Name: 마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: 학습하세요 1536-웰 플레이트를 이용한 고처리량 3차원 종양 스페로이드 배양법으로 암 약물 발굴을 가속화하는 방법입니다. 이 기술은 종양 미세환경을 더 정확히 모사하여 신약 후보 물질 선별의 정확성을 높입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

저자 그의 지원 및이 분석 실험의 초기 개발에 대 한 지침에 대 한 변환 과학 발전, 건강의 국가 학회에 대 한 국립 센터에서 페 러 마크를 인정 하 고 싶습니다. 또한, 우리는 그들의 과학적인 입력 및 토론으로 프로젝트 팀 구성원에 대 한 앨리슨 프리먼, Mariela Jaskelioff, 마이클 애 커, Jacob Haling, 및 Vesselina 쿡을 감사 하 고 싶습니다.

1. 1536-좋은 3D 종양 Spheroids의 배양
<ol><li>Dulbecco의 수정 이글스 매체 (DMEM/F12)의 500 mL를 다음과 같은 시 약을 추가 하 여 신선한 3D 종양 회전 타원 체 중간 줄기 (셀 매체 녹아웃 혈 청 교체 + 인슐린-처리가-셀레늄) 준비: 1 x 페니실린/스, 인간의 10 ng/mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 요소 (bFGF), 인간 표 피 성장 인자 (EGF), 0.4% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) (분수 V), 인슐린-처리가-셀레늄, 및 1% 녹아웃 (KO) 혈 청 교체 (할 하지 동결-해 동) x 1의 20 ng/mL.</li>
	<li>필터-소독 0.4 µ m 병 상단 필터 시스템을 통해 보충 교재를 가진 전체 매체.</li>
	<li>그들을 세척 하 여 전통적인 세포 배양 플라스 크에서 권장된 일상적인 문화 조건에 따라 성장 암 세포 라인 분리 3 x 1 x 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 0.25 %trypsin (1 mL의 적절 한 금액을 추가 5 cm2) 당 5 분 셀 위에 얇은 레이어를 만듭니다. 혈 청을 포함 하는 매체의 금액 x 5 트립 신을 중화 하 고는 셀 이동 합니다. 예를 들어 5 ml의 트립 신 매체의 25 mL를 사용 합니다.</li>
	<li>씨앗 잘 회전 타원 체 매체의 8 µ L 당 500 세포의 총 1536-잘 조직 문화 취급 판으로 위해 104 셀/mL x 62.5에 셀 용액의 농도 조정 합니다.</li>
	<li>생물 안전 캐비닛, 연동 펌프-기반 시스템으로 소독, 작은 스테인레스 스틸 밀고 카세트를 사용 하 여 셀을 시드하십시오. 다른 셀 라인 사이 PBS와 70% x 1 카세트의 튜브를 플러시 에탄올 10 s.</li>
	<li>또는, 종자 소독, 작은 스테인레스 스틸 밀고 카세트와 연동 펌프 또는 셀 줄 필요 번호판의 번호에 따라 연결 된 주사기 펌프를 사용 하 여 HEPA 필터 룸 내에 있는 액체 처리기를 사용 하 여 셀.</li>
	<li>수동으로 사용 하 여 통기성 접착 판 도장 중 또는 접시 마감재를 사용 하 여 접시를 봉인.</li>
	<li>10 rpm와 5% 이산화탄소 (CO2)와 95% 상대 습도 37 ° C에서 설정 회전 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 3 d 형태를 spheroids 수 있습니다.</li>
</ol>2. 1536-잘 2D 암 라인의 경작
참고: 1536-잘 2D 암 라인 3D 판 화합물의 추가 하기 전에 24 시간 배양 한다.
<ol><li>선택한 라인에 대 한 적절 한 성장 매체의 500 mL를 다음과 같은 시 약을 추가 하 여 2D 암 세포 매체를 준비: 페니실린/스와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) x 1.</li>
	<li>필터-소독 0.4 µ m 병 상단 필터 시스템을 통해 보충 교재를 가진 전체 매체.</li>
