Name: CARIP-Seq와 칩 Seq: Chromatin 관련 된 RNAs 및 배아 줄기 세포에 단백질 DNA 상호 작용을 식별 하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 배우세요 CARIP-Seq와 ChIP-Seq를 활용하여 배아 줄기 세포에서 염색질 관련 RNA와 단백질-DNA 상호작용을 전체 게놈 규모로 분석하는 방법을. 이 기술은 후성유전학 및 줄기세포 생물학 연구에 필수적입니다.

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이 작품 웨인 주립 대학, Karmanos 암 연구소, 국가 심 혼, 폐 및 혈액 학회 (1K22HL126842-01A1) B.L.K.에 게 수 여에서 교부 금에 의해 지원 되었다 웨인 주립 대학 높은 성능 컴퓨팅 그리드 계산 리소스를 활용 하는이 작품 (< https://www.grid.wayne.edu/>). CARIP-Seq 데이터 분석 지원에 감사 연합 Kurup 하 고.
저자의 기여:
B.L.K.는 CARIP-Seq 방법의 임신, 시퀀싱 데이터 분석 그리고 원고 초안, 설계 및 칩 Seq와 CARIP-Seq 실험을 실시. 모든 저자는 읽고 있고이 원고의 최종 버전을 승인.

<ol><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+external+signaling+pathways+with+the+core+transcriptional+network+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells.</a> Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).</li>
<li>Boyer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core+transcriptional+regulatory+circuitry+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells.</a> Cell. 122 (6), 947-956 (2005).</li>
<li>Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extended+transcriptional+network+for+pluripotency+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells.</a> Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+self-renewal+and+accelerated+reprogramming+in+the+absence+of+Kdm5b%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b.</a> Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KDM5B+focuses+H3K4+methylation+near+promoters+and+enhancers+during+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation.</a> Genome Biol. 15 (2), R32(2014).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Hudson, W. H., Ortlund, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure%2C+function+and+evolution+of+proteins+that+bind+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).</li>
<li>Khalil, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).</li>
<li>Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+RNA+binding+by+chromatin-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins.</a> Genome Biol. 17, 28(2016).</li>
<li>Kelley, R. L., Kuroda, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA+genes+in+dosage+compensation+and+imprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting.</a> Cell. 103 (1), 9-12 (2000).</li>
<li>Koziol, M. J., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+traffic+control+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA traffic control of chromatin complexes.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).</li>
<li>Mercer, T. R., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+long+noncoding+RNAs+in+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation.</a> Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Xist+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>Mak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+the+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Science. 303 (5658), 666-669 (2004).</li>
<li>Garfield, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+primary+mouse+embryonic+fibroblast+%28PMEF%29+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures.</a> Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).</li>
<li>Conner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+fibroblast+%28MEF%29+feeder+cell+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Zang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clustering+approach+for+identification+of+enriched+domains+from+histone+modification+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data.</a> Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29+to+analyze+short+reads+generated+by+sequencing+protein-DNA+interactions+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq%3A+technical+considerations+for+obtaining+high-quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data.</a> Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
</ol>

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

칩 Seq 글로벌 단백질 DNA 상호 작용의 위치를 평가 하는 유용한 방법입니다 (예., 녹음 방송 요인/히스톤 수정 효소/히스톤 수정 DNA) ES 세포, 새로 개발된 된 CARIP-Seq 프로토콜에 유용 하는 동안에 질의 게놈 넓은 협회 RNAs의 chromatin 성분. 칩 Seq는 ES 세포의 epigenetic 풍경과 다른 세포 유형 평가 하는 데 사용 되는 기본 도구입니다. 칩 Seq 및 CARIP-Seq 라이브러리의 품질이 크게 칩 급 항 체에 의존 합니다. 칩 Seq에 대 한 항 체의 적합성 빈된 지역에 상대적으로 긍정적인 통제 지역에서 5 농축에 ≥ 3 고품질 칩 Seq 데이터25를 생성 하기에 충분 해야 칩 PCR을 수행 하 여 경험적으로 확인할 수 있습니다. 마찬가지로, 항 체 테스트할 수 있습니다 그들의 적합성에 대 한 CARIP-Seq에 대 한 비슷한 방식으로 사소한 수정 칩 Seq에 설명 된 대로. 위의 방법 섹션에 설명 된 대로 CARIP 프로...

