Name: 성인 골 수 유래 조 혈 줄기 세포로 세포 공학 자기 대상으로 함께 있도록 예측에 관한 전송을 위한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 학습하세요 비바이럴 자기 폴리플렉스 기반 전송법을 이용한 CD133+ 조혈 줄기 세포의 안전하고 효율적인 유전자 변형 방법을. 이 기술은 세포 특성을 유지하면서 재생의학 적용 및 자기공명영상 모니터링이 가능합니다.

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이 작품은 연방 교육부 및 연구 (FKZ 0312138A 및 FKZ 316159), EU 구조 기금 (ESF/IVWM-B34-0030/10와 ESF/IVBM-B35-0010/12), 주 Mecklenburg 서쪽 Pomerania 독일과 DFG (DA1296/2-1)에 의해 지원 되었다는 독일 심장 재단 (F/01/12), BMBF (VIP + 00240) 고 젖은 기초. 또한, F.H. 및 오후는 FORUN 프로그램의로 스톡 대학 의료 센터 (889001)에 의해 지원 됩니다.

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

최근 몇 년 동안, CD133+ SCs 등장 유망한 세포 인구로 SC 기반 요법으로 입증 단계 I, II, 및 III에 대 한 임상 시험43,44,,4546, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , <sup c...

CD133+ 이종 줄기 재생 의학에 대 한 잠재력 약속 된 조상 세포 인구를 대표 하는 SCs. 그들의 조 혈, 내 피, 및 조직적 분화 잠재적인1,2,3 수는 CD133+ 세포, 예를 들어, 차별화를 통해 neovascularization 프로세스에 기여 하 으로 새로 형성 선박 및 프로-신생 paracrine 메커니즘4,5,,67에 의해 신호의 활성화.
30 개 이상의 승인 된 임상 시험 (ClinicalTrails.gov)에서 그들의 높은 잠재력에도 불구 하 고 그들의 치료 결과 중인 여전히 논쟁 적인 토론4. 실제로, SCs의 임상 응용 프로그램 낮은 보존 관심과 대규모 초기 세포 죽음5,,89의 기관에 의해 방해 된다. 추가 CD133의 엔지니어링+ SCs 사전 이식 이러한 난제를 극복 도움이 될.
효율적인 세포 치료에 대 한 전제 조건 치료 관련 셀10engraftment를 향상 시키기 위해 대규모 초기 세포 죽음의 감소 될 것 이다. 현재 연구 시연 첫 1-2 h, 이식된 세포 유형의 독립적인 동안 매우 끼얹는다 뇌와 심장 등 장기에 90-99%의 엄청난 셀 손실 또는 응용 프로그램 경로11,12,13 14,15,16,17,18,19,,2021. 관심22,23,,2425,26의 사이트에 대상 셀에 혁신적인 비-침략 적 전략을 가능 하 게 SC 마그네틱 나노 (MNPs)를 사용 하 여 라벨 고 동시에 셀 MRI27 (MPI) 이미징 자성 입자를 사용 하 여 모니터링 하는 것을 허용 한다. 가장 효율적인 vivo에서 정 맥 주입23,,2428 후 셀 지도 보다 로컬 관리 후 사용한 셀 보존 대상 적용 자성된 셀 연구 . 따라서, 우리의 그룹 superparamagnetic 산화 철 나노 입자29의 구성 된 배달 시스템을 설계. 이 기술로, CD133+ SCs와 인간 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs)는 대상 효율적으로 수, 여 체 외에 시도30,31.
사우스 캐롤라이나 요법에 대 한 또 다른 장애물 초기 세포 죽음32에 기여 하는 이식 후 영향을 받는 조직의 적대적인 염증 성 환경입니다. 여러 사전 컨디셔닝 연구 뿐만 아니라 치료 관련 미르의 응용 프로그램은 테스트33; 그것은 성공적으로 입증 되었습니다 안티 apoptotic 미르 생체 외에서 apoptosis를 억제 고 vivo에서세포 engraftment33을 강화. 이 작은 분자, 20-25의 뉴클레오티드로 구성 메신저 RNAs (mRNAs)의 posttranscriptional 변조기로 서 중요 한 역할을 하 고 따라서 줄기 세포 운명과 행동34를 영향을. 또한, 미르 세 도입 호스트 게놈34에 원치 않는 안정적인 통합을 하지 마십시오.
기본 SCs에 핵 산 (NAs)의 효율적인 도입에 대 한 현재 시도 주로 재조합 바이러스8,35기반으로 합니다. 높은 transfection 효율에도 불구 하 고 재조합 바이러스 조작은 벤치를 머리 맡 번역, 예를 들면, 통제 유전자 발현, pathogenicity, immunogenicity, 및 insertional mutagenesis35에 대 한 주요 장애물이 선물 ,36. 따라서, 폴리머 기반 구조 등 비 바이러스 성 전달 시스템 개발에 중요 하다. 그 중에서 polyethylenimine (페이) 저하, 세포질 통풍 관에서에서 보호 하기 위해 나 결로 등 미르에 대 한 혜택을 제공 하는 유효한 배달 차량 나타내고 endosomal 통해 세포내 릴리스 탈출37,38. 또한, 미르-페이 단지 임상 시험39높은 생체 적합성을 설명 했다. 따라서, 우리의 배달 시스템은 biotinylated의 구성 분기 25 kDa 페이는 streptavidin 입히는 MNP 코어30,,3140에 바인딩된.
이 원고에서는 CD133의 (i)는 수동 격리를 설명 하는 포괄적인 프로토콜 소개+ 사우스 캐롤라이나 사우스 캐롤라이나 제품과의 효율적이 고 부드러운 transfection 전략 (ii)의 상세한 묘사와 인간의 골 수 (BM) 기부에서 한 자석으로 비 바이러스 성 고분자 기반 배달 시스템 CD133의 유전 공학에 대 한+ SCs 미르를 사용 하 여. CD133+ SCs 격리 되며 표면 항 체 기반 자기 활성화 셀 정렬 (맥) 시스템을 사용 하 여 인간의 sternal BM aspirates에서 자석으로 농축. 이후에, 세포 생존 능력 뿐만 아니라 셀 순도 cytometry 사용 하 여 분석 된다. 그 후, 미르/PEI/MNP 단지 준비가 CD133+ SCs는 페. transfection 후 18 h, 통풍 관 효율성과 transfection SC 마커 표현과 세포 생존 능력에의 영향 분석 된다. 또한, transfection 복잡 한 화합물의 세포내 분포의 평가 4 색 레이블 및 구조화 조명 현미경 (SIM)를 사용 하 여 수행 됩니다.