	<li>분리 그들을 세척 하 여 전통적인 세포 배양 플라스 크에서 권장된 일상적인 문화 조건에 따라 성장 암 세포 선, PBS와 0.25 %trypsin (5 c m2당 1 mL)의 적절 한 금액을 추가 하는 5 분 x 1 3 x 셀 위에 얇은 레이어를 만듭니다. 혈 청을 포함 하는 매체의 금액 x 5 트립 신을 중화 하 고는 셀 이동 합니다. 예를 들어 5 ml의 트립 신 매체의 25 mL를 사용 합니다.</li>
	<li>씨앗 잘 완전 한 매체의 8 µ L에서 당 500 세포의 총 1536-잘 조직 문화 취급 판으로 위해 104 셀/mL x 62.5에 셀 용액의 농도 조정 합니다.</li>
	<li>생물 안전 캐비닛, 연동 펌프-기반 시스템으로 소독, 작은 스테인레스 스틸 밀고 카세트를 사용 하 여 셀을 시드하십시오. 다른 셀 라인 사이 살 균 PBS와 70% x 1 카세트의 튜브를 플러시 에탄올 10 s.</li>
	<li>또는, 종자 소독, 작은 스테인레스 스틸 밀고 카세트와 연동 펌프 또는 셀 당 격판덮개의 볼륨에 따라 연결 된 주사기 펌프를 사용 하 여 HEPA 필터 로봇 룸 내에 있는 액체 처리기를 사용 하 여 셀 선 필요입니다.</li>
	<li>수동으로 사용 하 여 통기성 접착 판 도장 중 또는 접시 마감재를 사용 하 여 접시를 봉인.</li>
	<li>10 rpm 및 복합 추가, 5% CO2 와 95% 상대 습도와 이전 24 시간 동안 37 ° C 설정 회전 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
</ol>3. 복합 추가
<ol><li>10 m m 최고 농도와 액체 처리 로봇에 100% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 MAPK 억제제의 8 포인트, 3-fold 직렬 희석을 준비 합니다. 프로테아좀 억제제 Bortezomib 분석 결과의 동적 범위를 결정 하기 위해 죽이 완전 한 셀에 대 한 긍정적인 컨트롤로 사용 됩니다.</li>
	<li>빠른 스핀 모든 시험 접시와 든 수집을 100 x g에서 복합 플레이트. 각 접시에서 접착 씰을 제거 하 고 8 총을 추가 하는 음향 분배기 설정에 접시를 놓고 각 화합물/희석 대표 하는 잘 당 0.1 %DMSO 최종 농도 10 µ M의 최고 복합 복용량의 nL.</li>
	<li>화합물의 추가 완료 되 면, 주문 품, 스테인레스 스틸 셀 문화 뚜껑 접시에 증발을 방지 하 고 5d, 5% CO2 와 95% 상대 습도 대 한 37 ° C에서 회전 인큐베이터에 접시를 장소를 장소.</li>
</ol>4. 검출 시 약 추가 및 원시 데이터의 취득
<ol><li>전 따뜻한 실내 온도에서 세포 증식 또는 37 ° C 물 욕조에 아데닌 3 인산 염 (ATP)에서 변화 하 고, 따라서, 변화를 감지 하는 소를 포함 하는 셀 세포 시 약의 적절 한 볼륨. 검출 시 약의 3 µ L의 총 각 잘 연동 펌프를 사용 하 여를 추가 하 고 적어도 15 분 동안 실내 온도에 격판덮개를 품 어.</li>
	<li>플레이트 루미 노에 발광을 캡처하십시오.</li>
</ol>5입니다. 데이터 처리
<ol><li>악기에서 원시 데이터를 추출 하 고 중립 제어로 혼자 DMSO를 포함 하는 모든 우물의 평균 시험 화합물을 포함 하는 모든 필드를 정상화. 이 값에서 각 화합물의 백분율 성장 저해를 계산 합니다. 이 Microsoft Excel에서 수식 함수를 사용 하 여 완료 되 면 어디 f (x) = {(샘플 값은 상대적인 빛 단위 (RLUs) / (평균 DMSO 값 RLUs) * 100)}.</li>
	<li>그래프 프로그램을 사용 하 여 복합 농도 대 한 단계로 5.1에서 정규화 된 데이터의 값을 그래프에 의해 복용량 응답 곡선 및 금지 IC50s를 생성 합니다. 참고: 우리는 헬 리오스, 내부 NIBR 소프트웨어 도구를 사용 하 여 데이터를 분석. 이 기능을 완료 하려면 우리는 비패라메트릭 곡선 분석 도구를 선택.</li>
</ol>