배아 줄기 (ES) 세포 운명 결정 extracellular 신호 및 transcriptional-레 귤 레이 터, 히스톤 한정자 및 히스톤 꼬리의 사후 번역 수정 포함 하 여 호스트 간의 통신에 의해 통제 된다. 이러한 상호 작용 촉진 chromatin 접근성 및 두 가지 상태 중 하나로 chromatin의 포장: euchromatin 열리고 transcriptionally 활성 되 고 섬으로, 콤팩트 하 고 transcriptionally 일반적으로 비활성 이다. 녹음 방송 요인 DNA 시퀀스 특정 바인딩 선호도와 epigenetic 한정자 연결 대상 euchromatic 지구 유전자 발현 조절에 참여 하. 다음-세대 시퀀싱 방법, 칩 Seq1를 포함 하 여 ES 세포 자체 갱신 및 pluripotency2,3,4에 대 한 근본적인 게놈 넓은 transcriptional 네트워크 매핑 수단이 ,,56. 또한, RNA immunopreciation RNA-단백질 상호 작용의 다음-세대 시퀀싱 (RIP-Seq)7 평가 뒤 동안 DNA 의무적인 단백질 transcriptional 이벤트7, 를 규제 하는 RNAs 상호 작용 제안 8 , 9 , 10 , 11 , 12, 몇 가지 연구 RNAs chromatin12또는 RNA와 히스톤 수정 사이 글로벌 상호 연관의 게놈 넓은 지역화를 조사 했습니다. 오래 비 코딩 RNAs (lncRNAs)는 있으면 chromatin 관련 단백질13,,1415의 활동을 규제 하는 RNAs의 한 클래스. 예를 들어 Xist epigenetic repressors16,17의 채용을 통해 하나의 X 염색체의 비활성화를 여성 포유류 세포에서 조절 하는 lncRNA 이다. 그러나, chromatin와 관련 된 RNAs의 전체 스펙트럼 크게 불명 하다. 여기, 우리는 새로운 프로토콜, chromatin 관련 RNA immunoprecipitation (CARIP)에 대 한 다음-세대 시퀀싱 (CARIP-Seq), 라이브러리 준비를 포함 하 여 ES 세포의 게놈 넓은 기준 chromatin 관련 RNAs를 식별 하기 위해 다음 설명 차세대 시퀀싱, 그리고 칩 Seq 매핑할 히스톤 수정, 녹음 방송 요인과 epigenetic 한정자의 글로벌 인. 달리 다른 RIP Seq 방법7, CARIP-Seq chromatin와 관련 된 RNAs의 직접 식별을 위해 허용 가교 및 쥡니다 단계를 포함 합니다. 함께, 칩 Seq 게놈 넓은 단백질 DNA 상호 작용을 식별 하는 강력한 도구, RNAs chromatin 구성 요소와 관련 된 CARIP-Seq는 조사 하는 강력한 방법.

