><td>0351L</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>가열식 뚜껑이 있는 Themocycler</td><td>Applied Biosystem</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Sequagel 시스템 농축액, 희석제 및 완충액</td><td>National 진단</td><td>EC-833</td><td></td></tr></tbody></table>

회고전 예측에 관한 시퀀싱: 보완 dna 도서관 준비 프로토콜 포 르 말린 고정 파라핀 포함 rna 견본을 사용 하 여

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

-보관, 임상 분류 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 암 개발의 회고전 분자 연구에 대 한 핵 산을 제공할 수 있습니다. 사용 하 여 나중에 침략 적인 질병을 개발 하는 환자에서 비 침 습 또는 미리 악성 병 변, 진 식 분석 암 위험을 predispose 초기 분자 변경 식별 도움이 됩니다. 그것은 음 핵 산 FFPE 직물에서 발견 한 심각한 물리적 손상과 그들의 분석을 어렵게 하 고 일반적으로 적응된 분석 실험을 요구 한다 화학 수정 받은 설명 하고있다. 그러나 MicroRNAs (miRNAs),, 소규모 클래스를 대표 하는 RNA 분자 ~ 18-24만 까지의 스패닝의 뉴클레오티드, 장기 저장을 견딜 하는 FFPE 샘플에서 성공적으로 분석 된 표시 되었습니다. 여기에서 우리는 3' 바코드 보완 DNA (cDNA) 라이브러리 준비 프로토콜 때 보관 사용 하 여 강력 하 고 매우 재현 될 최근 시연 했다 보관 된 조직에서 추출 하는 작은 RNAs의 분석을 위해 특별히 최적화 된 선물 임상 표본 최대 35 년 저장입니다. 이 라이브러리 준비는 소재의 손상/저하 (최대 18) RNA 샘플 개별 3' 바코드 어댑터와 출혈 하 고 후속 효소 및 생 화 확 적인 준비에 대 한 다음 함께 풀링된 다중 분석을 잘 적응 이전에 분석. 모든 담긴 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지), 크기 관련 선택 및 바코드 작은 RNA 종의 풍부는에 의해 수행 됩니다. 이 cDNA 라이브러리 준비는 파일럿 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 차세대 시퀀싱 (NGS)에 대 한 자료의 최적의 금액을 생산 하는 특정 증폭 주기의 결정 수 분 RNA 입력에 잘 적응. 이 이렇게 최대 35 년 동안 보관 하는 표본에서 저하 FFPE RNA의 사용을 위해 최적화 되었다 고 매우 재현 NGS 데이터를 제공 합니다.

총 18 개별 FFPE RNA 샘플 메서드는 여기에 설명 된 대로 (100 ng 각) 3' adenylated 바코드 oligonucleotide T4 내 고 하룻밤을 별도 튜브에 설정 됩니다. 다음 날, 효소 반응 열 비활성화, 결합, 되며 단일 튜브에 침전. RNA 펠 릿 resuspended와 합자 RNA 분자 15 %polyacrylamide 젤 (페이지), 페이지 젤의 인접 한 우물에 하는 RNA oligonucleotide 크기 마커를 적절 하 게 크기의 3' 바코드를 선택 하는 데 사용 됩니다를 변성 시키기에 분리 된다 작은 RNAs (그림 2). 삭제 젤 조각 elute 합자 RNA 분자를 하룻밤 NaCl 용액에 알을 품는. 다음 날, eluted RNA 침전 하 고 5' 어댑터 결 찰 수행 됩니다. 5' 어댑터 출혈 작은 RNA 분자는 마이그레이션 그리고 12% 아크릴 아 미드 젤, 어디 다시 마이그레...

포 르 말린 고정 파라핀 끼워 넣어진 표본 인간의 질병의 분자 biomarkers의 귀중 한 소스를 나타냅니다. 여기 우리는 실험실 기반 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜, 처음 신선한 냉동된 RNA로 설계 하 고 최적화 된 조직에서 보관 된 microRNAs 분석 저장 최대 35 년 제시.

