마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성
2018년 9월 5일
다양 한 질병의 표시 더 순수 관련 모델 개발 및 구현에 약물 발견 프로그램 되. 여기에 설명 된 새로운 모델 시스템 spheroids를 경작 하 고 종양학 신약에 대 한 검색 하는 높은 처리량 1536-잘 접시 기반 시스템에서 상영 될 수 방법을 3 차원 종양을 보여 줍니다.
이 방법은 신약 개발 분야의 주요 질문(예: hit to lead 식별에 가장 관련성이 높은 조직 배양 설정이 무엇인지)에 대한 답변에 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 1536개의 웰 플레이트를 사용하여 높은 처리량 방식으로 3차원으로 세포를 배양할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜을 시연하는 사람은 제 연구실의 선임 과학자인 Kalyani Gampa입니다.
3D 종양 스페로이드 배양을 설정하려면 BBS를 세 번 세척하여 관심 암 세포주를 분리합니다. 그 다음에는 배양 플라스크의 5cm 제곱 면적당 1밀리리터의 트립신을 첨가합니다. 5 분 후, 각 플라스크에 혈청이 보충 된 배지의 5 배로 트립신을 중화시키고 세포를 계산합니다.
연동 펌프 기반 시스템이 있는 멸균된 소형 스테인리스강 팁 카세트를 사용하여 8마이크로리터의 스페로이드 배지에 있는 총 500개의 세포를 1, 536웰 조직 배양 처리된 플레이트의 각 웰에 시딩합니다. 그런 다음 통기성 있는 접착 플레이트 씰을 사용하여 플레이트를 덮습니다. 그리고 플레이트를 섭씨 37도, 10rpm으로 설정된 회전 인큐베이터에 넣고 이산화탄소 5%와 상대 습도 95%로 3일 동안 놓습니다.
가장 중요한 단일 단계는 플레이트를 인큐베이터에 넣기 전에 잘 밀봉되었는지 확인하는 것입니다. 스페로이드가 형성되는 데 3일이 필요하며 이 단계는 매체 증발을 방지합니다. 배양이 끝나면 암이 늘어선 배양 플레이트를 중력의 100배로 빠르게 회전시켜 응결을 수집하고 접착 씰을 제거합니다.
처리할 각 플레이트를 각 화합물의 총 8나노리터를 전달하도록 설정된 음향 디스펜서에 넣습니다. 웰당 0.1%DMSO의 최종 농도로 희석하고 10마이크로몰의 최고 화합물 용량으로 희석합니다. 화합물이 적절한 플레이트에 추가되면 증발을 방지하기 위해 각 플레이트에 맞춤형 스테인리스 스틸 세포 배양 뚜껑을 놓고 플레이트를 회전 인큐베이터에 다시 5일 동안 다시 넣습니다.
배양이 끝나면 각 세포 배양 플레이트의 각 웰에 루시페린이 보충된 3마이크로리터의 예열된 세포 용해 시약을 추가합니다. 그리고 플레이트를 실온에서 최소 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 플레이트 광도계에서 ATP 발광을 캡처합니다.
모든 플레이트가 분석되면 기기에서 원시 데이터를 추출하고 테스트 화합물을 포함하는 모든 필드를 DMSO만 중성 대조군으로 포함하는 모든 웰의 평균으로 정규화합니다. 그런 다음 각 화합물의 성장 억제율을 공식에 따라 계산할 수 있으며, 용량 반응 곡선 및 억제 IC50을 생성할 수 있습니다. 2D 배양 조건에서 잘 자라는 것으로 알려진 다양한 확립된 암세포는 형태학적 차이에도 불구하고 방금 설명한 대로 배양될 때 3D 구조를 형성했습니다.
