Name: 공동 설계 된 내 피 세포와 인간 난소 조직 이식: 세포 기반 전략 결합 가속 직접 Paracrine 배달 관류 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 학습하세요 냉동 보존 인간 난소 조직과 공동 설계된 내피 세포를 이식하여 관류를 가속화하고 난포 활성화를 촉진하는 방법을. 이 기술은 조직 생존율을 높이고 난포 발생의 분자 조절 메커니즘을 연구하는 강력한 모델을 제공합니다.

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오마르 알렉산더 남자 그림에 대 한입니다. 들어가게 과학 센터와는 ASRM 연구 보조금 및 임 코넬 임상에서 파일럿 수상에 의해 지원 되었다. 저자는 제임스 연구소 회원 원고의 중요 한 독서에 대 한 감사 하 고 싶습니다.

동물 주제와 관련 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) Weill 코넬 의학 대학에 의해 승인 되었습니다. 난소 조직을 사용 하 여 모든 xenotransplantation 실험 관련 지침 및 규정에 따라 수행 했다. 인간의 난소 조직 화학 요법 이나 방사선 암 치료 또는 이전 골 수 이식 치료 예정 환자에서 수집 되었다. 기관 심사 위원회 (IRB) 위원회의 Weill 코넬 의학 대학 조직의 잠재적인 헌 용, 그리고 환자의 동의 연구 사용에 대 한 그들의 난소 조직의 최대 10%의 기부를 수행한 컬렉션 승인.
1입니다. 인간 난소 조직의 수집
참고: 때 난소 조직을 원격 시설 교통에서 수송 된다, 시간 5 h18,19을 초과 하지 말아야 합니다.
<ol><li>난소 조직 수집 하 고는 멸 균 생리 식 염 수로 헹 구 십시오.</li>
	<li>멸 균 용기에 난소를 놓습니다.</li>
	<li>난소는 완전히 매체에 잠기 다 때까지 Leibovitz의 L-15 매체를 붓는 다.</li>
	<li>닫고 컨테이너를 밀봉 합니다.</li>
	<li>얼음에 컨테이너를 수송.</li>
</ol>2. 슈미트 외. 에서 적응 조달된 난소 조직 처리 18
<ol><li>
난소 처리 및 동결에 대 한 준비
	<ol>
<li>100 mL 매체의 처리를 위한 준비: Leibovitz의 L-15 중간 99 + 1 mL 항생제 antimycotic 솔루션. 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 미디어를 필터링 합니다. 냉장 하는 매체를 유지.</li>
		<li>100 mL cryo 막는으로 DMSO를 사용 하 여 냉동 솔루션의 준비. 추가 69.64 mL Leibovitz L-15 중간, 17.66 mL 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 3.42 g (0.1 mol/L의 최종 농도 만들려고) 자당의 10.65 mL (1.5 mol/L의 최종 농도 만들려고) DMSO, 1 mL 항생제 antimycotic 솔루션. 150 mL 필터 유닛, 0.2 µ m. 4 ° c.에 중간 저장소를 사용 하 여 매체를 필터링</li>
		<li>래핑된 고체 살 균 주기 위해 프로그램 압력솥을 사용 하 여 수술 도구를 소독.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
조직의 도착 시
	<ol>
<li>무 균 수술 도구는 biosafety 내각 설정: 날카로운 곡선 잘 블레이드 번호 21, 메스가 위와 집게에 다양 한 크기: 긴 (약 150 m m 길이)와 중간 크기의 2 (약 110 m m 길이).</li>
		<li>멸 균 장갑을 착용, biosafety 내각 내에서 컨테이너를 엽니다. 난소를가지고 하 고 150 mm 페 트리 접시에 부 어 냉 매체 난소 조직의 탈수를 방지 하기 위해 난소 위에 2.1.1 단계에서 준비.</li>
		<li>어떤 잔여 조직에서 난소를 분리 하 고 조직 및 혈액 없다 때까지 차가운 매체와 그것을 씻어.</li>
		<li>깨끗 한 150 mm 페 트리 접시에에서 난소, 차가운 추가 중간, 2.1.1 난소는 절반 그것에 빠져들 때까지 단계에서 준비.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
난소 조직의 해 부
	<ol>
<li>난소를 이등분 하 고 곡선된 좋은 위를 사용 하 여 예리한 해 부에 의해 모 수를 먼저 제거 하는 방법. 다음에 블레이드 번호 21 살 균 메스를 사용 하 여, 모 다쳤어요. 대뇌 피 질의 조직 될 때까지 1-1.5 m m 두께에 앞.</li>
		<li>대뇌 피 질의 조직 폭에서 2-3 mm의 조각으로 잘라, 스트립의 길이 처리 된 난소 작품의 전체 길이 될 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 난소 조직 느린 동결, 뉴턴 외에서 적응. 그리고 아나 외. 6 , 20
<ol><li>
동결에 대 한 준비
	<ol>
<li>라벨 cryovials (1.8 mL).</li>
		<li>2.1.2 각 유리병에 단계에서 준비 냉동 솔루션의 1.5 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>극저온 유리병 동결 솔루션이 포함 된 당 한 대뇌 피 질의 스트립 전송.</li>
		<li>Equilibrate 회전 접시에 20 분에 대 한 대뇌 피 질의 스트립, 부드러운 동요 4 ° c.에 적용</li>
	</ol>
</li>
	<li>
천천히 난소 조직 동결
	<ol>