<table><tbody><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7060</td><td>3%</td></tr><tr><td>anti-CD133/2-PE (클론: 293C3)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-853</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34-FITC (클론: AC136)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-081-001</td><td></td></tr><tr><td>안티-CD45-APC-H7 (클론: 2D1)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>560178</tr><tr><td>로다 민 염료; 비오틴에 접합된 Atto 565 염료</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-71</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS LSRII 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>CD133 항체 결합 초상자성 철 덱스트란 입자; CD133 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-049</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 B</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>계수 챔버</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>시아닌 3 염료 표지 전구체 miR; Cy3 염료 표지 Pre-miR 음성 대조군 #1</td><td>Ambion</td><td>AM17120</td><td></td></tr><tr><td>시아닌 5 염료 miR 라벨링 키트; Cy5 염료 라벨 IT miRNA 라벨링 키트</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 9650</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>10104159001</td><td>(100 U/mL)</td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 LSM 780 컨포칼 현미경</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FcR 차단 시약, human</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>밝은 녹색 단백질 라벨링 키트; Oregon Green 488 단백질 라벨링 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O10241</td><td></td></tr><tr><td>수성 장착 매체; Fluoroshield</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>밀도 구배 원심분리 튜브; Leukosep 원심분리기 튜브</td><td>Greiner Bio-One</td><td>89048-932</td><td></td></tr><tr><td>MACS 자석 홀더; MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS 사전 분리 필터</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-041-407</td><td>30 &micro; m</td></tr><tr><td>MACS 분리 칼럼 (MS / LS)</td> <td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-201 / 130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS 영구 자석; MACS 분리기</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV PVDF 필터</td><td>Merck</td><td>SLHV013SL</td><td>0.45 &mu; m</td></tr><tr><td>마우스 IgG 2b-PE</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-215</td><td></td></tr><tr><td>아민 반응성 염료; Near-IR LIVE/DEAD 고정성 사세포 염색 키트</td><td>: Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>인간 림프구 분리 배지; Pancoll</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-60500</td><td>밀도: 1.077 g/mL</td></tr><tr><td></td><td>PBS Pan Biotech GmbH</td><td>P04-53500</td><td>Ca 및 Mg</td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>408727</td><td>분지; 25 kDa</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 U/mL, 100 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Merck Schuchardt OHG</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>비표지 전구체 miR; Pre-miR miRNA 전구체 음성 대조군 #1</td><td>Ambion</td><td>AM17110</td><td></td></tr><tr><td>RBC 용해 완충액</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RNAse 오염 제거 용액; RNaseZap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>인간 림프구 배지; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-16500</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 사이토카인 보충제; StemSpan CC100</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2690</td><td></td></tr><tr><td>무혈청 조혈 세포 확장 배지; StemSpan H3000</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9800</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin MagneSphere 상자성 입자</td><td>Promega Corporation</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>T8154</td><td>0.4 %</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>0.5 M; pH 8.0</td></tr><tr><td>ZEN2011 소프트웨어</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 분광 광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonorex RK 100 SH 초음파 처리 수조</td><td>Bandelin 전자</td><td></td><td>초음파 공칭 출력: 80W; 초음파 주파수 : 35kHz</td></tr></tbody></table>