<ol><li>Lee, M., Vasioukhin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+polarity+and+cancer--cell+and+tissue+polarity+as+a+non-canonical+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).</li>
<li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research%3A+Focus+on+tumor+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li>
<li>Weigelt, B., Ghajar, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+complex+3D+culture+models+to+unravel+novel+pathways+and+identify+accurate+biomarkers+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).</li>
<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).</li>
<li>Li, L., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+a+3D+Culture+System+to+Study+the+Interaction+between+Epithelial+Breast+Cancer+and+Its+Surrounding+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts.</a> Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li>
<li>Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumour+models%3A+novel+in+vitro+approaches+to+cancer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies.</a> Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).</li>
<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+%283D%29+models+in+cancer+research%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update.</a> Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+pharmacological+profiling+of+3D+tumor+models+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells.</a> Cell Death & Disease. 7 (12), e2492(2016).</li>
<li>Polo, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+to+PI3K+and+MEK+inhibitors+in+breast+cancer.+Use+of+a+3D+culture+system+to+study+pathways+related+to+hormone+independence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice.</a> PLoS One. 5 (5), e10786(2010).</li>
<li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li>
<li>Bhargava, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registered+report%3A+RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Elife. 5, e09976(2016).</li>
<li>Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+CpG+promoter+methylation+in+invasive+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells.</a> Molecular Cancer. 9, 267(2010).</li>
<li>Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+gene+regulation+in+stem+cells+and+correlation+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer.</a> Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+DNA+repair+genes+in+invasive+human+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells.</a> Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li>
<li>Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+culture+of+murine+primordial+germ+cells+and+embryonic+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells.</a> Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+SOX9+by+the+NF-kappaB+signaling+pathway+in+pancreatic+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells.</a> Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li>
<li>Herter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three-dimensional+heterotypic+spheroid+model+for+the+assessment+of+the+activity+of+cancer+immunotherapy+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).</li>
</ol>

저자는 노바 티 스의 직원 그리고 일부 직원 들도 주주.

여기에 제시 된 방법을 대규모 복합 검 진을 위해 1536-잘 접시에 종양 spheroids를 생산 하는 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 보여 줍니다. 이러한 방법은 종양 spheroids 유전 종속성 및 복합 감도13, 에 대 한 질문 6-잘, 96 잘 접시에 낮은 처리량 분석 실험에서 성장 했다 국립 암 연구소에 직장에서 처음 적응 했다 14 , 15.이 프로토콜의 중요 하 고 독특한 기능은 spheroids 1536-플레이트를 사용 하 여 정의 된 전통적인 2D 조직 배양 세포에서 형성 되는 미디어 SCM + 코 + ITS 라고. 일단 셀에 씨를 뿌리고, 그들은 3 d 회전 타원 체 형성의 기간 동안 어떤 증발을 방지 하기 위해 숨 접착제 열판으로 봉인 됩니다. Spheroids 사용 하 여이 접근16시간의 긴 기간...