<li>0 ° c.에 시작 하는 프로그래밍 가능한 평면 냉장고에는 cryovials를 로드</li>
		<li>2 ° C/min-7 ° c에 냉각</li>
		<li>10 분이 일정 한 온도에서 조직 유지.</li>
		<li>액체 질소 (선2)에 목화 팁 각 cryovial으로 얼음 크리스탈 nucleation 유도, 수동 시드를 수행 합니다.</li>
		<li>0.3 ° C/min에 시료의 온도-40 ° c.에 도달할 때까지 계속</li>
		<li>-140 ° c에 10 ° C/min의 빠른 속도로 냉각</li>
		<li>LN2에 저장 dewar cryovials 전송 (-196 ° C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 수술 (양측 Oophorectomy와 공동 이식)에 대 한 준비
<ol><li>
접시의 준비
	<ol>
<li>이식에 대 한 난소 조직을 녹고 전날<ol>
<li>50 mm 페 트리 접시의 하단에 플라스틱 파라핀 필름 조각을 넣으십시오, 스프레이 그것을 70% 에탄올까지 완전히 덮여 있을 것입니다.</li>
			<li>페 트리 접시 하룻밤에 떠나지는 biosafety 캐비닛. 마우스 당 2 접시를 준비 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>수술 날에<ol>
<li>Biosafety 내각 내에서 플라스틱 파라핀 영화를 포함 하는 배양 접시에서 에탄올 발음</li>
			<li>에탄올을 완전히 증발 될 때까지 페 트리 접시 리드를 반 열어 둡니다.</li>
			<li>플라스틱 파라핀 영화는 완전히 건조 될 때 페 트리 접시의 뚜껑을 닫습니다. 유지는 biosafety 내 캐비닛.</li>
			<li>0.1 mol/L 자당 + 1 mol/L DMSO, 0.1 mol/L 자당 + 0.5 mol/L DMSO, 0.1 mol/L 자당, 기본적인 녹고 솔루션 (BTS), 매체는 6의 레이블 우물 잘 따라, 플레이트.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
솔루션의 준비
	<ol>
<li>BTS의 100 mL를 준비: Leibovitz의 L-15 중간 79 mL + FBS 20 mL + 항생제 Antimycotic 솔루션 1 mL. 0.22 μ m 필터 시스템으로 필터링 합니다.</li>
		<li>0.1 mol/l 자당 BTS의 10 mL를 준비 합니다. 자당의 0.342 g 확장 하 고 준비 단계 4.2.1, 동요는 자당 완전히 해산 될 때까지 부드럽게에서 BTS의 10 mL를 추가 합니다. 필터 주사기를 사용 하 여 솔루션 0.22 μ m 필터.</li>
		<li>표 1에 따라 솔루션을 준비 합니다. 커버 알루미늄 호 일로 DMSO를 포함 하는 관. 사용할 때까지 냉장 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 난소 조직을 급속 한 해빙
<ol><li>LN2 를 꺼내 dewar 난소 조직 동결을 포함 하는 유리병 30 실 온에서 보관 하 고 s.</li>
	<li>티슈 페이퍼를 사용 하 여 깨끗 한 유리병을 닦아냅니다.</li>
	<li>1-2 분까지 30 ° C 물 욕조에 유리병을 담가 그것의 ' 콘텐츠 해 동.</li>
	<li>유리병을 열고 첫 번째 솔루션 (0.1 mol/L 자당 + 1 mol/L DMSO, 단계 4.2.3에서에서 준비) 3 ml를 포함 하는 첫 번째 잘에서 대뇌 피 질의 스트립을 놓습니다. 참고: 모든 단계는 접시의 뚜껑을 열고 관련 된 층 류에서 수행 됩니다.</li>
	<li>알루미늄 호 일이 단계에 대 일 분 접시 덮여 유지 4 ° C에서 회전 접시에 6 잘 플레이트를 품 어.</li>
	<li>두 번째 솔루션 (0.1 mol/L 자당 + 0.5 mol/L DMSO, 단계 4.2.3에서에서 준비)의 두 번째 잘 포함 3 mL에 대뇌 피 질의 스트립을 전송 합니다.</li>
	<li>알루미늄 호 일이 단계에 대 일 분 접시 덮여 유지 위한 4 ° C에서 부드러운 동요에 대 한 회전 접시에 6 잘 플레이트를 품 어.</li>
	<li>솔루션 (0.1 mol/L 자당, 4.2.2 단계에서 준비와 BTS)의 4 mL를 포함 하는 세 번째 잘으로 대뇌 피 질의 스트립을 전송 합니다.</li>
	<li>5 분 동안 4 ° C에서 부드러운 동요에 대 한 회전 접시에 품 어.</li>
	<li>솔루션 (BTS, 단계 4.2.1에서에서 준비)의 네 번째 잘 포함 4 mL에 대뇌 피 질의 스트립을 전송 합니다.</li>
	<li>5 분 동안 4 ° C에서 부드러운 동요에 대 한 회전 접시에 품 어.</li>
	<li>(2.1.1 단계에서 준비) 차가운 매체의 마지막 잘 포함 4 mL에 대뇌 피 질의 스트립을 전송 합니다. 얼음 해 동된 난소 조직을 이식 수행까지 유지.</li>
</ol>6입니다. 난소 조직의 캡슐화
<ol><li>
다음 솔루션을 준비
	<ol>
<li>25 mL의 0.9% 식 염 수에 20 mmol/L HEPES 버퍼를 준비 합니다. 필터와 4 ° c.에 게</li>
		<li>CaCl2 농도 1 mol/l. 필터의 1 mL를 준비 하 고 4 ° c.에 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fibrinogen 50 mg/mL 재고 솔루션을 준비
	<ol>
<li>천천히 fibrinogen는 HEPES에 혼합 하 여 0.9% 식 염 수에 20 mmol/L HEPES 버퍼의 20 mL으로 Fibrinogen의 1 g 37 ° c.에 몇 시간 동안 염 분 버퍼 추가</li>