회고전 예측에 관한 시퀀싱: 보완 DNA 도서관 준비 프로토콜 포 르 말린 고정 파라핀 포함 RNA 견본을 사용 하 여

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

이 CDNA 라이브러리 준비의 전반적인 목표는 공식 및 고정 파라핀 포매 조직에 저장된 작은 RNA의 성공적인 염기서열분석을 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 형식 및 고정 파라핀 함유 표본을 분석하는 데 매우 유용합니다. 최대 18개의 검체에서 RNA를 추출하고, 이들 모두의 함량을 분석하고, 모든 검체에 대한 모든 microRNase의 프로파일을 얻습니다.프로토콜을 시작하려면 이전에 준비된 8.5마이크로리터의 결찰 마스터 믹스를 18개의 개별 분취된 FFPERNA 샘플 각각에 추가합니다. 튜브를 부드럽게 튕기고 2초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.3마이크로리터 피펫을 사용하여 각 어댑터의 1마이크로리터를 RNA 및 ligation 마스터 믹스를 포함하는 해당 FFPERNA 샘플로 이동합니다. 위아래로 피펫팅하지 말고 FFPERNA 샘플 간에 팁을 교체하십시오. 각 튜브를 닫고 가볍게 두드려 섞은 다음 2초 동안 원심분리합니다.튜브를 얼음 위에 놓습니다. 섭씨 90도의 열 블록에 튜브를 1분 동안 놓고 즉시 얼음 위에 올려 놓아 반응을 변성시킵니다. 다음으로, 3마이크로리터 피펫을 사용하여 1마이크로리터의 희석된 ligation 효소를 18개의 RNA 샘플 각각에 전달합니다.얼음 위에 결찰물을 놓고 섭씨 4도의 저온실에 넣어 18시간 동안 하룻밤 동안 배양합니다. 튜브를 섭씨 90도에서 1분 동안 열 블록에 올려 놓아 결찰 반응을 비활성화한 다음 최소 2분 동안 얼음에 다시 넣어 식힙니다. 1.2마이크로리터의 침전 마스터 믹스를 각 튜브에 옮깁니다.63 마이크로 리터의 100 % 에탄올을 첨가하십시오. 각 튜브를 닫고 튜브를 튕겨 섞은 다음 2초 동안 원심분리합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.18개 튜브의 내용물을 모두 1.5ml 실리콘 튜브에 결합하고 세 번 뒤집어 섞습니다. 튜브를 2초 동안 원심분리하고 얼음 위에 60분 동안 올려 침전시킵니다. 침전 후 풀링된 결찰물로 1.5ml 튜브를 원심분리합니다.다음으로, 1ml 피펫 팁으로 상층액을 제거하되 바닥에 약간의 액체를 남겨둡니다. 튜브를 기울이고 20마이크로리터 피펫을 사용하여 남아 있는 상층액을 제거합니다. 10 마이크로 리터 팁이있는 파스퇴르 피펫으로 상층액을 진공 흡입 한 다음 튜브를 튕겨 RNase가없는 물 20 마이크로 리터에 RNA 펠릿을 다시 현탁시킵니다.20마이크로리터의 PAA 겔 로딩 용액을 추가하여 RNA를 재현탁합니다. 튜브를 튕기고 실온에서 2초 동안 튜브를 원심분리한 다음 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 이전에 준비된 겔 장치의 0.5 XTBE를 새로운 0.5 XTBE로 교체하고, 후자, 크기 마커 및 ligated RNase를 겔 중앙에 로드하여 양쪽에 두 개의 빈 well을 남겨둡니다.그런 다음 젤을 실행합니다. 