지난 10 년간에서 점점 더 많은 연구는 성장 하는 세포 차원에서 플라스틱에 의해 완전히 지 하지 개념 이해 3D 셀 문화 모델의 사용을 구현 했습니다. 이러한 개념의 예 생존 및 세포 운명 조절에 세포 외 매트릭스의 역할 뿐 아니라 정상 상피 세포 극성1 셀의 꼭대기와 기저 계층의 공간적 방향이 손실에 교대를 포함 합니다. 종양학 연구, 특히, 암 세포와 2D 및 3D 셀 문화 시스템3,4간의 차이의 기본적인 생물학을 이해 하 3D 모델을 사용 했다. 더 정교한 셀 문화 기술과 멀티 잘 포맷을 더 그들의 적응의 개발은 3D 설정에서 새로운 약물에 대 한 검색을 활성화 하 고 있다. 셀과 달리 성장 조건 하에서 2D, 3D 모델 종양 범위 복잡 한 계층화 된 셀룰러 시스템5 에서 다양 한 크기의 단일 셀 유형 분야에서에서의 복잡 한 cell 타입 분야6,7, 8. 소설 화합물 또는 potently 이러한 3D 모델 시스템에 세포 죽음을 유도 하는 생물 의약품의 발견은, 따라서, 약물 개발 캠페인에 높은 관심의. 이 분석 실험의 끝점 종종 세포 증식에 변화를 평가 하기 위해 2D 문화에서 그와 동일 하지만 더 순수 관련 설정에서 실시 하는 때 그들은 대상 유전자 나 통로가 되는 종속성의 진정한 수준을 드러낼 수 있습니다. 심문.
대부분 중 96 또는 384-잘 결정 접시를 사용 하 고 높은 처리량 검열 (HTS) 형식에서 자주 사용 한다에 쉽게 적응 하지 않습니다 하지만 모델 시스템의 다양 한 3D 문화 시스템에 약물 응답 공부 하 개발 되어 위의 도입, 약물 발견 심사 캠페인입니다. 이러한 시스템 물방울 기술, 회전 타원 체 문화, 공중 부양, 그리고 자연 또는 합성 젤 콜라겐, Matrigel, 또는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)2 등을 통합 하는 문화를 유도 하기 위해 마그네틱 입자와 셀 pulsating 매달려의 사용을 포함 . 여기, 우리는 1536-잘 접시 형태로 설립된 암 세포 선에서 3D 회전 타원 체 문화 생산 이전 개발 기술의 상세한 방법 제시. 이 프로토콜 높은 정의 매체 사용 일반적으로 부착 셀 라인9의 부착을 방지 합니다. 이 시스템에 제한 사항 (즉, 그것은 완전히 암의 복잡 한 모델 시스템 정리 수 없습니다), 하지만 그럼에도 불구 하 고,이 분석 실험 작은 분자의 대규모 컬렉션 및 약 응답의 십자로 비교의 높은 처리량 검열 다양 한 세포 및 화합물에 대 한 2D 및 3D 문화 사이
셀 라인 MAPK 신호 통로, 통로 높은 암, dysregulated에 관련 된 유전자의 모든 항구 돌연변이 들이 문서의 방법 보여 선택 하 고 있는 많은 치료제에 대 한 사용할 수 있습니다. 라인의 많은 키 얼 스 틴 쥐 육 종 바이러스 라고도 KRA, 신경 RAS 또는 NRAS, 하 비 쥐 육 종 바이러스 oncogene 또는 HRA, 및 관련된 kinases 빠르게 가속 Fibrosarcomas, 일컬어 종양 돌연변이 활성화 Raf는. 최근 문학이이 통로의 다른 노드의 억제제 셀 라인 3D 조건9,10에서 성장 될 때의 하위 집합에 고유 하 게 더 효능을 제안 합니다. 때 활성 RAS와 암 세포 차원에서 교양 있었다, 그들은 증가 감도 MAPK 억제제를 시연 하 고 또한,이 접근 경로 확인할 수 및 전통적인 2D에서 놓친 억제제를 대상으로 한 연구 발견 설정합니다. 이 연구의 목표는 이러한 셀 라인 문화 하는 데 사용 하는 방법을 제시 하 고 또한, 차등을 보여 주기 위해 3D를 사용 하는 경우에 관찰 될 수 있는 이러한 억제제에 대 한 응답 문화 시스템 세포.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td>준비된 용액으로 구매. 이 reciepe는 다른 공급업체에 비해 선호되는 것으로 나타났습니다.</td></tr><tr><td>DMEM Dulbecco의 Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td>준비된 솔루션으로 구입했습니다.</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)</td><td>Lonza</td><td>12-115Q</td><td>준비된 솔루션으로 구입했습니다.</td></tr><tr><td>소태아 혈청 (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>준비된 용액으로 구입했습니다.</td></tr><tr><td>1x 0.25% 트립신과 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>하이클론</td><td>SH30042.01</td><td>준비된 용액으로 구입.</td></tr><tr><td>1x 페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>준비된 용액으로 구입했습니다.</td></tr><tr><td>10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF)</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>멸균수에 재현탁합니다.</td></tr><tr><td>20 ng/mL 인간 표피 성장 인자(EGF)</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>멸균수에 재현탁합니다.</td></tr><tr><td>0.4% 소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td>멸균 PBS 및 필터에 재현탁합니다.</td></tr><tr><td>1x 인슐린 트랜스페린 셀레늄(ITS)</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>1% 녹아웃(KO) 혈청 교체용</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>사용 직전에 새 제품을 추가하십시오.</td></tr><tr><td>100% 디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>Sigma</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7573</td><td>준비된 용액으로 구입했습니다.</td></tr><tr><td>소모품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small Combi Cassette</td><td>ThermoFisher</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Small Multiflow Cassette</td><td>BioTek</td><td>294085</td><td></td></tr><tr><td>1536-well sterile TC plates (white)</td><td>Corning</td><td>3727</td><td></td></tr><tr><td>1536-well sterile TC plates (black)</td><td>Corning</td><td>3893</td><td></td></tr><tr><td>Scivax plates</td><td>MBL International</td><td>NCP-LH384-10</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesives seals</td><td>ThermoFisher</td><td>AB0718</td><td></td></tr><tr><td>스피닝 인큐베이터</td><td>LiCONiC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스테인리스강 뚜껑</td><td>The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATS Acoustic Dispensor</td><td>EDS Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Echo Acoustic Dispensor</td><td>Labcyte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>광도계</td><td>Envision-Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프- 멀티드롭 콤비</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>액체 처리기-Multiflow FX</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 spheroids의 생성