		<li>1.7 mL 마이크로 원심 튜브 라벨.</li>
		<li>0.45 μ m 주사기 필터를 통해 그리고 0.2 µ m 주사기 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.</li>
		<li>약 수 마이크로 원심 튜브와-20 ° c.에 게 200 µ L로 솔루션</li>
	</ol>
</li>
	<li>
트 롬 빈 100 U/mL 재고 솔루션을 준비 참고: 트 롬 빈 솔루션 adsorb 유리, aliquot 플라스틱 튜브/튜브에 솔루션.<ol>
<li>트 롬 빈의 U 250에 0.9% 멸 균 식 염 수의 2.5 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>솔루션 완전히 녹을 때까지 부드럽게 흔들어입니다.</li>
		<li>1.7 mL 마이크로 원심 튜브 라벨.</li>
		<li>마이크로 원심 튜브 및 저장소-80 ° c.에 aliquot 50 µ L 0.2 µ m 주사기 필터를 통해 필터링</li>
	</ol>
</li>
	<li>
70 µ L, 10 mg/mL fibrinogen 및 5 U/mL 트 롬 빈의 최종 농도 얻기의 섬유 소 혈전을 만들기 참고: 빨리, 몇 초에 솔루션 병 일 있는지 확인 합니다. 또한, 혼합물에 거품의 추가 하지 마십시오.<ol>
<li>1.7 mL 마이크로 원심 튜브에서 Fibrinogen 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>360 추가 20 mmol/L의 µ L HEPES Fibrinogen 주식의 aliquoted 200 µ L 0.9% 염 분 해결책에서 버퍼링 단계 6.2.4에서에서 준비.</li>
			<li>부드러운 pipetting으로 혼합.</li>
			<li>얼음에 그것을 유지.</li>
		</ol>
</li>
		<li>두 번째 마이크로 원심 튜브에서 트 롬 빈 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>DMEM의 148.7 µ L, 트 롬 빈의 aliquoted 50 µ L을 추가 단계 6.3.4에서에서 준비.</li>
			<li>부드러운 pipetting으로 혼합.</li>
			<li>1 mol/L CaCl2의 1.3 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>부드러운 pipetting으로 혼합.</li>
			<li>얼음에 그것을 유지.</li>
		</ol>
</li>
		<li>3 마이크로 원심 튜브에서 단일 셀 정지를 준비 합니다.<ol>
<li>격판덮개는 효소 세포 분리 매체를 사용 하 여에서 설계 된 내 피 세포를 분리 합니다.</li>
			<li>스핀 다운는 커버 유리를 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 카운트.</li>
			<li>난소 조직 마다 1 m m2 당 20000 셀을 사용 합니다. M m2에서 난소 조직의 20000 x 영역을 계산 합니다.</li>
			<li>설계 된 내 피 세포 아래로 회전 시키십시오 그리고 다시 기본 매체 (DMEM) 16.8 µ L의 총 볼륨에 도달에서 그것을 중단.</li>
			<li>얼음에 그것을 유지.</li>
		</ol>
</li>
		<li>몇 초 동안 그것을 건조 멸 균 거 즈 스펀지에 난소 조직의 조각을 넣으십시오.</li>
		<li>50 mm 페 트리 접시 내 플라스틱 파라핀 필름 위에 난소 조직의 조각 장소.</li>
		<li>세포 현 탁 액 단계 6.4.3.4, 부드러운 pipetting으로 믹스에서에서 준비에 준비 단계 6.4.1.2, Fibrinogen 솔루션의 39.2 µ L를 추가 합니다. 얼음에 그것을 유지.</li>
		<li>6.4.2.4 단계에서 준비 하는 트 롬 빈 솔루션의 14 µ L를 추가 합니다. 한 번 pipetting으로 부드럽게 혼합. 빠른 작업.</li>
		<li>난소 조직 위에 혼합 배치 피펫으로 길쭉한 작은 물방울의 형태로.</li>
		<li>37 ° c.에 인큐베이터에는 응고와 페 트리 접시를 놓으십시오</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 양자 Oophorectomy와 공동 NSG 마우스 조작된 내 피 세포와 인간 난소 조직 이식
참고: 10 14 주 된 여성 NSG 쥐21 사용 했다 (잭슨 실험실).
<ol><li>2.1.3 단계에서 정교로 모든 수술 도구를 준비, 모든 봉합, 패드, 및 유용 외과 테이프를가지고 있는지 확인 하십시오.</li>
	<li>
마우스와 Isoflurane 마 취 시스템을 사용 하 여 anesthetize
	<ol>
<li>유도 챔버에 마우스를 놓고 뚜껑 닫고 적절 한 자 지를 엽니다.</li>
		<li>오픈 유량 1000 mL/분 하는 기화 기에 설정 하 고 설정 2-3.5% 제공.</li>
		<li>마 취;의 효과 관찰 의식, 천천히 그리고 일반 호흡의 손실입니다.</li>
		<li>마 취를 유지 하는 원뿔을 전송. 생체 신호에 따라 1-3%를 제공 하는 기화 기를 설정 합니다.</li>
		<li>페달 또는 꼬리 반사의 부재를 확인 합니다. 그것은 결 석 때까지 반사 있으면 isoflurane 증가.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전기 헤어 트리머를 사용 하 여 clavicles 줄에서 마우스의 뒤로 머리를 잘라.</li>