대규모 스크리닝에 사용되는 경우, 2D에서 성장한 배양물과 3D에서 성장한 배양 간의 화합물 감도 차이를 관찰할 수 있습니다. 각 점은 두 배양 환경 모두에서 50%의 세포 사멸 반응이 관찰되는 단일 화합물의 억제 농도를 나타냅니다. 이 대표적인 실험에서, 테스트된 두 RAF 키나아제 억제 화합물은 KRAS 단백질에 활성화 돌연변이가 있는 비소세포폐암 계통 배양에서 3D 조건에서 더 강력했습니다.
그러나 이 화합물은 KRAS에서 G13D 활성화 돌연변이를 포함하는 3D 스페로이드 및 2D 대장암 라인 배양 모두에서 유사한 효능을 보여줍니다. 3D 분석은 또한 고농도 약물에서 억제되는 약물의 저농도에서 세포 성장에 의해 입증된 바와 같이 고도로 활성화된 RAF 돌연변이 라인에서 RAF 이량체의 불완전한 억제가 있을 때 발생하는 역설적 성장 활성화 현상을 관찰할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 암 약물 발견 분야의 연구자들이 알려진 표적에 대해 새롭고 효과적인 화학 물질을 식별하기 위한 대체 배양 조건을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
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개요
본 논문은 고처리량 1536-웰 플레이트 시스템에서 배양된 3차원 종양 스페로이드를 이용한 새로운 약물 발견 방법을 제시합니다. 이 접근법은 잠재적인 항암제 식별에 있어 조직 배양 환경의 연관성을 높이는 것을 목표로 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 종양학
- 신약 개발
- 세포 배양 기술
배경
- 전통적인 2차원 세포 배양은 종양 미세환경을 모방하는 데 한계가 있는 경우가 많습니다.
- 3차원 배양은 암 연구를 위해 생리학적으로 더 적합한 모델을 제공합니다.
- 효율적인 약물 발견을 위해서는 고처리량 스크리닝이 필수적입니다.
- 본 연구는 종양 스페로이드의 배양 최적화에 중점을 둡니다.
연구 목적
- 종양 스페로이드를 배양하기 위한 고효율 방법의 개발.
- 약물 발견 과정에서 이 모델의 관련성 평가.
- 새로운 종양학 약물의 식별 촉진.
사용된 방법
- BBS 세척을 이용한 암 세포주 분리.
- trypsin을 이용한 세포 분리 및 혈청 보충 배지를 이용한 중화.
- 1536-웰 플레이트 형식에서의 세포 배양.
- 고속 대량 스크리닝 방식을 통한 잠재적 약물 후보 물질 탐색.
주요 결과
- 이 방법은 3D 종양 스페로이드의 효율적인 배양을 가능하게 합니다.
- 고처리량 능력을 통해 약물 후보 물질의 신속한 스크리닝이 가능합니다.
- 약물 발견 과정에서 3D 배양 모델의 관련성을 입증하였습니다.
- 히트-투-리드(hit-to-lead) 식별 프로세스를 개선할 가능성이 있습니다.
결론
- 이 3D 종양 스페로이드 배양법은 신약 개발 연구를 강화합니다.
- 이는 종양 생물학을 더욱 정확하게 나타냅니다.
- 이 접근 방식은 새로운 종양학 치료법의 발견으로 이어질 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업 현장 실무 연관성
이 방법은 생리학적으로 유의미한 3D 종양 스페로이드 모델에서 고속 스크리닝을 가능하게 함으로써 종양학 약물 발견의 중개적 격차를 해소합니다. 2D 및 3D 배양 조건 간의 약물 반응 차이를 밝혀 타겟 검증에 대한 예측 신뢰도를 높여줍니다. 이러한 접근 방식은 유전적으로 정의된 암 모델에서 MAPK 경로 억제제의 hit-to-lead 식별 능력을 향상시킵니다.
바이오제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 3D 세포 상호작용과 공간적 조직화를 포착하는 질환 관련 시스템에서 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 2D 배양과 3D 배양에서의 화합물 효능을 비교하여 맥락 의존적 활성을 확인함으로써 기전적 리스크 제거를 지원합니다.