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

암 세포는 정기적으로 플라스틱 표면에 2 차원 (2D)에서 경작 되었습니다. 그러나이 기술은,, 부족 진정한 환경 종양 질량에 비보에 노출 됩니다. 단단한 종양 시트 플라스틱, 첨부로 성장 하지만 3 차원 (3d) 클론 셀의 컬렉션으로 대신 그들의 이웃, 그리고 정상적인 세포 극성의 파괴와 같은 독특한 공간 속성의 상호 작용 공간. 이러한 상호 작용 종양 vivo에서 더 관련 된 형태학 및 세포 특성을 얻으려고 3 차원 배양 세포를 발생할. 또한, 종양 질량은 다른 세포 유형 stromal 및 면역 세포 뿐만 아니라 다른 모든 세포 유형에 서 세포 외 매트릭스와 직접 접촉에. 입금 매트릭스 고분자 콜라겐과 fibronectin 같은 구성 되어 있습니다.
머리 맡에 벤치에서 종양학에서 연구 결과의 번역을 증가 하는 시도에 많은 그룹 그들의 약 개발 전략에서 3D 모델 시스템의 사용을 조사 하기 시작 했습니다. 이러한 시스템은 종양의 복잡 하 고 이기종 환경 정리 하려고 하기 때문에 더 많은 생리 적으로 관련 된 것으로 생각 된다. 그러나 이러한 시스템은,, 매우 복잡할 수, 그리고, 비록 의무가 96 잘 형식과 384에도 지금 일부에서 성장, 그들은 대규모 성장 및 심사에 대 한 몇 가지 옵션 제공. 이 관찰 간격 여기 문화 종양 spheroids 1536-잘 접시의 높은 처리량 용량에 세부 사항에서 설명 하는 방법의 개발을 주도하 고 있다. 이 메서드는 매우 복잡 한 매트릭스 기반 시스템, 화면, 그리고 기존의 2D 분석 하기 어려운 타협을 나타냅니다. 은닉 다른 유전자 돌연변이 암 세포 라인의 다양 한은 성공적으로 상영 Mitogen-Activated 단백질 키 니 아 제 또는 MAPK 통로 대상으로 하는 화합물의 큐레이터 라이브러리를 사용 하 여 복합 효능을 검사. 회전 타원 체 문화 응답 그런 다음 2d, 성장 하는 세포의 응답에 비교 하 고 차동 활동 보고 됩니다. 이 메서드는 복합 활동 높은 처리량 3D 설정에서 테스트를 위한 고유 프로토콜을 제공 합니다.