젤을 실행한 후 유리판 중 하나를 제거하여 15%page를 캐스팅 해제합니다. 유리판에 놓인 젤에 10마이크로리터의 형광 염료 용액과 25ml의 0.5XTBE를 가볍게 분사하고 어둠 속에서 5분 동안 평평하게 둡니다.겔이 든 유리를 청색광 투과광기에 놓고 19개의 뉴클레오타이드와 24개의 뉴클레오티드 크기 마커를 눈금자로 정렬하여 결찰된 작은 RNA의 절제를 지시합니다. 그런 다음 젤을 잘라냅니다. 절제된 겔을 겔 조각을 조각내도록 설계된 0.5ml 튜브에 넣고 1.5ml 실리콘 미세 원심분리기 튜브에 단단히 배치합니다.실온에서 3분 동안 16,000회 G로 겔을 원심분리하십시오. 300마이크로리터의 400밀리몰 염화나트륨 용액으로 조각난 겔을 재현탁합니다. 튜브를 닫고 파라핀 필름으로 밀봉합니다.하룻밤 배양을 위해 섭씨 4도의 냉장실에서 1100RPM의 온도 혼합기로 내용물을 교반합니다. 다음 날, 온도 혼합기에서 튜브를 꺼내고 1ml 피펫을 사용하여 용액을 1.5ml 실리콘화된 RNase가 없는 수집 튜브에 삽입된 5마이크로미터 필터 튜브로 옮깁니다. 실온에서 2300회 G로 3분 동안 튜브를 원심분리한다.필터 튜브를 버리고 여과된 용액이 들어 있는 수집 튜브에 950마이크로리터의 100% 에탄올을 넣고 튜브를 뒤집어 혼합합니다. 튜브를 2초 동안 원심분리한 후 얼음 위에 60분 동안 올려 놓습니다. 그런 다음 RNA 펠릿을 침전시킵니다.다음으로, 캡을 열고 1ml 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하고 바닥에 약간의 액체를 남겨 두어 RNA 펠릿을 건조시킵니다. 20마이크로리터 피펫을 사용하여 펠릿을 건드리지 않고 남아 있는 상층액을 모두 제거합니다. 튜브를 기울여 남은 용액이 펠릿의 반대쪽으로 이동하도록 합니다.파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 흡인하고 진공 청소기를 사용하여 펠릿을 건조시킵니다. RNA 펠릿을 5.6마이크로리터의 RNase-free 물에 재현탁합니다. 역전사 시약을 얼음에서 15분 동안 해동합니다.3마이크로리터의 5X 완충액, 4.2마이크로리터의 10X 디옥시뉴클레오티드 삼인산(DNTP) 및 1.5마이크로리터의 디티오트레이톨(DTT)을 추가하여 역전사 반응을 설정합니다. 튜브를 부드럽게 튕겨 반응을 혼합하고 2초 동안 원심분리하여 용액을 수집합니다. 반응이 정확히 30초 동안 섭씨 90도의 열 블록에 있는 후 온도를 균등화하기 위해 섭씨 50도의 온도 혼합기로 2분 동안 직접 옮깁니다.0.75마이크로리터의 역전사 효소를 용액에 직접 첨가합니다. 부드럽게 두드려 섞고 즉시 섭씨 50도의 온도 믹서에 튜브를 다시 30분 동안 놓습니다. 30분 후 튜브를 섭씨 95도의 열 블록에 1분 동안 옮겨 역전사를 중지합니다.95마이크로리터의 RNase-free 물을 역전사에 직접 첨가합니다. 튜브를 튕겨 섞고 얼음 위에 직접 2분 동안 놓습니다. 파일럿 PCR 반응을 조립하고 열 순환기에서 두 개의 PCR 사이클을 설정합니다.thermo cycler에서 pilot PCR 반응을 설정하고 file one을 시작합니다. 파일 1의 끝에서 20마이크로리터 피펫을 사용하여 파일럿 PCR 반응에서 12마이크로리터를 3마이크로리터의 5X 겔 로딩 염료가 들어 있는 1.5밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 이동합니다. 