성인 골 수 유래 조 혈 줄기 세포로 세포 공학 자기 대상으로 함께 있도록 예측에 관한 전송을 위한 프로토콜

당사의 프로토콜은 세포가 유익한 특성을 위해 개선될 수 있는지, 관심 부위를 표적으로 삼을 수 있는지 여부와 같은 재생 의학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 당사 프로토콜의 주요 장점은 당사의 비바이러스 형질주입 방법을 사용하여 세포를 일시적으로 유전적으로 조작할 수 있어 세포의 특성을 유지할 수 있다는 사실입니다. Sauter의 방법은 중간엽 줄기 세포와 같은 이식에 사용되는 다른 세포 유형에 적용할 수 있는 조혈 줄기 세포의 변형에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

프로토콜을 시작하려면 인간 림프구 배지를 실온으로 예열하고 콜라겐분해효소 B 및 DNase를 해동합니다. 골수(BM)를 50ml 원뿔형 튜브에 모읍니다. 기존 혈전을 모두 버립니다.

후속 유세포 분석을 위해 200마이크로리터의 BM 샘플을 채취합니다. 필요할 때까지 샘플을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 다음으로, 10ml의 BM을 새로운 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 PBS EDTA 6ml, 인간 림프구 배지 20ml, 콜라겐분해효소 B 175마이크로리터 및 DNase 175마이크로리터를 추가합니다.

용액을 부드럽게 섞고 셰이커에서 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배지를 분리하는 15ml의 인간 림프구 분리 매체를 50ml 튜브에 도포하여 50ml 밀도 구배 원심분리 튜브를 프라이밍하고 30초 동안 1, 000배 G로 원심분리합니다. 밀도 구배 원심분리 튜브 필터 위에 35ml의 희석된 BM을 조심스럽게 겹겹이 쌓고 튜브를 445배 G로 35분 동안 원심분리합니다.

흔들지 않고 원심분리기에서 튜브를 부드럽게 제거합니다. 필터 상단의 탁한 층을 직접 건드리지 않고 상단 투명 용액에서 최대 20ml를 조심스럽게 버리십시오. 단핵 전지 또는 MNC를 포함하는 흐린 층을 새로운 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 조심스럽게 옮기고 PBS EDTA로 최종 부피 50 밀리리터까지 채웁니다.

50 밀리리터 전지 현탁액 10 마이크로리터를 1.5 밀리리터 튜브로 옮겨 다국적 기업을 계수합니다. 메틸렌 블루와 함께 10 마이크로 리터의 3 % 아세트산을 첨가하십시오. 내용물을 부드럽게 섞고 10마이크로리터를 계수실에 넣습니다.

MNC의 수를 계산합니다.MNC 현탁액을 300배 G에서 10분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오.

총 셀 수의 10 배에서 8 배에 대한 자기 선택을 준비하려면 300 마이크로 리터의 MACS 버퍼에 MNC를 조심스럽게 다시 현탁시킵니다. 100마이크로리터의 FCR 차단 시약과 100마이크로리터의 CD133 항체 결합 초상자성 철 덱스트란 입자를 추가합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다.

배양 중 세포 현탁액을 두세 번 부드럽게 흔듭니다. 배양 후 10개 세포 1개당 2ml의 MACS 완충액을 추가합니다. 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 혼합물을 섭씨 4도에서 10분 동안 300배 G로 원심분리합니다.

MACS 자석 홀더를 설정하고 MACS 영구 자석을 부착합니다. MACS 컬럼을 설치하고 그 위에 사전 분리 필터를 적용합니다. 첫 번째 MACS 열과 분리 전 필터를 MACS 버퍼로 평형을 이룹니다.

상등액을 버리고 펠릿을 500마이크로리터의 MACS 완충액에 다시 현탁시킵니다. 세포 현탁액을 사전 분리 필터에 적용합니다. MACS 컬럼과 사전 분리 필터를 세 번 세척하고 사전 분리 필터를 폐기합니다.

세포 분획을 두 번째 MACS 컬럼으로 직접 용리합니다. 즉시 첫 번째 MACS 열을 두 번째 MACS 열 위로 옮기고 제공된 플런저를 사용하여 MACS 열을 통해 세포 현탁액을 밀어 넣습니다. MACS 버퍼로 MACS 컬럼을 3회 세척합니다.

두 번째 MACS 컬럼에 MACS 버퍼를 추가하고 MACS 영구 자석에서 MACS 컬럼을 제거하여 컬럼에서 세포 분율을 용리합니다. 즉시 두 번째 MACS 컬럼을 튜브 위로 옮기고 MACS 컬럼을 통해 세포 용액 현탁액을 밀어 넣습니다. 튜브를 원심분리기합니다.