여기에 설명 된 방법을 사용 하 여 2D 문화 조건 하에서 잘 성장 하는 것으로 알려져 라인 테스트 설립된 암 세포의 다양 한. 대표 이미지 MAPK 돌연변이 암의 다양 한 세포 라인 (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-멜-30:NRAS, 및 학회-62:HRAS) 그림 1에서 볼 수 있습니다. 이러한 이미지는 셀 라인을가지고 있지만 다양 한 형태학, 각각 형성 3D 구조 분석 결과 1536-잘 접시에서 보여 줍니다. 그림 2 는 보여줍니다, 대규모 심사를 위해 사용 될 때 3D에서 2D 대 에 성장 하는 문화 사이의 차동 복합 감도 관찰할 수 있습니다. 그래프에 각 점 대표 한 화합물의 억제 농도 50% 셀 살인 나 두 설정에서 화합물의 IC50 응답. 효과 다른 미디어에 의해 전적으로 중재 하지 보여, Calu-6 셀 2D ...

다양 한 질병의 표시 더 순수 관련 모델 개발 및 구현에 약물 발견 프로그램 되. 여기에 설명 된 새로운 모델 시스템 spheroids를 경작 하 고 종양학 신약에 대 한 검색 하는 높은 처리량 1536-잘 접시 기반 시스템에서 상영 될 수 방법을 3 차원 종양을 보여 줍니다.

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

이 방법은 신약 개발 분야의 주요 질문(예: hit to lead 식별에 가장 관련성이 높은 조직 배양 설정이 무엇인지)에 대한 답변에 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 1536개의 웰 플레이트를 사용하여 높은 처리량 방식으로 3차원으로 세포를 배양할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜을 시연하는 사람은 제 연구실의 선임 과학자인 Kalyani Gampa입니다.3D 종양 스페로이드 배양을 설정하려면 BBS를 세 번 세척하여 관심 암 세포주를 분리합니다. 그 다음에는 배양 플라스크의 5cm 제곱 면적당 1밀리리터의 트립신을 첨가합니다. 5 분 후, 각 플라스크에 혈청이 보충 된 배지의 5 배로 트립신을 중화시키고 세포를 계산합니다.연동 펌프 기반 시스템이 있는 멸균된 소형 스테인리스강 팁 카세트를 사용하여 8마이크로리터의 스페로이드 배지에 있는 총 500개의 세포를 1, 536웰 조직 배양 처리된 플레이트의 각 웰에 시딩합니다. 그런 다음 통기성 있는 접착 플레이트 씰을 사용하여 플레이트를 덮습니다. 그리고 플레이트를 섭씨 37도, 10rpm으로 설정된 회전 인큐베이터에 넣고 이산화탄소 5%와 상대 습도 95%로 3일 동안 놓습니다.가장 중요한 단일 단계는 플레이트를 인큐베이터에 넣기 전에 잘 밀봉되었는지 확인하는 것입니다. 스페로이드가 형성되는 데 3일이 필요하며 이 단계는 매체 증발을 방지합니다. 배양이 끝나면 암이 늘어선 배양 플레이트를 중력의 100배로 빠르게 회전시켜 응결을 수집하고 접착 씰을 제거합니다.처리할 각 플레이트를 각 화합물의 총 8나노리터를 전달하도록 설정된 음향 디스펜서에 넣습니다. 웰당 0.1%DMSO의 최종 농도로 희석하고 10마이크로몰의 최고 화합물 용량으로 희석합니다. 화합물이 적절한 플레이트에 추가되면 증발을 방지하기 위해 각 플레이트에 맞춤형 스테인리스 스틸 세포 배양 뚜껑을 놓고 플레이트를 회전 인큐베이터에 다시 5일 동안 다시 넣습니다.배양이 끝나면 각 세포 배양 플레이트의 각 웰에 루시페린이 보충된 3마이크로리터의 예열된 세포 용해 시약을 추가합니다. 그리고 플레이트를 실온에서 최소 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 플레이트 광도계에서 ATP 발광을 캡처합니다.모든 플레이트가 분석되면 기기에서 원시 데이터를 추출하고 테스트 화합물을 포함하는 모든 필드를 DMSO만 중성 대조군으로 포함하는 모든 웰의 평균으로 정규화합니다. 그런 다음 각 화합물의 성장 억제율

generation-high-throughput-three-dimensional-tumor-spheroids-for-drug

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

우리는 상업적으로 이용 가능한 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 균일 한 크기 및 구성 제어 종양 상체의 (수천 수백 수천) 많은 수의 생성을위한 프로토콜을 소개합니다.