<table><tbody><tr><td>마우스 백혈병 억제 인자 (ESGRO LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>106 or 107 units</td></tr><tr><td>GSK3&beta; inhibitor CHIR99021 (GSK3i)</td><td>stement</td><td></td><td>solvevent: DMSO 10mM</td></tr><tr><td>MEK inhibitor PD0325901 (MEKi)</td><td>stem</td><td></td><td>solvent: DMSO 10mM</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose</td><td>인비트로젠</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>PBS (인산염 완충 식염수)</td><td>인비트로겐</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올 (50 mM)</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액 (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax ES 세포 인증 소 태아 혈청, 500 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-009-B</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0.1% 젤라틴 용액</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Sigma</td><td>G7126-500G</td><td>1.25 M 물 원료 conentration</td></tr> 포<tr><td>름알데히드 용액</td><td>Sigma</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X</td><td>품질 : 생물학</td><td>351-011-131</td><td></td></tr><tr><td>페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF) 용액</td><td>: 시그마</td><td>93482-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>로슈</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>도데 실황산 나트륨 용액 (20 %)</td> <td>품질 : 생물학</td><td>A611-0837-10</td><td></td></tr><tr><td>Q125 sonifier</td><td>Qsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 용액</td>, <td>Sigma</td><td>93443-100ML</td><td></td></tr><tr><td>소듐 데옥시콜레이트</td>, <td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td>, <td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G, 면역침전용</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A, 면역침전용 Dynabeads Protein A</td><td></td>, <td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A/Protein G 및 마그넷 스타터 팩</td><td>Invitrogen</td><td>10015D</td><td></td></tr><tr><td>리튬 클로라이드</td><td>Sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA 정제 키트(총 RNA 전취에서 mRNA 정제용)</td><td>Invitrogen</td><td>61006</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript 이중 가닥 cDNA 합성 키트</td><td>Invitrogen</td><td>11917010</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>End-It DNA End-Repair Kit</td><td>Lucigen</td><td>ER81050</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'&rarr; 5' exo-)</td><td>NEB</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dATP (10 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>18252015</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10488085</td><td></td></tr><tr><td>E-gel EX 아가로스 겔, 2%</td><td>Invitrogen</td><td>G402002</td><td></td></tr><tr><td>Phusion high-fidelity 2X master mix with HF</td><td>buffer Thermo Fisher</td><td></td><td></td>F531LPM</tr><tr><td>ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) - ChIP 검증 항체</td><td>EMD Millipore</td><td>17-614</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histone H3 (di methyl K4) 항체 [Y47] - ChIP Grade (ab32356)</td><td>Abcam</td><td>ab32356</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well)</td><td>Fisher</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Standard Tissue Culture Dish (10cm)</td><td>Fisher</td><td>08772E</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor pico</td><td>Diagenode</td><td>B01010001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flurometer 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 분석 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>MinElute 반응 클린업 키트</td><td>Qiagen</td><td>28204</td><td></td></tr><tr><td>MinElute 겔 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histone H4 (tri methyl K20) 항체 - ChIP 등급 (ab9053)</td><td>Abcam</td><td>ab9053</td><td></td></tr><tr><td>Labquake rotator</td><td>Thermo Fisher</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 플랫폼</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr></tbody></table>

carip-seq와 칩 seq: chromatin 관련 된 rnas 및 배아 줄기 세포에 단백질 dna 상호 작용을 식별 하는 방법

CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells

배아 줄기 (ES) 세포 자체 갱신 및 차별화 외부 신호 및 녹음 방송 요인, 후 레 귤 레이 터, 및 combinatorially 유전자에 영향을 주는 히스톤의 포스트 번역 수정 내장 네트워크에 의해 규율 됩니다. 근처 유전자의 표현 상태입니다. RNA도 chromatin 역학 및 유전자 발현을 조절 하는 다양 한 단백질 상호 작용을 보였다. Chromatin 관련 RNA immunoprecipitation (CARIP) 다음-세대 시퀀싱 (CARIP-Seq) 다음 RNAs chromatin 단백질, 뒤에 다음-세대 시퀀싱 (chromatin immunoprecipitation 동안과 관련 된 조사를 소설 방법입니다. ChIP-Seq) 히스톤, 녹음 방송 요인과 ES 세포에서 글로벌 규모에 epigenetic 한정자의 포스트 번역 상 수정 위치를 매핑하는 강력한 유전체학 기술입니다. 여기, 우리는 CARIP-Seq와 칩 Seq, 다음-세대 시퀀싱, 도서관 건축을 포함 하 여 ES 세포에서 글로벌 chromatin 관련 RNA 및 epigenomic 지도 생성 하기 위해 수행 하는 방법을 설명 합니다.