성인 골 수 유래 조 혈 줄기 세포로 세포 공학 자기 대상으로 함께 있도록 예측에 관한 전송을 위한 프로토콜

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

동안 CD133+ 조 혈 줄기 세포 (SCs) 재생 의학 분야에서 높은 잠재력을 제공 하기 위해 입증 되었습니다, 그들의 낮은 유지 비율 관찰된 대규모 세포 사망률 부상된 조직에 주입 후 매우 제한 된 치료 효과입니다. 이러한 한계를 극복 하기 위해 우리가 그들의 관리에 앞서 적당 한 셀 엔지니어링에 대 한 비 바이러스 성 기반된 프로토콜을 확립 하고자 했다. 인간의 CD133 수정+ 셀의 대상 잠재력 뿐만 아니라 통풍 관 효율 및 안전에 관하여 해결 SCs 예측에 관한 (미르) 로드 자석 polyplexes를 사용 하 여 표현. 우리의 프로토콜에 의존, 우리는 CD133 동안 80-90%의 높은 미르 통풍 관 비율을 달성할 수 있는+ 줄기 세포 속성을 받지 않습니다. 또한,이 수정 된 세포는 자기 대상의 옵션을 제공합니다. 우리 여기 CD133의 수정에 대 한 안전 하 고 매우 효율적인 절차 설명+ SCs. 우리는 줄기 세포 치료 효과의 최적화에 대 한 자기 공명 영상 (MRI)을 통해 관리 셀 제품의 모니터링을 위한 표준 기술 제공이 접근을 기대 합니다.

수동 격리와 인간의 BM 파생 CD133의 자석 농축 제시 프로토콜 설명+ SCs 후속 바이러스 독립 셀에 체 외에서 세포 조작 및 에 대 한 비-침략 적 기술 전략, 엔지니어링 vivo 모니터링 도구.
이 3 단계 절연 기술 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 통해 미리 소화 sternal BM에서 MNCs의 분리를 허용합니다. 이후에, CD133+ 적절 한 격리 기술을 사용 하 여 셀 분수를 자석으로 농축 될 수 있다. 이로써 CD133의 농축+ SCs cytometry (그림 1)에 의해 결정 될 수 있는 80% 이상의 높은 순도와 생존 능력. 이 하,만 SC 제품 요구 사항을 일치 하는 추가 실험을 위해 사용 되었다....