마이크로 웰 플레이트를 사용하여 크기 조절 종양 상체 많은 수의 생산

주변 정상 조직의 침입은 악성 종양을 정의하는 특징입니다. 우리는 여기에서 여러 진행성 인간 암 모델로 예시된 자연 3D 바이오매트릭스로의 침입에 대한 간단한 반자동 마이크로 플레이트 분석을 제공합니다.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

수성 2상 시스템을 사용하여 고처리량 96웰 플레이트 형식으로 암세포 스페로이드를 로봇 프린팅하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

약물 테스트를위한 수성 2 단계 시스템으로 암 세포 타원체의 로봇 생산

교모세포종 다형성의 환자 유래 이종이식편은 3D 인간 바이오겔 배양 시스템을 사용하여 살아있는 미세종양으로 소형화할 수 있습니다. 이 생체 내 유사 3D 종양 분석은 키노믹 분석을 포함한 약물 반응 검사 및 분자 프로파일링에 적합합니다.

Kinomic 프로파일 의약품 응답 테스트를위한 3D 인간의를 Biogel 문화 시스템을 사용 Microtumors 및 환자 유래 아교 모세포종 세포의 생성

광학 일관성 단층 촬영 (10 월), 3 차원 영상 기술, 모니터링 하 고 다세포 종양 spheroids의 성장 활동 특성 사용 되었다. 접근, 및 내장 광 감쇠 대비에 따라 spheroids에서 레이블 없는 죽은 조직 검출 복을 사용 하 여 종양 spheroids의 정확한 체적 정량화 시연 했다.

경도 형태 및 생리 적인 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 3 차원 종양 Spheroids의 모니터링

이 프로토콜은 약물 을 평가하기 위해 증식, 세포 독성 테스트, 유세포 분석, 면역 형광 염색 및 공초점 이미징의 정량화를 포함한 환자 유래 스페로이드 생성 및 하류 분석을 설명합니다. 반대로 신생물 치료제로 후보자의 잠재력. 이 프로토콜은 각 환자 및 질병 단계에 대한 특정 약물을 식별하여 정밀 의학을 지원합니다.

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

이 프로토콜은 대규모 고함량 스크리닝 및 분석에 적합한 방식으로 세 가지 유형의 구상체를 생산하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 이들이 스페로이드 및 개별 세포 수준에서 어떻게 분석될 수 있는지를 보여주는 예들이 제시된다.

고함량 스크리닝 및 분석 응용을 위한 구상체의 대규모 생산을 위한 강력한 방법

종양 구상체는 종양 세포-미세환경 상호작용 및 치료 반응을 평가하기 위해 점점 더 활용되고 있다. 본 프로토콜은 신속한 광학 클리어링을 사용하여 3D 종양 구상체의 반고처리량 이미징을 위한 견고하지만 간단한 방법을 기술한다.

종양 구상체의 반 높은 처리량 분석을 위한 신속한 광학 클리어링

현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델을 생성하고 세포 생존력 분석 및 현미경 검사를 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하는 것을 설명합니다.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

이 글에서는 3차원 종양 스페로이드를 구성하기 위한 표준화된 방법을 보여줍니다. 자동화된 이미징 시스템을 사용한 스페로이드 관찰 및 이미지 기반 딥러닝 분석을 위한 전략도 설명합니다.

약물 평가 연구를 위한 3D 종양 스페로이드 생성

여기에서 우리는 세포외 플럭스 분석을 통해 3차원(3D) 신경아교종 스페로이드와 이미징 기반 정규화를 통합하는 대사 프로파일링 플랫폼을 구축합니다. 이 접근법을 통해 약물 치료에 대한 종양 대사 반응을 보다 정확하게 평가할 수 있으며 잠재적인 내성 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

약물 스크리닝을 위한 3차원 뇌종양 스페로이드의 대사 프로파일링의 발전

학습하세요 1536-웰 플레이트를 이용한 고처리량 3차원 종양 스페로이드 배양법으로 암 약물 발굴을 가속화하는 방법입니다. 이 기술은 종양 미세환경을 더 정확히 모사하여 신약 후보 물질 선별의 정확성을 높입니다.

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

더 많은 동영상 탐색