	<li>수술 플랫폼에서 발생 하기 쉬운 위치에 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>외과 테이프를 사용 하 여 수술 플랫폼 코 콘 수정 합니다.</li>
	<li>1.25 cm 넓은 외과 종이 테이프를 사용 하 여 수술 플랫폼을 부드럽게 마우스의 사지를 테이프.</li>
	<li>살 균 윤활제 젤리를 사용 하 고 수술 플랫폼 1.25 c m 구멍 플라스틱 외과 테이프를 사용 하 여 그것을 녹화 하 여 홍보 수정 온도계 온도계를 삽입.</li>
	<li>테이프 2.5 c m 넓은 외과 종이 테이프를 사용 하 여 수술 플랫폼에 꼬리.</li>
	<li>적외선 또는 열 패드, 온수를 사용 하 여 열 하 고 절차를 통해 마우스의 온도 모니터링 합니다. 35-37 ° c.의 범위 내에서 체온을 유지</li>
	<li>살 균 Povidone-요오드 솔루션 면봉 막대기로 잘린된 영역을 청소 하 고 닦아 무 균 알코올 준비를 사용 하 여.</li>
	<li>6.9 두 번 더 반복 합니다.</li>
	<li>탈수에서 보호 하 고 각 막에 손상에 마우스의 눈의 각각 메 마른 눈 윤활제 수 의사 연 고의 드롭 장소.</li>
	<li>메 마른 외과 용 드 레이프를 사용 하 여 마우스를 커버.</li>
	<li>주사 Buprenorphine (1 mg/Kg) 하위 피부 (S/C).</li>
	<li>메스 (블레이드 #21)를 사용 하 여 경도 중간 등 쪽 절 개를 수행 합니다.</li>
	<li>
양국간 oophorectomy를 지 방식을 사용 합니다.
	<ol>
<li>피하 결합 조직 무딘 해 부가 위를 사용 하 여 무료.</li>
		<li>중간 확인 절 개를 옆으로 근 막 꼬 집 고 날카로운가 위를 사용 하 여 복 막 구멍에 도달.</li>
		<li>난소와 난소 지방 패드 부드럽게 핀셋으로을 복 부 구멍에 그것을 꺼내.</li>
		<li>혈관 클램프와 난소 및 지방 패드를 파악.</li>
		<li>난소와 난소, 나 팔 관을 원심의 기지에서 4/0 monofilament 흡수 봉합 사를 사용 하 여 지방 패드를 선.</li>
		<li>넥타이 원심 난소를 클립. 그 루터 기의 기지에서 아무 출혈은 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>복 부 구멍으로 다시 조직을 놓고 6/0 꼰된 흡수 봉합 사를 사용 하 여 근 막 봉합 합니다.</li>
		<li>Contralateral 측면 단계 7.15.1-7.15.7를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
공동 난소 조직을 이식.
	<ol>
<li>Gluteus Maximus 혈전 크기에 맞는 길이에 위에 근 막에 수평 절 개를 수행 합니다. 근 막 아래가 위를 열어이 가상 공간 내에서 포켓을 만듭니다.</li>
		<li>단계 6.4.8에서에서 준비 캡슐화 대뇌 피 질의 조직의 원피스를 선택 하 고이 주머니에.</li>
		<li>6/0를 사용 하 여 근 막 봉합 꼰 흡수 봉합 사.</li>
	</ol>
</li>
	<li>또한 contralateral 측면 단계 7.16.1-7.16.3를 반복 합니다.</li>
	<li>간단한 중단된 바늘 4/0 monofilament 흡수 봉합 사를 사용 하 여 등 쪽 벽을 닫습니다.</li>
	<li>Lidocaine 주사 0.5% (1.2 mL/Kg) 절 개 사이트에 S/C.</li>
	<li>무 균 알코올 준비를 사용 하 여 피부를 청소.</li>
	<li>해제는 isoflurane 마우스의 온도 모니터링 하는 동안.</li>
	<li>O2, Isoflurane 없이 1-2 분을 제공 합니다. 그것은 이동 하 고 의식 돌아가기 시작 될 때까지 마우스를 온난화에 계속.</li>
	<li>깨끗 한 복구에 마우스를 놓고 수술 상처의 완전 한 치료까지 나중에 별도 마우스를 집.</li>
	<li>필요에 따라 모든 8-12 h 24 h postoperatively Buprenorphine (1 mg/Kg) S/C를 주입.</li>
	<li>실험의 끝 지점까지 모든 음식, 물, 침구, 및 감 금 소는 압력가 마로 소독, 쥐 별도 연습장에 계속. 가압 통풍이 방에 감 금 소를 유지. 개인 보호 장비를 사용 하 여 쥐를 처리 하는 때마다.</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.3322/caac.21387/full">Cancer Statistics, 2017.</a> CA Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).</li>
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<li>Kano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMH%2FMIS+as+a+contraceptive+that+protects+the+ovarian+reserve+during+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">AMH/MIS as a contraceptive that protects the ovarian reserve during chemotherapy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (9), E1688-E1697 (2017).</li>
</ol>