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.그리고 10 사이클로 레이블을 지정합니다. 파일럿 PCR 튜브를 닫고 열 순환기에서 파일 2를 시작합니다. 파일 2의 끝에서 20마이크로리터 피펫을 사용하여 12마이크로리터의 용액을 3마이크로리터의 5X 겔 로딩 염료가 있는 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 12사이클에 라벨을 붙입니다.PCR 주기 14, 16, 18 및 20에서 파일럿 PCR 반응에서 12마이크로리터의 PCR 산물을 수집하려면 위의 단계를 반복합니다. 그런 다음 12 microliter PCR 분취액 각각에 3 μl의 5X gel loading dye를 추가하고, 3 μl의 ladder와 9 μl의 RNase-free water를 포함하는 20 nucleotide ladder에 추가합니다. 0.5 XTBE의 아가로스 겔에서 샘플을 실행한 후 UV 상자에서 겔을 평가하여 최적의 PCR 주기를 식별합니다.그런 다음 아가로스 겔 라이브러리 정제를 위한 대규모 PCR 반응을 설정합니다. PCR 증폭 후 각 PCR 튜브에서 9마이크로리터를 3마이크로리터의 5X 겔 로딩 염료가 들어 있는 6개의 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 20개의 뉴클레오티드 ladder를 준비합니다.사다리, PCR 음성 대조군 및 6개의 PCR 산물을 아가로스 겔에 로드하고 120볼트에서 30분 동안 겔을 실행합니다. UV 박스의 레인 간 PCR 단순화의 균일성을 확인하고 이미지를 촬영합니다. 3개의 PCR 반응을 2개의 1.5ml 실리콘화 마이크로 원심분리 튜브에 결합하고, 27마이크로리터의 5몰 염화나트륨과 950마이크로리터의 100% 에탄올을 추가합니다.튜브를 뒤집어 혼합하고 밤새 섭씨 20도로 설정하여 PCR 산물을 침전시킵니다. 이 프로토콜을 사용하여 두 개의 신선 동결 종양 RNA와 특정 FFPERNA 검체 상대 사이의 마이크로 RNA 발현 상관관계를 확인했습니다. 일치하는 신선 냉동 RNA와 FFPE micro RNA 사이의 플롯은 다르게 처리된 검체에서 검출된 microRNA 사이에 높은 상관관계가 있기 때문에 CDNA Library 준비물이 우수한 재현성을 제공한다는 것을 나타냅니다.최적화된 CNDA 라이브러리 준비 프로토콜이 점점 더 오래되는 FFPE 검체에 적용 가능하고 재현 가능한지 확인하기 위해 18년, 20년, 22년, 27년, 30년 및 35년 동안 보관된 FFPE 조직의 마이크로 RNA 발현 프로파일을 얻었습니다. 상관 계수는 표본의 연령이나 도서관 준비 주간에 관계없이 0.96 이상으로 유지되었습니다. 따라서 최적화된 CDNA 라이브러리 준비 프로토콜은 보관 시간에 관계없이 FFPE 시료의 재현성 있는 분석을 위한 강력한 도구를 제공합니다.따라서 이 비디오를 시청한 후에는 작은 RNA 라이브러리를 준비하고 모든 귀중한 공식 및 고정 파라핀 함유 샘플의 전체 미세발현 프로파일을 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