이 프로토콜에서는 안전 하 고 효율적인 절차 CD133 수정+ 조 혈 줄기 세포. 제시 비 바이러스 성, 자기 polyplex 기반 접근 자기 공명 화상 진 찰을 통해 관리 셀 제품 모니터링에 관해서는 뿐만 아니라 치료 줄기 세포 효과의 최적화를 위한 기반을 제공할 수 있습니다.

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

당사의 프로토콜은 세포가 유익한 특성을 위해 개선될 수 있는지, 관심 부위를 표적으로 삼을 수 있는지 여부와 같은 재생 의학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 당사 프로토콜의 주요 장점은 당사의 비바이러스 형질주입 방법을 사용하여 세포를 일시적으로 유전적으로 조작할 수 있어 세포의 특성을 유지할 수 있다는 사실입니다. Sauter의 방법은 중간엽 줄기 세포와 같은 이식에 사용되는 다른 세포 유형에 적용할 수 있는 조혈 줄기 세포의 변형에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.프로토콜을 시작하려면 인간 림프구 배지를 실온으로 예열하고 콜라겐분해효소 B 및 DNase를 해동합니다. 골수(BM)를 50ml 원뿔형 튜브에 모읍니다. 기존 혈전을 모두 버립니다.후속 유세포 분석을 위해 200마이크로리터의 BM 샘플을 채취합니다. 필요할 때까지 샘플을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 다음으로, 10ml의 BM을 새로운 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 PBS EDTA 6ml, 인간 림프구 배지 20ml, 콜라겐분해효소 B 175마이크로리터 및 DNase 175마이크로리터를 추가합니다.용액을 부드럽게 섞고 셰이커에서 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배지를 분리하는 15ml의 인간 림프구 분리 매체를 50ml 튜브에 도포하여 50ml 밀도 구배 원심분리 튜브를 프라이밍하고 30초 동안 1, 000배 G로 원심분리합니다. 밀도 구배 원심분리 튜브 필터 위에 35ml의 희석된 BM을 조심스럽게 겹겹이 쌓고 튜브를 445배 G로 35분 동안 원심분리합니다.흔들지 않고 원심분리기에서 튜브를 부드럽게 제거합니다. 필터 상단의 탁한 층을 직접 건드리지 않고 상단 투명 용액에서 최대 20ml를 조심스럽게 버리십시오. 단핵 전지 또는 MNC를 포함하는 흐린 층을 새로운 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 조심스럽게 옮기고 PBS EDTA로 최종 부피 50 밀리리터까지 채웁니다.50 밀리리터 전지 현탁액 10 마이크로리터를 1.5 밀리리터 튜브로 옮겨 다국적 기업을 계수합니다. 메틸렌 블루와 함께 10 마이크로 리터의 3 % 아세트산을 첨가하십시오. 내용물을 부드럽게 섞고 10마이크로리터를 계수실에 넣습니다.MNC의 수를 계산합니다.MNC 현탁액을 300배 G에서 10분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오.총 셀 수의 10 배에서 8 배에 대한 자기 선택을 준비하려면 300 마이크로 리터의 MACS 버퍼에 MNC를 조심스럽게 다시 현탁시킵니다.

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Research

연구

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Bioengineering

생명공학

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

표적 세포 전달은 다양한 생체 의학 응용 분야에서 유용합니다.  이 프로토콜의 목표는 초상자성 산화철 나노입자(SPION)를 사용하여 세포를 라벨링함으로써 세포 전달 및 국소화를 높은 수준으로 제어할 수 있는 자기 세포 표적화 접근 방식을 가능하게 하는 것입니다.

셀 라벨 및 초상 자성 산화철 나노 입자로 타겟팅

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연골 재생을위한 3D 자기 줄기 세포 집계 및 생물 반응기 성숙

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이 프로토콜 인간의 치과 여 포에서 추출한 치아 줄기 세포의 변이 유전 공학에 설명 합니다. 적용된 비 바이러스 성 수정 전략 치료 줄기 세포 제품의 개선 위한 기초 될 수 있습니다.

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