우리는 성공적으로 H3K4me3, H3K4me2, 및 KDM5B이 칩 Seq 프로토콜6을 사용 하 여 ES 세포에서의 게놈 넓은 바인딩 심문. ES 세포 급지대 무료 조건 (그림 1)에서 경작 그리고 십자가 위에서 설명한 대로. 쥡니다 했다 이후 칩 Seq 프로토콜의 3.2 단계에 설명 된 대로 수행 하 고 2 %agarose 젤 (그림 2)에서 DNA를 실행 하 여 평가. 다음, 칩 4 단계에 설명 된 대로 수행 하 고 라이브러리 준비는 6 단계에 설명 된 대로 수행한 합니다. 칩 Seq 라이브러리 다음-세대 시퀀싱 플랫폼에 시퀀싱 했다. 대표적인 사용자 지정 UCSC 브라우저 보기 HOXC 클러스터 (그림 3B)와 코어 pluripotency 유전자 POU5F...

여기, 우리는 칩 Seq를 수행 하는 방법을 설명 및 CARIP-Seq, 다음-세대 시퀀싱, 라이브러리 준비 등 글로벌 epigenomic 및 chromatin 관련 RNA 생성 하 ES 세포에 지도.

CARIP-Seq와 칩 Seq: Chromatin 관련 된 RNAs 및 배아 줄기 세포에 단백질 DNA 상호 작용을 식별 하는 방법

Embryonic stem (ES) cell self-renewal&#160;and differentiation is governed by extrinsic signals and intrinsic networks of transcription factors, ...