마이클 진 버그 Angiocrine 생물 과학, inc., 샌디에고, 캘리포니아 92130, 미국, 절연, E4-ORF-1 페와 우리가 사용 하는 내 피 세포를 표시 하는 직원입니다.

여기 우리 경영진의 그 공동 이식 보여 난소 조직 생존 능력 및 기능 마우스에이 종이 식 다음에 상당한 혜택을 제공 합니다. 난소 조직 자동-다 산 보존을 위한 이식의 임상 적용에 대 한 표준을 설정 하 고 최적의 매개 변수 (크기, 이식 사이트, 이식 등의 기간) 되지 않은 32 , 33 , 34 follicular 풀의 향상 된 복구에 대 한 정의 되지 않은 남아 있습니다. 자동 이식 때 해 동 외피 난소 조직의 avascular 접목 나머지 난소, 난소 포 등 광범위 한 인35,36골반 사이트에서 주로 수행 됩니다. 아무 엔드-투-엔드 문 합 일어나기 때문이 이식 방법은 허 혈 성 조직 손실의 물결과는 이식 내 거주 하는 모 낭의 조기 활...

개발된 된 세계에서 죽음의 주요 원인 가운데 암 남아 아직 수 십년 연구의 중요 한 진행 암, 그리고 일부의 경우 거의 두 배로 생존 율1에 대부분의 종류에 대 한 굴복 했다. 불행히도, 종종 화학요법 에이전트는 gonadotoxic, 원시 낭 난소에서의 파괴 및 불 임2감소. 그러나이 인구 증가 다 산 보존 oocyte 또는 배아 cryopreservation 등의 다양 한 방법에서 혜택을 받을 수,, 암 치료와 사전 pubertal 환자의 신속한 개시를 요구 하는 환자는 이러한 옵션에 적격이 지 않다. 대신, 일부 환자는 전과 그들의 치료 처방 사업 복구 및 면제, 자동 이식 조직 다 산3복원 시 난소 조직 cryopreserve 선택 했습니다. 그러나, 날짜, 이식 생존 및 follicular 출력 자동 이식 다음에 상대적으로 낮은4, 조직 허 혈과 저 산소 증5,,67때문에 주로 남아 있습니다. 난소의 피 질 이식의 생존 능력을 개선 하기 위해 수많은 노력에도 불구 하 고 안티 oxidants8,9, 프로-신생 cytokines10,,1112,1 사용 하 여 3또는 기계적인 조작14이식 허 혈 5-7 일 창 포스트 이식 가능성 및 이식7의 생존 저해. 이 해결 하기 위해 우리는 호스트와 이식 혈관의 문 합을 촉진 하기 위하여 따라서 난소 조직의 reperfusion 서두르는 셀 기반 전략을 개발 했다.
포스트 이식 창에서 이식할된 난소 조직에 허 혈 성 모욕 뿐만 아니라 간 follicular 신호 중단 풀15,16의 고갈에 기여할 수 있습니다. 외 인 내 피 세포 (임원)는 이식의 주변에 있는 혈관을 안정적이 고 기능에 기여, 때문에 그들은 이식된 조직에 정의 된 분자 입력을 전달 하는 독특한 기회를 제시. 원리의 증거로, 경영진 안티 Mullerian 호르몬 (AMH), 소 낭 모양 성장17제한 표시 되었습니다 변형 성장 인자 베타 (TGFβ) superfamily의 구성원의 익스프레스 슈퍼 생리 적 수준으로 설계 했다. 공동 제어와 AMH 표현 세포 이식 이식 follicular 분포의 비교는 생물 학적 활동 엔지니어링된 경영진의 힘을 확인 합니다.
요약 하자면, 이식 가능성 및 억제 조 동원 follicular 풀을 개선 하 여이 이렇게 자동 이식 환자 다 산 보존 난소 조직의 생산성을 증가할 수 있다. 또한, ExEC 기반 플랫폼 follicular 개발에 연루 되어 분자 레 귤 레이 터의 실험 심문 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>레보비츠' s L-15 배지</td><td>Gibco</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Anti-Anti X100</td></tr><tr><td>Sigma</td><td>S</td><td>1888</td><td></td></tr><tr><td>피브리노겐</td><td>Sigma</td><td>F 8630</td><td>소 혈장</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T 1063</td><td>인간 혈장</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D 2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>12491015</td><td></td></tr><tr><td>효소 세포 분리 매체</td><td>Invitrogen</td><td>00-4555-56</td><td>Accutase</td></tr><tr><td>플라스틱 파라핀 필름</td><td>Bemis NA</td><td></td><td>Parafilm M</td></tr><tr><td>수술 종이 테이프 2.5 cm</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td>Micropore</td></tr><tr><td>수술 종이 테이프 1.25 cm</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td>Micropore</td></tr><tr><td>천공 플라스틱 수술 테이프 1.25 cm</td><td>3M</td><td>1527-0</td><td>Transpore</td></tr><tr><td>모노필라멘트 흡수성 봉합</td>사 <td>Covidien</td><td>UM-203</td><td>Biosyn</td></tr><tr><td>꼰 흡수성 봉합사</td><td>Covidien</td><td>GL-889</td><td>Polysorb</td></tr><tr><td>포비돈-요오드 용액 USP 10%</td><td>Purdue Products</td><td>67618-153-01</td><td>Betadine 용액 면봉</td></tr><tr><td>Cryoviales</td><td>Nunc</td><td>377267</td><td>CryoTube</td></tr><tr><td>멸균 안구 윤활제</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td>Puralube</td></tr><tr><td>1.7 ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Denville</td><td>C-2172</td><td>Eppendorf</td></tr><tr><td>Anasthesia system</td><td>VetEquip</td><td>V-1 테이블 탑 시스템에</td> 내피 세포 제거 <td></td></tr><tr><td></td><td>Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA</td><td></td> 분리 <td>및 E4-ORF-1로 transfection되고 표지된 내피 세포</td></tr><tr><td>Trichrome stain</td><td>Sigma</td><td>HT15-1kt</td><td>Trichrome Stain (Masson) 키트</td></tr><tr><td>Isolectin</td><td>Invitrogen</td><td>I32450</td><td>isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor&trade; 647 Conjugate</td></tr></tbody></table>