- 예측적 가치: 3D 조건 하의 KRAS 변이 비소세포폐암 모델에서 차별적 민감도를 탐지함으로써 선도물질 발굴을 용이하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 대규모 화합물 스크리닝을 위해 1536-well 포맷과 호환되는 표준화되고 재현 가능한 3D 배양 시스템을 제공합니다.
- 운용적 가치: 정량적 ATP 기반 발광 판독을 통해 성장 억제 정도를 측정하고, 용량-반응 곡선 및 IC50 값을 산출할 수 있게 합니다.
- 분석 준비도: 정밀한 나노리터 단위의 화합물 전달을 위해 음향 분주(acoustic dispensing)를 사용하며, 증발을 방지하기 위해 밀폐 배양을 실시하여 분석의 무결성을 보장합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 연구의 연속성: 확장 가능한 형식으로 종양-기질 상호작용 및 세포외 기질 유사 조건을 모델링하여, 기초 발견과 전임상 워크플로를 연결합니다.
- 리스크 조정 기반의 진전: RAF 이량체 돌연변이에서 나타나는 역설적 성장 활성화를 관찰할 수 있게 하여, 병용 요법 전략을 수립하고 임상 후보 물질의 리스크를 줄입니다.
- 바이오마커 정렬: 유전적으로 정의된 배경에서 경로 특이적 억제제(예: MAPK)의 평가를 지원하여 유전자형과 약물 반응 간의 상관관계를 분석합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 타겟 검증부터 리드 화합물 발굴에 이르는 발견 연속체에 통합되어, 전임상 단계의 투자 이전에 보다 생리학적으로 유의미한 환경에서 화합물의 효능을 조기에 평가할 수 있게 합니다.
- 발견 생물학: KRAS 변이 NSCLC와 같은 발암 유전자 기반 모델에서 3D 배양이 약물 민감도를 어떻게 변화시키는지 밝힘으로써 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 제어된 배양 및 밀봉 프로토콜을 통해 1536-well 플레이트에서 표준화된 스페로이드 형성을 구현하여 분석 준비도와 재현성을 제공합니다.
- 분석: DMSO 대조군에 대한 ATP 발광 정규화를 통해 종속 변수의 정량적 측정을 가능하게 하며, 이를 통해 IC50 계산 및 비교 효능 분석을 용이하게 합니다.
- 중개 연구: 2D 시스템에서는도 나타나지 않는 공간적 종양 구조와 클론 간 상호작용을 모델링하여 전임상 연속성을 확보합니다.
- 기업적 재사용: MAPK와 같은 보존된 경로를 표적으로 하는 다양한 암 세포주 및 화합물 라이브러리 스크리닝을 위한 재사용 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 2D 및 3D 약물 반응의 직접적인 비교를 통해 기전적 모호성을 줄임으로써 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 로봇 호환 1536-well 플레이트 워크플로우와 밀폐 배양을 통해 표준화, 재현성 및 확장성을 제공합니다.
- 전략적 가치: 맥락 특이적 활성을 가진 화합물을 식별하여 후기 단계의 생물학적 리스크를 줄임으로써 go/no-go 결정 프로세스를 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 생리학적으로 유의미한 모델에서의 차등 효능을 바탕으로 리드 화합물의 리스크 조정 우선순위 결정을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 트립신 중화, 세포 수 측정 및 무균 플레이팅을 포함한 3D 세포 배양 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 연동 펌프 기반 카세트 시스템, 음향 분주기, 회전 배양기 및 플레이트 루미노미터와 같은 장비에 의존합니다.
- 밀봉 프로토콜, 배양 파라미터(37°C, 10rpm, 5% CO2, 95% 습도) 및 데이터 정규화 절차에 대한 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 기존 세포주에서 성공적으로 형성되었더라도 스페로이드 형성 효율이 다를 수 있으므로, 다양한 암 세포주에 대한 적응 고려 사항이 포함됩니다.
- 장기 배양 중 증발 방지의 필요성과 나노리터 부피의 화합물 투여 최적화와 같은 실질적인 제약 사항이 포함됩니다.