CARIP-Seq의 전반적인 목표는 게놈 전체의 염색질 관련 RNA를 조사하는 것입니다. ChIP-Seq의 목표는 배아 줄기 세포에서 전 세계적인 규모로 단백질-DNA 상호 작용을 평가하는 것입니다. 이러한 방법은 후성 유전학 및 줄기 세포 분야의 주요 질문에 답하고, 배아 줄기 세포에서 게놈 위치, 전사 인자 또는 후성유전학적 조절 인자 결합 또는 히스톤 변형 점유 또는 염색질 관련 RNA를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.이러한 기술의 주요 장점은 염색질 성분과 관련된 RNA의 게놈 전체 편향되지 않은 조사와 단백질 DNA 상호 작용의 전체 식별이 가능하다는 것입니다. 이러한 방법은 배아 줄기 세포 생물학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 암 생물학 또는 기타 인간 질병을 연구하기 위해 다른 포유류 세포 유형에도 적용할 수 있습니다. 배아 줄기 세포를 채취하려면 먼저 인산염 완충 식염수로 세포를 씻으십시오.그런 다음 섭씨 37도로 예열된 0.25% 트립신으로 세포를 분리합니다. 트립신화 후, 10%의 소 태아 혈청이 보충된 예열된 MEF 배지에 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 원뿔형 튜브의 세포에 37%포름알데히드를 최종 농도 1%까지 추가하고 섭씨 37도에서 8분 동안 배양하여 세포를 가교합니다.고정 반응을 중지하려면 섭씨 4도에서 사전 냉각된 1.25몰 글리신을 최종 농도 0.125몰에 추가합니다. 그런 다음 튜브를 회전기에 놓고 실온에서 5분 동안 분당 8회전으로 뒤집습니다. 5분 후 실온에서 5분 동안 300g의 샘플을 원심분리합니다.원심분리가 끝나면 상층액을 버립니다. 그런 다음 미리 냉각된 인산염 완충 식염수로 펠릿을 세척하고 샘플을 다시 원심분리합니다. 그런 다음 인산염 완충 식염수를 제거하고 세포를 액체 질소에 1분 동안 동결합니다.배아 줄기 세포가 얼음에서 해동되면 펠릿을 2.5ml의 초음파 처리 완충액에 재현탁시킵니다. 전사 인자 또는 후성 유전 학적 요인을 연구하려면 sodium dodecyl sulfate없이 초음파 처리 버퍼에 세포 펠렛을 재현탁시킵니다. 히스톤 변형의 경우, 나트륨 도데실 설페이트를 함유 한 완충액에 세포 펠렛을 재현탁시킵니다.다음으로, 염색질 면역침전을 위해 30초 켜짐 및 30초 휴지 모드에서 40% 진폭에서 14-18회 주기 동안 염색질을 초음파 처리합니다. 단백질 인자 ChIP에 대한 염색질을 용해시키려면 초음파 처리 버퍼에 28 마이크로 리터의 10 % sodium dodecyl sulfate를 보충하십시오. 히스톤 변형의 단백질 인자의 경우 28 마이크로 리터의 나트륨 데 옥시 콜레이트와 0.28 밀리리터의 10 % 트리톤 X-100을 넣고 잘 섞습니다.다음, 10, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 000g에 표본을 전 맑게 하기 위하여 chromatin를 원심 분리하십시오. 1.5 밀리리터의 낮은 결합 튜브에 40 마이크로 리터의 A 또는 G 마그네틱 비드를 추가합니다. 그런 다음 600마이크로리터의 인산염 완충 식염수로 비드를 세척하고 비드가 있는 튜브를 자석이 들어 있는 랙에 옮기고 실온에서 1분 동안 배양합니다.그런 다음 인산염 완충 식염수를 제거하고 인산염 완충 식염수 100마이크로리터에 비드를 다시 현탁시킵니다. 튜브에 2-4마이크로그램의 항체를 첨가하고 분당 8회전으로 40분 동안 회전자에 올려 배양하여 비드에 대한 항체 결합을 촉진합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 인산염 완충 식염수를 추가하여 비드를 세척합니다.세척 후, 초음파 처리된 염색질 추출물을 섭씨 4도의 회전체에서 하룻밤 동안 배양하여 염색질 결합 단백질을 면역침전시킵니다. 다음날 비드를 세척하고 RIPA 완충액, 소금이 함유된 RIPA 완충액, 염화리튬 완충액, Triton X-100이 함유된 Tris-EDTA 완충액 및 Tris-EDTA 완충액으로 각각 10분 동안 회전체에서 배양합니다. ChIP에 대한 비교차결합을 위해서는 100마이크로리터의 Tris-EDTA 완충액에 비드를 재현탁합니다.그런 다음 10%sodium dodecyl sulfate 3마이크로리터와 Proteinase K 1ml당 20mg당 20mg씩 5마이크로리터를 추가하고 비드를 섭씨 65도에서 밤새 배양합니다. 