공동 설계 된 내 피 세포와 인간 난소 조직 이식: 세포 기반 전략 결합 가속 직접 paracrine 배달 관류

Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery

불 임은 화학요법 또는 방사선 치료와 일부 환자에 대 한 빈번한 부작용, oocytes 또는 배아의 cryopreservation는 옵션이 아니다. 대신,이 환자의 증가 cryopreserve autograft 위한 난소 조직을 선택 하는 복구 및 면제. 개선 결과 자동-cryopreserved 난소 조직 이식 받은 환자 중에 불구 하 고 효율적인 revascularization 이식할 조직의 주요 장애물 남아 있습니다. 허 혈을 완화 하 고 따라서 자동 이식 환자에 있는 결과 개선, 우리 난소 조직 관류 가속을 위한 혈관 세포 기반 전략 개발. 마우스가 종이 식 모델에서 cryopreserved 난소 조직으로 외 인 내 피 세포 (경영진)의 공동 이식 하는 방법을 설명합니다. 우리는 지속적인된 paracrine 난소 이식에 대 한 입력 신호를 활성화 constitutively 안티 Mullerian 호르몬 (AMH)를 표현 하기 위해 설계 되었습니다 경영진을이 이렇게 확장. 그리고 임원으로 공동 이식 증가 follicular 볼륨과 향상 된 antral 여 포 개발, AMH 표현 임원 승진 무부하 원시 낭의 보존. 이 결합 된 전략 허 혈을 완화 및 다 산 보존 불 임 대형의 컨텍스트에서 follicular 활성화 변조에 대 한 유용한 도구 있을 수 있습니다.

경영진의 공동 이식 환자의 조직에 게 혜택 제공 여부를 확인 하려면 해 동된 난소 외피 스트립 동등한 크기의 조각으로 분할 되었고 양측 면역-손상, 끄 덕 scid 감마 (NSG), 쥐에 engrafted. 한쪽에 포함 된 섬유 소 혈전 혼자 (ECs) 그리고 다른 포함 임원 (그림 1a)와 각 마우스 자체 컨트롤을 역임 했습니다. 경영진은 인간의 탯 및 앞에서 설명한22,23으로 Adenoviral 유전자 조각 E4-ORF1 후속 치료에서 1 차 피 내 막의 절연을 통해 얻은 했다. 구절 2-5, 인간의 탯 줄 정 맥 ECs (hUVEC) 내에서 제정 식 cDNA adenoviral 유전자 조각 E4-ORF1 인코딩을 인코딩할 lentiviral 입자 치료 했다. 이 치료는 생존을 강화 하 고 신생 잠재력 end...

일부 환자에 대 한 다 산 보존에 대 한 유일한 옵션은 난소 직물의 cryopreservation. 불행히도, 지연된 revascularization follicular 생존을 위태롭게합니다. 여기, 우리는 공동 bioactive 분자의 직접 paracrine 배달 가속 결합 세포 기반 전략으로 활용 관류에 대 한 내 피 세포와 인간 난소 조직을 이식 하는 프로토콜을 제시.