상등액을 조심스럽게 버리고 펠릿을 100마이크로리터의 MACS 완충액에 다시 현탁시킵니다. 후속 유세포 분석을 위해 네 번째 세포에 1 곱하기 10의 샘플을 채취합니다. 배양 배지에 남아 있는 세포를 다시 현탁시키고 형질주입을 위해 24웰 플레이트에서 10 - 4번째 세포를 5회 파종합니다.

섭씨 37도, 5%CO2 및 20%O2에서 세포를 배양합니다. 분석을 위해 10마이크로리터 샘플 BM 부분 표본 2개와 새로 분리된 CD133 양성 SC 샘플 1개를 사용합니다. 세포를 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

10마이크로리터의 FcR 차단 시약을 추가하고 33마이크로리터 부피에 MACS 버퍼로 튜브를 채웁니다. 튜브 안쪽에 항체를 추가합니다. 모든 항체가 첨가된 후 튜브의 항체 쪽을 흔듭니다.

최종 부피가 50마이크로리터인 용액을 부드럽게 혼합하고 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다. 1mL의 X 적혈구 또는 RBC 용해 완충액을 추가합니다. 현탁액을 부드럽게 혼합하고 용액을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.

그런 다음 서스펜션을 원심 분리합니다. 상등액을 버리고 얻어진 펠렛을 100마이크로리터의 PBS에 다시 현탁시킵니다. 유세포 분석을 통한 세포의 순도와 생존율을 평가합니다.

24웰 플레이트의 웰당 20피코몰의 MIR을 사용합니다. 5% 포도당 용액의 MIR을 마이크로리터당 0.25%피코몰 MIR의 최종 농도로 희석합니다. PEI를 동일한 양의 5% 포도당 용액에 희석합니다.

다음으로, 미리 희석된 PEI를 미리 묽은 MIR에 넣고 30초 동안 와류를 일으킵니다. MIR PEI 복합체를 실온에서 30분 동안 배양하는 동안 실온의 초음파 수조에서 35킬로헤르츠에서 20분 동안 자성 나노 입자 또는 MNP를 초음파 처리합니다. 입자가 현탁액에 있고 응집되지 않는지 확인합니다.

초음파 처리된 MNP를 MIR PEI 복합체에 추가하고 30초 동안 용액을 와류로 회전시킵니다. MIR PEI MNP 복합체를 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양 배지에서 갓 분리된 CD133 양성 SC를 함유한 적절한 웰에 MIRNA PEI MNP 복합체를 직접 적가합니다.

접시를 앞뒤로 흔들어 부드럽게 섞습니다. 세포를 배양합니다. transfection 18시간 후 각 웰의 내용물을 별도의 1.5ml 튜브에 수집합니다.

500마이크로리터의 PBS로 각 웰을 한 번 세척하고 이 세포 현탁액을 동일한 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 10분 동안 300배 G로 세포를 원심분리합니다. 스핀 후 상등액을 버리고 펠릿을 100마이크로리터의 MACS 완충액에 다시 현탁시킵니다.

0.5마이크로리터의 아민 반응성 염료를 첨가하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별합니다. 현탁액을 부드럽게 혼합하고 섭씨 4도에서 10분 동안 세포를 배양합니다. PBS 1ml를 첨가하고 세포를 섭씨 4도에서 10분 동안 300배 G로 다시 원심분리합니다.

상등액을 버리고 얻어진 펠릿을 PBS 100마이크로리터에 다시 현탁시키고 4%PFA 33마이크로리터를 첨가하고 격렬하게 혼합합니다. 유세포 분석을 통한 MIR 흡수 효율 및 transfection 매개 세포 독성을 평가합니다. 프로토콜에 설명된 방법에 따라, 유세포 분석은 자기적으로 농축된 CD133 양성 세포 분획이 80% 이상의 생존율과 순도를 산출하는 것으로 확인되었습니다.여기에 설명된 transfection 방법은 이러한 새로 분리된 human CD133 positive SCs에 MIR을 매우 효과적으로 도입할 수 있습니다.

생존 가능한 세포의 약 80%의 흡수 효율. 또한, 대조 세포에 비해 transfection 후 18시간 동안 뚜렷한 유의미한 세포독성 효과는 없습니다. 더욱이, 형질주입 복합 화합물의 충분한 전달과 일반적인 분포는 구조화 조명 현미경 또는 SIM을 사용하여 세포의 세포질 내에서 관찰할 수 있습니다.

이 절차에 따라 변형 줄기 세포의 생체 내 적용과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이를 통해 동적 조건에서 실제 생존과 영향을 조사할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 고분자 및 자성 나노입자 기반 transfection을 적용하여 microRNA를 갓 조혈 줄기세포에 효율적으로 도입하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.