배양 후 다음날 튜브를 여러 번 뒤집어 마그네틱 랙에 그대로 두고 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 0.5 몰 염화나트륨을 함유 한 100 마이크로 리터의 Tris-EDTA 완충액을 첨가하여 자성 비드를 세척하고 두 개의 상층액을 결합하십시오.CARIP에 대한 비교차결합을 위해서는 100마이크로리터의 Tris-EDTA 완충액에 비드를 재현탁합니다. 그런 다음 10% 도데실황산나트륨 3마이크로리터와 1밀리리터당 20밀리그램 5마이크로리터의 프로테나제 K를 넣고 비드를 섭씨 65도에서 4-12시간 동안 배양합니다. 다시 튜브를 여러 번 뒤집고 마그네틱 랙에 올려 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.그런 다음 0.5 몰 염화나트륨을 함유 한 100 마이크로 리터의 Tris-EDTA 완충액을 첨가하여 자성 비드를 세척 한 다음 두 개의 상층액을 결합하십시오. 마지막으로, 페놀 클로로포름 이소 아밀 알코올을 사용하여 RNA 샘플을 25 대 24 대 1 부피 비율로 분리한다. 다음으로, DNase를 사용하여 염색질 관련 면역침전된 RNA 샘플에서 DNA를 제거합니다.그런 다음 CARIP 샘플에 10X DNase 완충액을 추가하고 최종 부피를 1X 농도로 조정합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 다음으로, 10.5 마이크로리터의 RNA와 1 마이크로리터의 3 마이크로그램 당 무작위 헥사머 프라이머를 첨가하여 PCR 반응을 설정하여 보상 DNA의 첫 번째 가닥을 합성합니다.2차 구조를 변성시키려면 먼저 섭씨 65도에서 튜브를 5분 동안 배양한 다음 얼음 위에서 2분 동안 배양합니다. 그런 다음 마스터 믹스를 PCR 튜브에 넣고 섭씨 25도에서 2분 동안 배양합니다. 그런 다음 위 첨자 2의 마이크로리터당 200단위의 1마이크로리터를 추가하고 thermocycler 프로그램을 실행합니다.보상적 DNA의 두 번째 가닥을 합성하려면 시약, 완충액 및 효소를 추가하여 얼음에서 반응을 설정합니다. 그런 다음 와류를 사용하여 시약을 부드럽게 혼합하고 섭씨 16도에서 2시간 동안 배양합니다. DNA가 합성된 후 PCR 정제 키트를 사용하여 보완적인 DNA를 정제합니다.그런 다음 이중 가닥 DNA를 조각 모음하고 수조 초음파 발생기와 1.5 밀리리터 튜브를 사용하여 DNA를 250-500 염기쌍 크기로 3회 10분 또는 4회 10분 동안 공유합니다. 그런 다음 라이브러리를 준비하고 차세대 염기서열분석을 수행합니다. 여기에서는 줄기 세포 군체를 시각화하기 위해 배아 줄기 세포의 위상차 이미지를 캡처했습니다.이 프로토콜에서, 세포는 세포의 분화를 방지하기 위해 배양 배지에서 LIF 및/또는 GSK3i와 함께 유사분열적으로 비활성화된 마우스 배아 섬유아세포의 존재 또는 부재 상태에서 배양되었습니다. 그런 다음, 가교 결합 배아 줄기 세포 염색질의 초음파 처리 효율을 시각화하기 위해 초음파 처리 된 이중 가닥 DNA를 2 % 아가로 젤에 적재했습니다. 겔 이미지는 200 - 500 염기쌍 범위의 전단된 염색질을 보여줍니다.다음으로, 배아 줄기 세포에서 히스톤 변형 효소 및 히스톤 변형의 게놈 전체 점유를 평가하기 위해 차세대 염기서열분석 플랫폼을 사용하여 ChIP-Seq 라이브러리를 생성하고 염기서열분석했습니다. 사용자 지정 UCSC 브라우저 보기에서 농축된 H3K4 트리메틸화, H3K4 디메틸화 및 KDM5B는 핵심 다능성 조절 유전자인 POU5F1 및 HOXC 클러스터에서 볼 수 있습니다. 배아 줄기 세포에서 염색질 관련 RNA를 평가하기 위해 CARIP-Seq 분석도 수행했습니다.사용자 정의 UCSC 브라우저 보기는 배아 줄기 세포에서 H4K20 트리메틸화 관련 RNA 및 H4K20 트리메틸화 점유를 보여줍니다. CARIP-Seq 결과에서 RNA가 H4K20 트리메틸화와 관련이 있지만 특정 유전자 자리와 상호 작용하지 않을 수 있음을 해석할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4일 안에 완료할 수 있습니다.이 동영상을 시청한 후에는 CARIP-Seq를 사용하여 염색질 관련 RNA를 조사하고 배아 줄기 세포에서 전 세계 규모로 단백질 DNA 상호 작용을 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