공동 설계 된 내 피 세포와 인간 난소 조직 이식: 세포 기반 전략 결합 가속 직접 Paracrine 배달 관류

Infertility is a frequent side effect of chemotherapy and/or radiotherapy and for some patients, cryopreservation of oocytes or embryos is not an option. ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 재관류를 가속화하고 이식편 내 여포 활성화를 조절하는 부분비 자극을 제공하는 엔지니어링된 내피 세포와 함께 동결 보존된 인간 난소 조직을 이종 이식하는 것입니다. 이 방법은 동결 보존된 난소 조직의 이식 후 생존력을 향상시키는 세포 기반 수단을 제공하며, 보다 광범위하게는 인간 모낭 형성의 분자 조절을 조사하기 위한 강력한 모델 시스템을 구축합니다. 이 기술의 주요 장점은 내피 세포의 단일 매개체를 사용하여 허혈을 완화하고 조직을 생착시키기 위해 분비 인자의 지속적인 공급원을 제공한다는 것입니다.따라서 이 방법은 조직 생존력에 대한 전반적인 이점을 제공합니다. 또한 여포 발달과 관련된 분자 조절자에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 피브린 응고를 만들려면 신속하게 작업하고 360 마이크로 리터의 HEPES 완충액을 200 마이크로 리터의 피브리노겐 원액에 첨가하십시오.튜브를 얼음 위에 놓고 섞기 위해 부드럽게 피펫을 삐걱거립니다. 두 번째 마이크로분리 튜브에서 50마이크로리터의 트롬빈 원액에 148.7마이크로리터의 DMEM을 첨가하여 트롬빈 작업 용액을 준비합니다. 부드럽게 피펫으로 섞습니다.그런 다음 염화칼슘 1리터당 1몰 1.3마이크로리터를 추가합니다. 부드럽게 피펫으로 샘플을 혼합하고 얼음 위에 보관하십시오. 효소 세포 분리 배지인 Accutase를 사용하여 이전에 준비된 엔지니어링된 내피 세포를 플레이트에서 분리하고 세 번째 마이크로분리 튜브로 옮깁니다.그런 다음 셀을 스핀다운합니다. 다음으로, 혈구계와 덮인 유리를 사용하여 세포를 계수합니다. 생착을 위해 필요로 한 세포의 수를 산출하기 위하여는, 차원을 측정하기 위하여 통치자를 사용해서 제곱된 밀리미터로 난소 조직의 20, 000배 지역을 개조하십시오.생착에 필요한 세포의 수를 결정하기 위해 면적에 20, 000을 곱하십시오. 필요한 셀을 스핀다운합니다. 그리고 DMEM을 사용하여 총 부피 16.8 마이크로 리터의 펠릿을 다시 현탁시킵니다.세포 현탁액을 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 멸균 거즈 스펀지에 난소 조직 조각을 몇 초 동안 올려 놓고 건조시킵니다. 그런 다음 조직을 50mm 페트리 접시에 담긴 미리 준비된 플라스틱 파라핀 필름에 옮깁니다.39.2마이크로리터의 피브리노겐 용액을 준비된 세포 현탁액에 추가합니다. 부드러운 피펫팅으로 혼합하고 현탁액을 얼음 위에 두십시오. 그런 다음 빠르게 작업하여 14 마이크로 리터의 트롬빈 용액을 튜브에 넣고 부드럽게 한 번 피펫하여 혼합합니다.혼합물을 길쭉한 물방울 모양으로 난소 조직 위에 피펫팅합니다. 응고가 있는 페트리 접시를 섭씨 37도에서 배양합니다. 피브리노겐 세포 현탁액에 트롬빈 용액을 첨가한 후에는 신속하게 작업하십시오.수술 시 향후 준비 과정을 동기화하는 것은 어려운 일이며, 귀중한 인체 조직을 사용하기 전에 연습을 수행하는 것이 현명할 수 있습니다. 생후 10주에서 14주 된 암컷 NSG 마우스를 마취하고 텍스트 프로토콜에 따라 수술을 준비한 후 동물을 가열하고 절차 전반에 걸쳐 체온을 모니터링합니다. 포비돈 요오드 면봉으로 다듬어진 부분을 닦은 다음 멸균 알코올로 닦아냅니다.다음으로, 멸균 안구 윤활제 수의사 연고 한 방울을 마우스의 각 눈에 바르면 탈수와 각막 손상으로부터 보호할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 양측 난소 절제술을 시행한 후 부프레노르핀을 피하 주사합니다. 그런 다음 대둔근 위의 근막을 혈전 치수에 맞는 길이로 수평 절개를 만듭니다.이 가상 공간 내에서 근막 아래에 있는 가위를 열어 주머니를 만듭니다. 미리 준비된 캡슐화된 피질 조직 한 조각을 집어 주머니에 넣습니다. 그런 다음 6개의 O 꼰 흡수성 봉합사를 사용하여 근막을 봉합한 후 반대쪽 측면에서 공동 이식을 반복합니다.간단한 단속 스티치로 4개의 O 모노필라멘트 흡수성 봉합사로 등벽을 닫습니다. 절개 부위에 리도카인을 피하 주사합니다. 그런 다음 멸균 알코올 제제를 사용하여 피부를 청소하고 텍스트 프로토콜에 따라 수술 후 관리를 수행합니다.여기에서 볼 수 있듯이, E4-ORF1 처리된 인간 제대 정맥 내피 세포를 NSG 암컷 마우스에 양측 생착 2주 후, 숙주 조직과 이식편의 경계면에서 GFP 표지된 외인성 EC 또는 ExEC로 형성된 기능적으로 관류된 혈관. ExEC는 마우스 또는 인간 ExEC와 함께 이식된 피질 조각에서 난소 조직과 함께 이식될 때 형성된 기능적 혈관을 형성하여 대조군 이식편에 비해 살아남은 난포의 수를 증가시킵니다. 이러한 난포 발달의 증가는 ExEC 보조 이식편에서 섬유화 부위 감소와 관련이 있었습니다.최종 섬유화 부위 값은 분석된 세 절편의 평균으로 각 이식편에 대해 계산되었습니다. 중요한 것은 인간 포피 섬유아세포와 함께 이식된 이식편은 조직 생존력이 낮고 난포가 상대적으로 적었다는 것입니다. 생착 14주 후, 생쥐에게 감분분호르몬을 자극하였다.그리고 MRI를 통해 난포 성장의 진행을 모니터링했습니다. 난포 발달은 대조군과 ExEC 보조 이식편 모두에서 관찰되었습니다. 그러나, 점점 더 큰 크기의 난포가 ExEC 보조 이식편에서 발견되었습니다.동일한 환자의 조직에서 유래한 전방 여포와 비교했을 때, 더 진행된 여포의 과립층 세포층은 배란 마커 CD44 및 HABP1의 발현이 증가했을 뿐만 아니라 세포 사멸이 증가하고 증식이 감소하는 것으로 나타났습니다. 이 동영상을 시청하면 섬유소 응고에서 동결 보존된 난소 조직과 내피 세포를 함께 이식하는 방법을 이해하게 될 것입니다. 그리고 일단 마스터하면 1시간 이내에 이 프로토콜을 완료할 수 있습니다.이 접근 방식을 기반으로 내피 세포는 분비 인자의 모든 조합을 발현하도록 설계할 수 있으며, 이를 통해 가임력 보존, 모낭 형성 및/또는 조직 이식과 관련이 있을 수 있는 신호 전달 경로를 조사할 수 있습니다.

co-transplantation-human-ovarian-tissue-with-engineered-endothelial

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

혈액 - 문의 autologous 세포 및 시험 biocompatibility과 biomaterials 것은 시딩의 티타늄에 대한 방법을 설명합니다. 이 방법은 돼지의 venae cavae에 주입 수술의 분 이내에 씨앗 내피 전구 세포와 티타늄 튜브를 사용합니다. 이 기술은 다른 많은 implantable 생명 의학 장치에 적용할 수 있습니다.