retrospective-microrna-sequencing-complementary-dna-library

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

유전자 발현, 돌연변이 및 유전자 융합에 대해 선택된 전사체를 조사하기 위한 데이터 분석을 사용한 색인화된 cDNA 라이브러리 준비, 혼성화 및 캡처를 포함하는 표적 RNA 염기서열분석 기반 방법을 설명합니다. Targeted RNAseq를 사용하면 데스크톱 염기서열분석기에서 선택된 전사체를 비용 효율적이고 신속하게 평가할 수 있습니다.

RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

이 수정 추출 프로토콜은 조직 병리학 적 조직 블록에 대한 관심이 더 정확하게 대상 지역의 RNA 및 DNA 수율을 향상시킨다.

RNA 및 DNA 추출 모두 포르말린 고정 파라핀 - 임베디드 조직 코어의 제조

이 프로토콜은 림프절 조직 식별 하 고 가축과 야생 동물, 샘플링 방법에서 림프절의 절단 단계를 포함 하 여 큰 동물에서의 프로 파일링 transcriptomic RNA의 격리에 대 한 절차의 개요를 제공 사후 수집 보존 및 RNA 분석 처리에 대 한 여러 동물, 그리고 고려 사항 플러스 대표 결과 걸쳐 일관성을 제공 합니다.

수집 및 RNA 분석에 대 한 큰 동물에서 림프절의 처리: 큰 동물 종의 림프 노드 Transcriptomic 연구에 대 한 준비

원형 RNA (circRNAs)는 단백질 사이 전사 규칙 그리고 중재 상호 작용에 있는 역할을 할 수 있는 비 코딩 RNA입니다. circRNA 염기서열 분석 라이브러리의 구성을 위한 상이한 파라미터의 평가에 이어, RNase R 전처리와 함께 좌초된 총 RNA 라이브러리 제제를 활용한 프로토콜이 컴파일되고 여기에 제시된다.

RNA 시퀀싱을 사용하는 원형 RNA 식별

치료 저항은 수시로 향상된 전립선암을 가진 환자에서 발전하고, 어떤 경우에는, 암은 신경 내분비 전립선암에게 불린 치명적인 특수형으로 점진합니다. 이 전이를 촉진하는 작은 비 코딩 RNA 매개 분자 변경을 평가하면 신경 내분비 전립선암의 발달로 이어지는 인과 메커니즘의 더 나은 질병 계층화 및 식별이 가능합니다.

거세 저항하는 전립선암 환자에게서 포르말린 고정 조직 및 혈청 유래 엑소좀에서 작은 비코딩 RNA를 시퀀싱

고형 종양 조직의 정량적 면역 프로파일을 결정하고 면역 종양학 바이오마커 발견을 위한 임상 코호트를 활용하는 RNA 기반 접근법의 사용은 분자 및 정보학 프로토콜을 통해 설명된다.

고형 종양의 예측 면역 모델링

이 방법은 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) RNA 샘플로부터 얻을 수 있는 서열 데이터의 질 및 양을 개선하는 단계를 설명한다. 우리는 FFPE-RNA 샘플의 품질을 보다 정확하게 평가하고, 시퀀싱 라이브러리를 준비하고, FFPE-RNA 샘플의 데이터를 분석하는 방법론을 설명합니다.

저하된 FFPE-RNA 시료의 시퀀싱 및 분석을 위한 최적화

우리는 초기 마우스 배아에 있는 microRNAs를 프로파일링하기 위한 기술을 기술합니다. 이 프로토콜은 낮은 세포 입력 및 작은 RNA 농축의 도전을 극복합니다. 이 분석은 초기 마우스 배아의 상이한 세포 계보에서 시간이 지남에 따라 miRNA 발현의 변화를 분석하기 위하여 이용될 수 있다.

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

이 프로토콜은 마이크로RNA와 다중화된 단백질을 동시에 검출하고 정량화하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 사용한 탠덤 면역형광 혼성화 분석을 설명합니다.

새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식

여기서 우리는 프로토콜이 메틸 바인딩 DNA 캡처 시퀀싱 (MBDCap-서열 또는 MBD-SEQ) 기술과 이후의 생물 정보학 분석 파이프 라인을 사용하여 대규모 임상 환자 스크리닝 연구에서 게놈 전체 DNA 메틸화를 조사하기 위해 제시한다.

환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

학습하세요 포르말린 고정 파라핀 포함 조직에서 microRNA를 분석하는 cDNA 라이브러리 준비 방법을. 이 프로토콜은 최대 35년 보관된 표본에서도 안정적인 RNA 추출 및 시퀀싱을 가능하게 합니다.

회고전 예측에 관한 시퀀싱: 보완 DNA 도서관 준비 프로토콜 포 르 말린 고정 파라핀 포함 RNA 견본을 사용 하 여

더 많은 동영상 탐색