carip-seq-chip-seq-methods-to-identify-chromatin-associated-rnas

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

ESC의 차별은 셀 타입의 특정 구조의 변화와 염색질의 구성과 일치한다. 이러한 변화의 감지는 stemcellness 및 세포 분화를 정의하는 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공합니다. 염색질 immunoprecipitation (칩)은 줄기 세포 분화를 기본 분자 메커니즘을 해부하다하는 소중한 방법을 나타냅니다.

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

이 비디오는 in ovo electroporation으로 transfection 후 절개된 병아리 배아 척수 샘플에 대해 전체 전사체 분석을 수행하기 위한 기본 단계를 보여줍니다.

electroporation하여 병아리 배아 척수에서 차동 유전자 발현의 RNA-SEQ 분석

방법 염색질 규제 및 염색질 상태의 문제는 생체 내에서 유전자가 세포 운명 결정이 배아에서 어떻게 만들어 지는지 초기에 대한 우리의 이해의 열쇠입니다 영향을 미칩니다. 칩 서열 번호 - 글로벌 수준입니다 Xenopus의 배아 여기 설명에서 크로 마틴의 기능을 조사하기 가장 인기있는 방법.

염색질 레귤레이터 및 미국에서의 게놈 전체의 스냅 샷<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em칩 서열 번호&gt; 태아

유전자 전사의 미세 조정 규정은 배아 세포 운명 결정의 기초가. 여기서, 우리는 줄기 세포와 마우스 배아 심장 개발 모두 심장 분화의 후생 유전 학적 조절을 조사하기 위해 사용 염색질 면역 침전 분석법을 설명한다.

배아 줄기 세포와 조직의 심장 차별화의 성적인 규정

우리는 micrococcal nuclease (MNase) 융합 단백질로 게놈 전체 단백질 바인딩 사이트를 매핑하기위한 염색질 immunoprecipitation (ChIP) - 직교 방식 높은 처리량 시퀀싱 (ChEC - seq)와 결합 염색질 내생 절단을 설명합니다.

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

여기, 우리는 chromatin immunoprecipitation (칩) 및 칩 seq 라이브러리 준비 프로토콜 낮은 풍부한 닭 배아 샘플에서 글로벌 epigenomic 프로 파일 생성을 설명 합니다.

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

탠덤 chromatin 위한 단계별 프로토콜 설명 immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq) 셀 형식 관련 게놈 넓은 히스톤 수정의 분석을 가능 하 게.

TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링

게놈 전반에 걸친 단백질 결합 위치의 정확한 결정은 유전자 조절을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 외핵증 소화(ChIP-exo)를 사용한 크로마틴-면역침전DNA를 치료하는 게놈 매핑 방법을 설명하고 있으며, 이어서 고처리량 시퀀싱을 한다. 이 방법은 포유류 뉴런에서 근거리 쌍 매핑 해상도 및 높은 신호 대 잡음 비와 단백질 DNA 상호 작용을 검출합니다.

크롬 마틴 면역 침전 -엑소뉴클레아제 (ChIP-Exo)를 사용하여 마우스 줄기 세포 유래 뉴런에서 단백질 DNA 상호 작용의 고해상도 매핑

이 프로토콜은 초기 인핸서 전사체를 정량화하기 위한 간소화된 계산 파이프라인을 제공합니다. 염색질 접근성, 염색질 특징 및 전사 데이터를 통합함으로써 복잡한 유전자 내 영역에서 인핸서 활성에 대한 정확한 검출 및 가닥 특이적 분석을 가능하게 하는 동시에 광범위한 생물정보학 교육 없이도 연구자가 접근할 수 있습니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 유전자 간/유전자 내 인핸서 RNA 정량화를 위한 계산 파이프라인

여기서는 RNA 관련 염색질-DNA 상호작용을 포착하여 RNA 관련 3차원 게놈 조직을 매핑하는 프로토콜을 제시합니다.

RNA 연관 염색질 DNA-DNA 상호작용법

직접 lncRNA-단백질 상호작용을 식별하는 자외선 기반 ChIRP 방법.

LncRNA와 직접 상호작용하는 단백질을 검증 가능한 확인을 위한 자외선 기반 ChIRP 방법 - 배양된 세포부터 마우스 고환까지"

배우세요 CARIP-Seq와 ChIP-Seq를 활용하여 배아 줄기 세포에서 염색질 관련 RNA와 단백질-DNA 상호작용을 전체 게놈 규모로 분석하는 방법을. 이 기술은 후성유전학 및 줄기세포 생물학 연구에 필수적입니다.

CARIP-Seq와 칩 Seq: Chromatin 관련 된 RNAs 및 배아 줄기 세포에 단백질 DNA 상호 작용을 식별 하는 방법

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