Autologous 내피 전구 세포 - 심는 기술 및 대형 동물 모델에서 순환기 장치에 대한 Biocompatibility 테스트

여기, 우리는 두 번 시드를 부분적으로 유도 만능 줄기 세포로 쥐에 이식을위한 기능적인 조직 설계 혈관 이식을 생성하는 프로토콜을 제시 (PiPSC은) - 탈세 포화 선박 발판 생물 반응기에서 유래 내피 세포 - 평활근 세포 및 PiPSC 산출했다.

마우스 모델에서 조직 공학 혈관의 생성 및 손톱 확장

이 프로토콜은 소량의 성인 말초 혈액에서 혈액 성장 내피 세포(BOEC)를 안정적으로 생성하고 특성화할 수 있도록 합니다. BOEC는 혈관 질환 환자의 내피 세포의 대리 및 유도 만능 줄기 세포 생성을 위한 기질로 사용할 수 있습니다.

사람 말초 혈액에서 생성 및 문화 혈액의 파생물 내피 세포

우리는 여성의 생식 기관의 정상 및 형질 전환 상피의 연구에 적합한 난소 유행 패드 이식 분석에 대해 설명합니다. 마우스 지방 패드는 큰 조직 조각의 이식을 허용 수술과 이미징을위한 쉽게 접근 할 수 있으며, 뮐러 기원의 조직에 가장 유리한 기본 환경을 제공합니다.

마우스 난소 지방 패드 속으로 이식

이 방법은 표준화된 미세 유체 플랫폼에서 40개의 교류 3D 마이크로혈관으로서 iPSC 유래 내피 세포의 배양을 기술한다. 이 플랫폼은 확장 가능하고 처리량이 높은 방식으로 혈관 신생 콩나물의 해부학 및 안정화를 포함하여 3D로 그라데이션 구동 혈관 신생 발아를 연구 할 수 있습니다.

iPSC 유래 내피 세포의 퍼퓨비드 3D 혈관신생 발아연구를 위한 표준화 및 확장 성 분석

난소암 줄기세포(OCSC)는 암 시작, 재발, 치료 내성 및 전이를 담당합니다. OCSC 혈관 틈새는 OCSC의 자가 재생을 촉진하여 화학 내성을 유발하는 것으로 간주됩니다. 이 프로토콜은 시험관 내에서 재현 가능한 OCSC 혈관 틈새 모델을 구축하기 위한 기초를 제공합니다.

3차원 공동배양시스템을 이용한 난소암 줄기유사세포의 혈관신생적 특성 평가 NICO-1

우리는 돼지 이종성 심장 이식 모델에서 전체 심장 동종이식편에 치료제를 전달하기 위한 규범발열 ex vivo sanguinous perfusion system을 활용하기 위한 프로토콜을 제시한다.

심장 동종이식편에 치료제를 전달하기 위한 돼지 이질성 심장 이식 프로토콜

여기에서는 인간 난소 조직을 위한 병아리 융모막 이식(CAM) 이종 이식 모델을 개발하기 위한 프로토콜을 설명하고 기술의 효과, 이식편 혈관 재생술 기간 및 6일 이식 기간 동안 조직 생존력을 입증합니다.

난소 조직 이식을 연구하기 위한 도구로서의 병아리 맥락막 막(CAM) 모델

이 프로토콜은 일차 인간 난소 표면 상피(hOSE) 세포에서 3차원(3D) 조직 오가노이드를 확립하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에는 갓 채취한 난소에서 hOSE 분리, hOSE의 세포 확장, 동결 보존-해동 절차 및 오가노이드 유도가 포함됩니다. 면역형광(Immunofluorescence), 정량 분석(quantitative analysis) 및 스크리닝 플랫폼으로서의 유용성 입증(showcasing utility as a screening platform)이 포함되어 있습니다.

조직 재생을 연구하기 위한 플랫폼으로서의 인간 난소 표면 상피 오가노이드

이 논문은 탈세포화(decellularization) 및 재세포화(recellularization) 방법을 사용하여 생체공학적 마우스 폐를 만드는 방법을 설명합니다. 또한 후속 정소성 폐 이식에 대해서도 자세히 설명합니다.

탈세포화된 마우스 폐와 1차 인간 내피 세포를 이용한 생체공학적 폐 이식

여기에서는 커프 기법을 사용하여 조직 공학 혈관 이식편을 마우스 경동맥에 이식하기 위한 프로토콜을 제시하여 혈관 조직 재생 메커니즘을 조사하는 데 적합한 동물 모델을 제공합니다.

커프 기법을 통한 마우스 경동맥에 조직 공학 혈관 이식편 이식

학습하세요 냉동 보존 인간 난소 조직과 공동 설계된 내피 세포를 이식하여 관류를 가속화하고 난포 활성화를 촉진하는 방법을. 이 기술은 조직 생존율을 높이고 난포 발생의 분자 조절 메커니즘을 연구하는 강력한 모델을 제공합니다.

공동 설계 된 내 피 세포와 인간 난소 조직 이식: 세포 기반 전략 결합 가속 직접 Paracrine 배달 관류

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